Tối ưu phương pháp xác định adenosine trong một số thự phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Trên thế giới đã công bố một số phương pháp phân tích adenosine trên các kỹ thuật: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS… Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm)

Hà Nội – Năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân tôi đã

nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cô, gia đình và bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn TS Vũ Hồng Sơn -

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS Lê Thị Hồng Hảo - Viện Kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng toàn thể các thầy cô giáo

trong suốt thời gian học tập tại trường

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè là người

đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và chia sẻ mọi khó khăn với tôi trong suốt

quá trình học tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Lê Thị Thúy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung

thực và chưa từng được sử dụng

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báo cáo này đã

được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong báo cáo này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Lê Thị Thúy

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, thực phẩm chức năng tuy mới xuất hiện gần đây trong sự đón

nhận dè dặt của người tiêu dùng nhưng nó đã ngày càng lan rộng như một làn sóng

rộng khắp Hiện nay, đi cùng với sự phát triển kinh tế còn tồn tại những vấn nạn về

xã hội, ô nhiễm môi trường, những ám ảnh về vệ sinh an toàn thực phẩm và nỗi lo

về sức khỏe bệnh tật khiến cho sản phẩm thực phẩm chức năng trở thành hy vọng,

là cứu cánh cho mỗi người và mỗi gia đình Đặc biệt là các sản phẩm tăng cường

sức khỏe như đông trùng hạ thảo Sách y học cổ truyền của Trung Quốc coi đông

trùng hạ thảo là vị thuốc có tác dụng “Bổ phế ích can, bổ tinh điền tuỷ, chỉ huyết

hoá đàm”, “Bổ phế ích thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “Tư âm tráng dương, khư bệnh

kiện thân”; là loại thuốc “Tư bổ dược thiện”, có thể chữa được “Bách hư bách tổn”

Bên cạnh đó, các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác

định đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và

động vật Đặc điểm vượt trội của đông trùng hạ thảo là hàm lượng rất cao adenosine

trong thành phần (5,08890 mcg/g) giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt

động hiệu quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi

Adenosine là hợp chất có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá

năng lượng của cơ thể như: giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch; cải

thiện năng lực cơ bắp, giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong

máu… Vì vậy, việc bổ sung adenosine hàm lượng cao cho cơ thể là vô cùng cần

thiết giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả Tuy nhiên, điều

kiện nuôi cấy đông trùng hạ thảo khác nhau dẫn đến thành phần của nguyên liệu và

hàm lượng hoạt chất chính này cũng khác nhau

Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, các nhà sản xuất không

ngừng cải tiến công nghệ để đưa ra những dòng sản phẩm mới nhưng một vấn đề

đặt ra là chất lượng của các sản phẩm này trên thị trường như thế nào Trên thực tế,

có những sản phẩm thực phẩm chức năng công bố hàm lượng đông trùng hạ thảo rất

cao với giá bán rất đắt nhưng khi phân tích cho thấy chất lượng không đạt được như

công bố Nhiều người tiêu dùng mất tiền mà không có được tác dụng như mong

muốn Do đó, việc phát triển kỹ thuật phân tích thành phần hoạt chất chính -

adenosine trong các sản phẩm thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo là vô cùng

cần thiết Nó là công cụ giúp cho các nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng của các

sản phẩm thực phẩm chức năng nhằm đảm bảo quyền lợi cho người tiêu dùng

định adenosine trong một số thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC" với các mục tiêu sau:

liệu và sản phẩm thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo

Trên thế giới đã công bố một số phương pháp phân tích adenosine trên các

kỹ thuật: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS… Phù hợp

với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao HPLC để xác định hàm lượng adenosine trong các sản phẩm thực phẩm

chức năng đông trùng hạ thảo Phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 1.1 Đặc điểm của đông trùng hạ thảo [21, 38, 40]

Cordyceps (đông trùng hạ thảo) là một loài nấm dược liệu quý hiếm và kỳ

lạ thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes, được coi là một thần dược có giá

trị rất cao trong y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ Đó là một dạng cộng sinh

giữa một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc với sâu

non của loài Hepialus armoricanus Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus

cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh

Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh "Cord" = "chùy", "ceps" = "đầu"

Nấm có dạng giống con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi sấy khô, nó có

mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài

khoảng 4 – 11 cm, trọng lượng khoảng 0,06g do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu

non mà thành Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3–5 cm, đường kính

khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30

vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn, có 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất

Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút

Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, chất đệm nấm khá

dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà Khi nấm đạt đến độ thành thục

nhất tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu và sâu biến thành xác khô

Nấm quả thể thành thục sẽ phát tán các bào tử ra chung quanh khoảng vài cm,

nếu gặp gió có thể phát tán cao hơn Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm

qua ăn phải bào tử nấm hoặc qua các hơi thở của sâu Nấm phát triển bằng chất

dinh dưỡng của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng của sâu làm sâu chết khô

Đến mùa hè, nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất

Thời gian để nấm phát triển thành dạng quả thể kéo dài trong cơ thể sâu cả các

tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè Chỉ phát hiện được đông trùng hạ thảo vào

mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m như: Tây Tạng,

Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam của Trung Quốc

1 1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo [38, 40]

Đông trùng hạ thảo được Miles Berkeley mô tả lần đầu tiên vào năm

Pier Andrea Saccardo chuyển loài này sang chi Cordyceps Đến năm 2007, khi tiến

hành phân loại 2 họ Cordycipitaceae và Clavicipitaceae, kết quả đã tách một số chi

Cordyceps sang chi Ophiocordyceps và tạo nên một họ mới là

Ophiocordycipitaceae

thấy 60 loài Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được 2

loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link Loài

thứ hai được gọi là nhộng trùng thảo

Dưới đây là hình ảnh của một số đông trùng hạ thảo

Hình 1 1 Hình ảnh của Cordyceps sinensis

Hình 1.2 Hình ảnh của Cordyceps militaris

1.1.3 Thành phần của đông trùng hạ thảo [33, 35, 40]

Đông trùng hạ thảo là mội loài nấm rất quý hiếm và có giá trị kinh tế rất cao

bởi trong thành phần cấu tạo của nó có chứa rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học

có giá trị như: các hợp chất nucleoside, các polysaccharide, protein và các hợp

chất nitragenous, sterol, vitamin, khoáng chất

* Nucleosides [20]

gồm một số hợp chất như: guanosine, uridine, deoxyuridines,

2’3’dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine, cordycepin [3’-deoxyadenosine],

thảo Đây là hợp chất tự nhiên có giá trị dược liệu thần kỳ

Dưới đây là cấu tạo của một số nucleoside:

Hình 1.3 Cấu tạo của một số nucleoside trong đông trùng hạ thảo

Theo nghiên cứu của H.Fan và cộng sự [23] đã tiến hành phân tích để xác

định hàm lượng nucleosides của Cordyceps sinensis tự nhiên, nuôi trồng và

cordyceps militaris nuôi trồng, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các nucleoside

khác nhau ở các đông trùng hạ thảo khác nhau và địa điểm nuôi trồng khác nhau là

lệ cao hơn như: adenosine, guanosine, uridine, cordycepin Đặc biệt, trong

cordyceps sinensis tự nhiên hàm lượng adenosine cao trong khi hàm lượng của

cordycepin thấp hơn và ngược lại trong cordyceps militaris nuôi trồng Kết quả

phân tích được chỉ ra trong bảng sau:

Bảng 1.1 Hàm lượng của 13 nucleoside trong đông trùng hạ thảo

* Polysaccharides

Một số các polysaccharides và các chất dẫn xuất đường khác như là acid

hiệu quả trong việc điều tiết đường trong máu, chống di căn và hiệu quả chống

ung thư và tăng cường miễn dịch

* Proteins và các hợp chất nitragenous

Cordyceps chứa protein, peptide và 17 acid amin thiết yếu khác Ngoài

cyclo - [Leu-Pro], cyclo -[Ala-Leu], cyclo - [Ala-Val] và Cyclo - [Thr-Leu]

Khối lượng nhỏ các polyamine bao gồm 1,3 diamino propane, cadaverine,

spermidine, spermine và pustrescine đã được nhận dạng Hợp chất này được

chứng minh là có tác dụng kháng sinh

* Sterols

Một số các sterol được tìm thấy trong đông trùng hạ thảo gồm:

ergosterol, delta - 3- ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol

tình dục

* Các thành phần cấu tạo khác

Ngoài các thành phần chính ở trên trong đông trùng hạ thảo còn có chứa

một số các thành phần khác có giá trị rất cao như:

vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin

B2, vitamin E, vitamin K )

hợp chất hydrocarbon, alcohol và aldehyde Đặc biệt là hợp chất chuỗi

hydrocarbon aromatic polycylic (PAH) được sản xuất bởi Cordyceps sinensis

Đây được coi là hợp chất chuyển hóa thứ cấp Những hợp chất này phản ứng

với polypropylene được sử dụng trong các túi nuôi trồng nấm sẽ sản sinh ra các

sản phẩm phụ gây độc đối với đông trùng hạ thảo, làm chậm sự tăng trưởng và

kéo dài thời gian sinh trưởng của loài này Thậm chí những polypropelene và

sản phẩm phụ PAH sẽ giết chết các sinh vật có lợi cho sự phát triển của đông

trùng hạ thảo Vì vậy, nấm cordyceps sinensis phải được trồng trong cốc hoặc

những vật chứa đựng bằng kim loại Những hợp chất PAH này có trong môi

trường sống, nhưng là chất dễ bay hơi (không ổn định) và dễ bị mất đi nếu bị

khô

1.1.4 Tác dụng của đông trùng hạ thảo [33, 35, 40]

Đông trùng hạ thảo được coi là một thần dược quý hiếm được sử dụng khá

phổ biến trong khoảng 200 năm trước đây ở Trung Quốc và các nước ở Phương

Đông Đến năm 1976, nó đã được biết đến và sử dụng rộng rãi tại các nước phương

sinh học và những tác dụng dược liệu quý hiếm từ loài nấm này

phổi, thận, cầm máu, tan đờm, điều trị ho mãn tính, điều trị ra mồ hôi trộm và đảm

bảo phục hồi sức khỏe nhanh cho người bị bệnh và tăng cường sức đề kháng

tiểu mãn tính và bệnh gan có liên quan Thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi sử dụng

các TPCN đông trùng hạ thảo trên 33 bệnh nhân viêm gan B và 8 bệnh nhân xơ gan

test SGPT

nhân đã cải thiện được bệnh thận mãn tính khi sử dụng 1 tháng các sản phẩm từ

đông trùng hạ thảo

phân đoạn CI-P và CI-A, chiết xuất từ đông trùng hạ thảo với liều 1-10mg/kg

trọng lượng mỗi ngày cho chuột bị khối u thấy có tác rất hiệu quả với khối u

sarcoma 180 Mijuno 1999 đã nghiên cứu β-(1-3)-D-glucan, phân đoạn CO-N,

có dẫn xuất từ đông trùng hạ thảo Cordyceps ophioglossoides có tác dụng

chống lại chuỗi tế bào sarcoma 180 thường được thử nghiệm trên chuột có khối

đạt > 98%

Nhiều nghiên cứu điều trị bệnh nhân ung thư ở Trung Quốc và Nhật Bản

có sử dụng đông trùng hạ thảo thấy hiệu quả rất quả rõ ràng Trong một nghiên

cứu điều trị 50 bệnh nhân bị ung thư phổi với liều điều trị là 6g/ngày cùng với

hoá trị, khối u giảm xuống 46% Khi sử dụng sản phẩm này để điều trị các loại

ung thư khác nhau với liều 6g/ngày trong vòng hai tháng cho thấy bệnh được

cải thiện đáng kể, kiểm tra tế bào bạch cầu thấy tăng cao ở các bệnh nhân có

khối u giảm 50%

chất β -glucan làm tăng cường khả năng miễn dịch và ngăn ngừa bệnh tật của cơ

thể Nó có hai chức năng điều chỉnh tăng hoặc giảm miễn dịch Khi các bệnh

nhân bị thiếu khả năng miễn dịch, như ở bệnh nhân ung thư, viêm gan B và

HIV được sử dụng đông trùng hạ thảo hỗ trợ điều trị, kết quả cho thấy số lượng

và tác động của bạch cầu trong máu tăng Ngược lại với bệnh nhân tăng miễn

dịch quá cao như bệnh bạch cầu (lymphoma) hoặc các bệnh thấp khớp

(rheumatoid arthritis) khi dùng đông trùng hạ thảo cho thấy số lượng và tác

động của bạch cầu trong máu giảm ngược lại số lượng hồng cầu lại tăng Quá

trình này diễn biến là do các cơ chế trong các pha sản xuất máu khác nhau Các

tế bào máu tất cả được sản xuất trong tuỷ xương Chúng ra khỏi tuỷ xương đầu

tiên ở dạng chưa thành thục và sau đó xâm nhập vào các cơ quan khác trở thành

thành thục với các dạng khác nhau của tế bào máu như hồng cầu, tế bào T Khi

có mặt của đông trùng hạ thảo, nó ảnh hưởng lên các cơ chế khác nhau sản sinh

hồng cầu, bạch cầu và tế bào T Ở đây, nó trực tiếp ảnh hưởng tới quá trình

biến đổi các tế bào máu ở dạng chưa thành thục thành thành thục

Ngoài ra có một số chất khác có tác dụng ức chế miến dịch như: cyclosporin

là chất chống đối chính được sử dụng cho việc cấy ghép các bộ phận trên cơ thể

người có nguồn gốc từ các loài Cordyceps subsessilis

sinensis có khả năng giảm lượng cholesterol tổng xuổng 10-21% và triglycerid

xuống 9-26% đồng thời làm tăng hàm lượng cholesterol có tỷ trọng phân tử cao

nhân lớn tuổi bị mệt mỏi và các triệu chứng liên quan đến lão hóa sau khi sử dụng

các sản phẩm từ đông trùng hạ thảo trong 30 ngày Biểu hiện mệt mỏi của họ đã

giảm 92%, cảm giác của họ về lạnh giảm 89% và hiện tượng chóng mặt giảm 83%,

một số bệnh nhân có vấn đề hô hấp được cải thiện rõ rệt

lĩnh vực y học như: 2’3’- dideoxyadenosine (được coi là chất antiretroviruses ban

Hơn nữa, các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều

xác định đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và

động vật Liều uống đông trùng hạ thảo an toàn đối với chuột thí nghiệm là trên

45g/1kg thể trọng

Hiện nay, đã có hơn 600 công bố về đông trùng hạ thảo, con số này ngày

càng tăng do có nhiều phát hiện bí ẩn và những tác dụng dược liệu của loài nấm quý

hiếm này Với công nghệ sinh học hiện đại, người ta đã chứng minh được nhiều tác

dụng dược lý, chữa bệnh của các chất có trong đông trùng hạ thảo là hữu hiệu

Trong đó, một thành phần hoạt chất chính có vai trò quyết định đến chất lượng của

đông trùng hạ thảo là adenosine

1.2 1 Cấu tạo của adenosine [10]

phân tử hai vòng gồm một phân tử adenine liên kết với một đường ribose nhờ liên

Tên thương mại: adenocard

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của adenosine

Adenosine là một nucleoside được tạo ra do sự phá vỡ adenosine

cơ thể và hoạt động của enzymes Hầu hết các ATP bị thủy phân thành adenosine

diphosphate (ADP), sau đó nó bị dephosphoryl hóa tạo adenosine monophosphat

adenosine nhờ màng tế bào

Con đường chuyển hóa từ ATP thành adenosine trong cơ thể như sau:

Hình 1.5 Con đường chuyển hóa thành adenosine trong cơ thể

1.2.2 Tính chất của adenosine [10]

Adenosine ở dạng bột tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước và đặc biệt ít

tan trong cồn

Trong cơ thể adenosine được tạo thành do sự thủy phân AMP bởi enzyme

adenosine kinase, một phần chuyển hóa thành inosine nhờ enzyme adenosine

deaminase, sau đó chuyển hóa thành hypoxanthine nhờ enzyme nucleosidase và

là tạo thành acid uric Trong huyết tương, sự chuyển hóa thành inosine và

hypoxanthin xảy ra rất nhanh Thời gian bán hủy của adenosine trong invitro và

invivo khoảng vài giây Trong nội bào adenosine được tạo ra trong các nơron thần

kinh và các tế thần kinh đệm của hệ thống miễn dịch

Adenosine được chứng minh là chất đối kháng cạnh tranh với

methylxanthine như cafein và theophyllin với cơ chế tác động như sau: Adenosine

được tạo ra trong quá trình hoạt động của cơ thể Khi nồng độ đủ cao nó sẽ gắn với

recceptor (thụ thể) làm cho hệ thần kinh phát ra tín hiệu nghỉ ngơi dấn đến sự mệt

mỏi và gây ra buồn ngủ Do có cấu trúc phân tử gần giống với cafein nên cafein

cạnh tranh với adenosine trong việc liên kết với receptor đặc hiệu Điều này làm cho

hệ thần kinh sẽ chỉ đạo cho cơ thể phát ra tín hiệu làm việc thay cho nghỉ ngơi

Một số tác giả [28] đã nghiên cứu và chỉ ra rằng adenosine làm tăng nồng độ

của cAMP nội bào trong não chuột, những lập luận này cho rằng thụ thể adenosine

tồn tại trong hệ thống thần kinh trung ương (CNS) và hàm lượng adenosine trong

dịch não tủy lớn hơn trong huyết tương và nó có khả năng vượt qua hàng rào máu

1.2.3 Tác dụng dược lý của adenosine

Adenosine là một nucleoside nội sinh ảnh hưởng nhiều quá trình sinh lý của

năng lượng của tế bào và giữa các phản ứng xảy ra trong cơ thể ADP là một

co-enzyme gồm một phân tử adenosine và 2 phân tử acid phosphoric, là một chất trung

gian quan trọng trong sự chuyển hóa của tế bào AMP còn được gọi là adenyclic

acid: là este phosphoric của adenosine

não nói riêng, adenosine tạo ra bởi tế bào nội mô đi vào trong kẽ không gian của tế

cáo rằng có thể adenosine được tạo thành do sự tách ra của các tế bào thần kinh cuối

hoặc các tế bào thần kinh đệm [19], [28]

bao hàm những thụ thể màng sinh chất có khả năng cảm nhận được các phân tử bên

hợp cho tế bào) Nó được giải phóng ra khỏi tế bào và tồn tại ở ngoại bào Sau đó,

cấu trúc bề mặt tế bào đặc biệt nhận ra nó và có khả năng tiếp nhận thông tin hoặc

vật thể của một đối tượng cụ thể nào đó gọi là receptor (thụ thể) adenosine Có 4

loại thụ thể adenosine là A 1, A 2A , A2B and A 3 Trong đó, thụ thể A 1 bắt cặp với

trong cơ thể như:

Adenosine được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể

thiếu máu cục bộ), nồng độ này được nhanh chóng nâng 600-1,200 nM Vì vậy,

chức năng chính của adenosine chủ yếu là ngăn ngừa tổn thương mô trong trường

não

* Tác dụng lên tim [10]

cực mạnh làm thay đổi lưu lượng máu, là tác nhân gây giãn động mạch vành, đồng

thời nó có khả năng bảo vệ tim trong việc chống lại một số chuyển hóa có hại cho

sức khỏe bằng cách giảm sự trao đổi chất tại cơ tim và tăng lưu lượng máu ở động

mạch vành thông qua 2 cơ chế khác nhau:

dụng ức chế trực tiếp lên chức năng của tế bào nhu mô chứng minh bằng hiệu lực

co bóp của tế bào cơ tim

môi trường thuận lợi hơn cho các tế bào nhu mô, duy trì tính nguyên vẹn của các

mô bằng cách điều chế chức năng của hệ thống miễn dịch

loạn nhịp tim với cơ chế tác động như sau: Adenosine là chất chủ vận purin, tác

truyền qua nút nhĩ thất và làm mất nhịp nhanh kịch phát trên thất do mạch vào lại ở

nút nhĩ thất Tác dụng dược lý của thuốc gồm giãn mạch vành, giãn mạch ngoại

biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất Trong nhịp

nhanh trên thất, nhịp xoang phục hồi ở 85 - 95% người bệnh Thuốc cũng có ích

trong nghiên cứu điện sinh lý học để xác định vị trí của blốc nhĩ thất

* Tác dụng lên phổi [10]

Một số nghiên cứu chứng minh rằng adenosine có khả năng điều chỉnh chức

năng của nhiều tế bào khác nhau liên quan viêm đường hô hấp như bạch cầu trung

tính, bạch cầu ái toan, tế bào lympho và đại thực bào Hơn nữa, thụ thể adenosine

điều trị các bệnh viêm nhiễm và hen suyễn mãn tính

* Tác dụng lên hệ thống thần kinh trung ương [32]

não vì adenosine có mặt ở các dịch lỏng trong cơ thể và trong không gian kẽ, đặc

biệt nó tham gia nhiều vào quá trình chuyển hóa của cơ thể, vì vậy nó có ảnh hưởng

lớn đến các rối loạn thần kinh như: thiếu não cục bộ, động kinh, các bệnh thoái hóa

thần kinh và đau dây thần kinh Vì vậy, adenosine đã được sử dụng nhiều trong y

học để nghiên cứu sản xuất một số loại thuốc mới dùng để điều trị một số bệnh liên

quan đến hệ thống thần kinh

* Tác dụng lên tóc [10]

Adenosine được chứng mính có khả năng kích thích sự phát triển của tóc ở

những người có tóc thưa

Với những tác dụng như trên mà adenosine được coi là thành phần hoạt chất

Trên thế giới, việc xác định hàm lượng adenosine trong TPCN nói chung và

nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định hợp chất này bằng nhiều phương pháp

khác nhau trên các đối tượng như nguyên liệu đông trùng hạ thảo, mẫu TPCN, sữa

nghiệm

1.3.1 P hương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển

qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được

chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và

được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi

đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định cho từng chất cần

thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác

nhau Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự tách có thể là

cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha

động

được phân tích sử dụng bản mỏng silica GF 254 sử dụng 1% CMC-Na, dung môi

gồm chloroform-ethylacetate-isopropanol-water-ammonia(8∶2∶6∶0.5∶0.12), được

phát hiện tại 2 bước sóng 254 nm và và 300nm Phương pháp rất đơn giản với độ

lệch chuẩn tương đối trong khoảng 0,73-0,98% với độ thu hồi cao từ 95.270% -

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không

ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa

đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh độ điện di của các ion khác

nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Một phương pháp rất đơn giản được ứng dụng để xác định các thành phần

hoạt tính sinh học trong đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản đã

được công bố bởi một số tác giả Yang Gengliang, Li Hai Ying và một số cộng sự

thuộc trường cao đẳng hóa học và khoa học môi trường thuộc đại học Hà

Bắc-Trung Quốc [39] Trong đó, adenosine, adenin, uridine đã được tách và phân tích

định lượng sử dụng dung dịch đệm dinatritetraborate 15 mM/L và

điện thế 18kV và detector bước sóng 254 nm Hệ số tương quan của phương pháp r

≥ 0,9985

adenosine, hypoxanthine, guanosine, inosine, 2-deoxyuridine, uridine and

thymidine) trong một số loài đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi trồng khác nhau

bằng phương pháp điện di mao quản gắn khối phổ (CE-MS) Theo đó, mẫu được

trong 30 phút, sau đó dịch chiết sẽ được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng, lọc qua

như sau: pha động gồm đệm formic 10mM chứa 10% methanol, với tốc độ dòng 3

cho thấy: hàm lượng nucleosides và nucleobases trong cordyceps sinensis là (9138

hypoxanthin và inosine, hàm lượng cordycepin trong cordyceps militaris cao và hầu

như không phát hiện trong một số loại nấm đông trùng hạ thảo khác

Phương pháp này với ưu điểm tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể

phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính

ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm Do đó, việc

tiến hành thực nghiệm yêu cầu kỹ thuật phân tích chuẩn xác trong các điều kiện

khắt khe

1 3.3 Phương pháp sắc ký lỏng

1 3.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay Sau

khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion

hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các

gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín

hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh

ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion,

người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Tác giả Lan-Fang Huang và cộng sự [24] đã tiến hành tách và xác định thành

phần hoạt tính của Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris gồm adenin,

hypoxanthin, adenosine, và cordycepin và các sản phẩm chuyển hóa của nó bằng

phương pháp khối phổ LC/ESI -MS Sử dụng nội chuẩn là 2- chloroadenosine, sử

252, 302 để phân tích định lượng cho 4 thành phần hoạt chất trên, đường chuẩn

được xây dựng cho adenin 1,4 -140 μg/ml, 0,6 - 117,5 μg/ml hypoxanthine, 0,5 -

và giới hạn định lượng cho adenin là 0,5 - 1,4 μg/ml, 0,2 và 0,6 μg/ml cho

Cũng theo tác giả Fang - Qiu Guo và cộng sự [14] tiến hành phân tích và xác

định nucleosides trong Cordyceps sinensis và sản phẩm chuyển hóa của nó bằng

siêu âm 2h, lọc và thổi khô, cặn được hòa bằng MeOH và đem phân tích trên hệ

thống LC-MS, sử dụng pha động gồm amonium acetate 40 mM; pH 5,2 và kênh B

chọn lọc ion m/z là 113, 137, 245, 127, 152, 136, 268, 252 và 302, với chế độ quét

độ đúng và độ chính xác của phương pháp trong khoảng 1,5 - 5,3% và -3,5 - 5,0%

Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp là 0,1 - 0,6 μg/ml và 0,5 -2,0

μg/ml, độ thu hồi của phương pháp 92,0 -107%

Một phương pháp xác định nucleosides, nucleosibases và sản phẩm chuyển

hóa của chúng trong đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi trồng bằng phương pháp

chiết áp suất lỏng và sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao gắn khối phố

ASE 200 của hãng (Dionex, Sunnyvale,CA,USA), mẫu được cân khoảng 0,5g , sau

đó trộn cùng với diatomaceous với tỷ lệ 1: 2 và đặt trong một lõi thép 11ml, sử dụng

áp suất chiết 1,034 x 104 KPa, dịch chiết được thổi khô và tiến hành rung siêu âm 5

phút và hòa cặn với 5ml amonium acetate 5mM ở nhiệt độ phòng , sau đó dịch chiết

được định mức vào bình 10 ml với amonium acetate và sử dụng 2 -deoxyuridine

UV tại bước sóng 254 nm để phân tích định lượng dùng chế độ SRM và chế độ

áp suất 40 psi, và thế điện cực là 4,5 kV Phương pháp có khoảng tuyến tính, độ

chọn lọc, độ đúng và độ thu hồi và thời gian phân tích ngắn

Tuy nhiên, với phương pháp chiết mẫu rất phức tạp và thiết bị phân tích hiện

đại, chi phí lớn nên khó áp dụng

1.3.3.2 P hương pháp sắc ký lỏng tạo cặp ion (IP-RP-LC–MS)

Tác giả F.Q.Yang và cộng sự [16] tiến hành xác định nucleotide, nucleoside

gồm uridine-5'-monophosphat (UMP), adenosine-5-monophosphat (AMP),

phổ, trong đó sử dụng acid pentadecafluarooctanoic (PDFOA) 0,25 mM làm chất

khối phổ gồm thiết bị phun điện tử ESI, với chế độ ion dương MS và phát hiện bởi

chế độ MS/MS, phổ khối được quét m/z 50 -800, chế độ chọn ion (SRM) và lọc ion

40psi, điện áp mao mạch 4,5 kV Mẫu đông trùng hạ thảo được cân và thêm 10 ml

lọc và định mức với tỷ lệ 9:1 với nội chuẩn 5-chlorocytosine arabinoside 0,1mg/mL,

sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

của phương pháp thấp với LOD và LOQ tương ứng của 16 thành phần là 0,16 và

Tác giả Pilar Vinas và cộng sự [31] thuộc trường đại học Murcia - Thụy Sỹ

đã nghiên cứu xác định nucleosides trong thực phẩm bổ sung cho trẻ em bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo cặp ion với detector mảng diod gắn với

khối phổ thời gian bay dùng chế độ ion hóa áp suất khí quyển Sử dụng pha động

tách được thực hiện trên cột C18 Gemini-NX (150mm×4.6mm ×5μm), tốc độ dòng

dòng khí 11 lit/phút và áp suất khí 58 psi Mẫu được kết tủa với acid trichloacetic

dung dịch được lọc qua màng và tiêm vào hệ thống để phân tích Phương pháp được

ứng dụng để phân tích các nucleosides trong các mẫu thực phẩm dành cho trẻ em

với độ lặp lại và độ thu hồi cao

Đây là phương pháp thường được ứng dụng để tách nhiều chất có tính chất

tương tự nhau, tuy nhiên, phương pháp yêu cầu nồng độ của chất tạo cặp cao (5 -20

mM) làm giảm độ nhạy và độ chọn lọc của tín hiệu chất phân tích Hơn nữa, các

thiết bị phức tạp, đắt tiền và không phải phòng thí nghiệm nào cũng có điều kiện để

thực hiện phương pháp này

1.3.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC)

Tác giả F.Q Yang, J Guan, S.P Li [17] tiến hành xác định nhanh và đồng

thời 14 nucleosides và nucleobases gồm ( adenine, adenosine, cytosine, cytidine,

uracil, uridine, guanine, guanosine, hypoxanthin, inosine, thymine, thymidine,

2'-deoxyuridine and cordycepin) có trong đông trùng hạ thảo nuôi trồng sử dụng

phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng Trong đó, sử dụng hệ thống UPLC

gradient gồm acid acetic 0,5M và ACN Mẫu được chiết sử dụng hệ thống Dionex

ASE 200 Mẫu được trộn với diatomaceous với tỷ lệ 1: 1, để trong lõi thép 1 lít và

LOQ tương ứng nhỏ hơn 11,9 và 47,0 ng/ml với thể tích tiêm mẫu 1 μl Độ lệch

chuẩn tương đối của cả 14 nucleosides này đều nhỏ hơn 1,8% Phương pháp rất phù

hợp để phân tích 14 nucleosides và nucleobases trong đông trùng hạ thảo nuôi trồng

và có thể ứng dụng để phân tích nhanh các sản phẩm dược phẩm và dịch sinh học

Đây là một phương pháp hiện đại được sử dụng có hiệu suất cao, độ phân

giải và độ nhạy cảm cao, tiết kiệm dung môi Tuy nhiên, chi phí cho thiết bị rất lớn,

quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biến cho các phòng thí tại Việt Nam nên việc

ứng dụng khó khăn

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp này rất phù hợp cho việc xác định adenosine trong thực phẩm

ở nhiều phòng thí nghiệm Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương

pháp này để xác định adenosine

định một số nucleosides gồm: adenosine, cordycepin và Ergosterol trong nấm

Antrodia camphorata nuôi trồng bằng phương pháp HPLC Theo đó, mẫu được

10 phút Phần dịch trong được lọc qua màng 0,45 μm và được tiêm vào hệ thống

HPLC với điều kiện phân tích: cột C18 (250mm x 4.0mm x 5μm) với pha động

trình rửa giải gradient như sau:

Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B % Kênh C % Kênh D

Nhóm tác giả Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and

của loài Cordyceps Mẫu được đồng nhất, sau đó, cân chính xác 1 g vào ống ly tâm

lọc qua màng 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC, sử dụng cột pha ngược

này được tiêm 5 lần với các thể tích khác nhau để xây dựng đường chuẩn Điều kiện

trình isocratic với tốc độ dòng 1 ml/phút Bước sóng phát hiện được cài đặt ở 210 -

xây dựng ở nồng độ 2,5- 120 μg/ml, LOD = 0,25 μg/ml

Cũng theo nhóm tác giả Lichen và cộng sự [27] đã tiến hành xác định nhanh

260 nm Phương pháp có độ tin cậy cao với độ thu hồi trong khoảng từ 93,8 -

phương pháp tương ứng với adenosine và cordycepin là 0,21 và 0,083mg/lít

Phương pháp đơn giản, nhanh, độ chính xác cao và giá thành thấp

Tác giả Xiao Feng Xue, Jin Hui Zhou, Li Ming Wu, Liang Hu Fu, Jing Zhao

sử dụng cột sắc ký C18 (Waters symmetry) và chương trình rửa giải gradient với

hỗn hợp 2 dung môi kênh A là acid phosphoric 0,4% và kênh B là MeOH Xác định

tại bước sóng 257nm Độ thu hồi trong khoảng 91,6- 98,3% với RSD% < 5,3 %

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng là 0,017 và

0,048μg/ml Phương pháp được ứng dụng để phân tích hàm lượng adenosine trong

45 sản phẩm sữa ong chúa với hàm lượng adenosine trong khoảng từ 5,9 - 2057,4

mg/kg

Theo dược điển Trung Quốc, adenosine được chiết tách từ nguồn nguyên

liệu đông trùng hạ thảo như sau: Mẫu được cân chính xác 0,5g cho vào bình cô

đun hồi lưu trong 30 phút, sau đó, làm nguội, cân và thêm methanol 90% đến lượng

chính xác, lắc đều, lọc, chạy sắc ký với điều kiện như sau: pha động đệm

17:3, cột với pha tĩnh octandecylsilane phát hiện tại bước sóng 260 nm Xác định

hàm lượng adenosine ≥ 0,01% trong nền nguyên liệu đông trùng hạ thảo

Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định nucleoside nói chung và

adenosine nói riêng Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng

phương pháp HPLC với detector PDA để phân tích hoạt chất adenosine trong TPCN

đông trùng hạ thảo

Đây là phương pháp có tốc độ tách nhanh, độ chọn lọc và độ nhạy cao, có

thể tự động hoá phân tích hàng loạt mẫu và phân tích đồng thời nhiều chất có trong

mẫu Vì thế nó rất thuận lợi cho việc tách và xác định adenosine trong việc điều tra

và nghiên cứu với số lượng lớn

Mặt khác, HPLC là phương pháp hiện đại, đang phát triển mạnh và được ứng

dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm phân tích của các nước tiên tiến trên thế

giới cũng như ở các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

1.4.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc

chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tích

được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất

phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất

phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả

năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với

tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

* Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt

rất nhỏ, từ 3-7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng

pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha

đảo (RP-HPLC)

trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất

đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều

trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

* P ha động trong sắc ký lỏng

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân

tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

có độ phân cực thấp

+ Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các

chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được

dùng trong sắc ký pha ngược

+ Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, pentan,

Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi

không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi

để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích

Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này

người ta gọi là gradient pha động

* Detector trong sắc ký

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ

thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

huỳnh quang Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất

hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân

tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến, như detector PDA,

MS, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích nhờ vào phổ hấp thụ

hoặc mảnh phổ đặc trưng với từng chất phân tích

* Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm

3 phần chính:

phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1 4.2 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC [ 2, 5, 6]

1.4.2.1 Thời gian lưu (t R )

Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong

một khoảng thời gian nhất định Đó chính là thời gian lưu của nó, tính từ lúc mẫu

được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ

cực đại

tRi = to + t’Ri

1.4.2.2 Hệ số đối xứng pic

Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký (xem có kéo đầu hay kéo đuôi

A

B

S = A: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía

trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic

B: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng cong phía

sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic

2+

−

R

Trong đó:

Theo qui luật phân bố của Gaoxo và Rayley, điều kiện tối thiểu để cho 2 chất

A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trí cực đại của B, và

để tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phía sau B phải kề với cực tiểu phía

Khi R = 1, hai chất A và B mới tách khỏi nhau đạt 95% nghĩa là còn 2,5%

của A trong B và 2,5% B trong A Khi R = 1,5 thì 2 chất A và B tách khỏi nhau đạt

99,8% tức là còn 0,1% A trong B và ngược lại

1.4.3 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [ 1, 7]

* Phân tích định tính

trong dung dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp

Hình 1.7 : Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký

* Phân tích định lượng

Trong HPLC có thể dùng một trong hai phương pháp là phương pháp đường chuẩn

hoặc phương pháp thêm chuẩn để định lượng Việc dùng phương pháp nào trong hai

phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích

Trong nghiên cứu này chúng tối đã sử dụng phương pháp đường chuẩn để

xác định chất phân tích Phương pháp này có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt

mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm Tuy nhiên khi thành phần

mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về

thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn Trong trường hợp

này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm chuẩn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIEN CỨU

dạng viên nang mềm, viên nang cứng, viên nén, dạng lỏng

2.2.1 Hóa chất

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

* Chất chuẩn

- Methanol (Merck 99,9%) - MeOH

- n-hexan (Merck 99,9%)

- Ethanol (Merck 99,9%) -EtOH

- Dietyl ete (Merck 99,9%)

- Petroleum ete (Merck 99,9%)

đó rung siêu âm

2.2.2 Thi ết bị

- Máy lắc vortex VELP

- Máy ly tâm Hermle

hợp chất phân cực Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định

adenosine trong thực phẩm như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp điện

di mao quản, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao HPLC Tuy nhiên, nếu sử dụng phương pháp điện di mao quản độ nhạy

của phương pháp và thời gian không ổn định, thiết bị không phổ biến cho các phòng

thí nghiệm nên khó áp dụng Nếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp

detector khối phổ thì trang thiết bị đắt tiền, chi phí khấu hao lớn, yêu cầu kỹ thuật

Việt Nam Do vậy, để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi đã lựa

chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định adenosine trong TPCN

đông trùng hạ thảo Đây là phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng

dụng rộng rãi

ra khỏi nền mẫu, tiến hành rung siêu âm, ly tâm Dịch chiết được gộp vào bình định

mức 50 ml, lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA

với quy trình phân tích mẫu dự kiến như sau:

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến

* Tóm tắt quy trình phân tích mẫu

Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút

Lọc

Mẫu đã loại chất béo

+ Dung môi chiết

Rung siêu âm (nhiệt độ, thời gian)

+ Dung môi chiết

+ Dung môi chiết

Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml

- Cân mẫu vào ống ly tâm, với nền mẫu chứa nhiều chất béo (loại chất béo trước khi

phân tích)

Theo quy định của USFDA, AOAC, USP các thông số cần thẩm định bao

gồm các yếu tố chính sau:

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào: Kỹ thuật áp dụng, yêu

cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm, trong phạm vi

và thời gian nghiên cứu, chúng tôi thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương

chọn lọc, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu suất

thu hồi), độ chụm (thông qua độ lặp lại)

2.4.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa

giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ chất phân

tích có mặt trong nền mẫu

Để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 15 nồng độ khác nhau, thực

hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín

hiệu vào nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ và quan sát sự

phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ

thuộc vào nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và

kỹ thuật sử dụng

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định

ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn

bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao

nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ

thuật khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường

chuẩn với chuẩn tinh khiết

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương

ứng với nồng độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn

là một phương trình đường thẳng: y = ax + b

Trong đó: a là giá trị độ dốc slope

b là giá trị hệ số chặn intercept

Hình 2.2 Đồ thị tương quan giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích

* Các lưu ý khi xây dựng đường chuẩn

đúng đắn của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn

mắc những sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất chính xác của kết quả Để kiểm soát được

nồng độ chuẩn, điều đầu tiên là kiểm soát được chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà

sản xuất) về hàm lượng, độ tinh khiết, hạn sử dụng Trong quá trình chuẩn bị chuẩn

để xây dựng đường chuẩn, cần tiến hành cẩn thận, chính xác

có độ chọn lọc, không bị lẫn tạp, đồng thời độ ổn định của thiết bị cao

thô (ngẫu nhiên) xuất hiện trong phân tích dẫn đến việc đường chuẩn xây dựng

không đáp ứng yêu cầu Trong trường hợp này, có thể cân nhắc loại trừ những điểm

này để đảm bảo sự chính xác

* Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn

đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các

điểm chuẩn sử dụng xây dựng đường chuẩn, tính giá trị độ chệch theo công thức :

=

C

C C c

c

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

Theo quy định của các tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị độ chệch

không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOD có thể

chấp nhận giới hạn ±20%

2.4.2 Tính đặc hiệu và chọn lọc [8]

tạp chất khác như tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự tạp chất…

Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương

tính khi có mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt chất phân tích mà có

mặt các tạp chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích

định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh

hưởng của tất cả các yếu tố khác nhằm hướng tới kết quả chính xác nhất

Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích

một số hoặc nhiều chất trong chung một quy trình Nếu chất cần phân tích xác định

rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Như vậy, tính chọn

lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu do các phương pháp phân tích thường có nhiều

chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

Tính đặc hiệu trong sắc ký lỏng có thể đạt được thông qua việc lựa chọn cột

tối ưu, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng Bên cạnh đó, giai đoạn xử

lý mẫu cũng phải tối ưu để đạt được tính chọn lọc cao nhất Trong sắc ký, cần xác

định píc sắc ký có phải là píc đơn hay có lẫn tạp chất khác Đối với hệ thống HPLC

có sử dụng detector PDA có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh

khiết píc (peak purity)

tại ba điểm khác nhau trên píc sắc ký gồm: đỉnh píc (top) và hai điểm về hai bên

sườn của píc (upslope và downslope) Thông thường chọn hai điểm tại 2/3 độ rộng

của píc về hai phía

Píc có độ chọn lọc càng cao khi độ tinh khiết píc càng gần 1 Độ tinh khiết

của píc có thể chấp nhận được khi peak purity = 0,99

2.4.3 Xác định độ lặp lại [8]

Độ lặp lại (độ chụm) thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo so với giá trị

trung bình, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân

tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch

chuẩn tương đối RSD %

độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính

toán liên quan như sau:

Giá trị trung bình

n

i x

xn

hướng của giá trị trung tâm (giá trị thực)

SD nói lên mức độ dao động của các kết

thể hiện sự sai lệch phân tán của một dãy kết quả thí nghiệm so với giá trị trung bình của nó

Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

% 100

tb x

SD RSD

Biểu thị sự biến động, phân tán của các kết quả thí nghiệm

thì RSD (%) tính được phải nhỏ hơn hoặc bằng RSD (%) cho phép

thường so sánh RSD (%) tính được so với RSD (%) cho phép ở nồng độ chất tương

ứng theo AOAC (phụ lục A1) RSD (%) tính được không được lớn hơn trị giá trong

bảng ở hàm lượng chất tương ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích

Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là

2.4.4 Xác định độ đúng (độ thu hồi) [8]

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị

trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là

đúng (μ)

Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác,

tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là

giá trị đúng)

Có nhiều cách tính độ đúng như cách dùng so sánh với phương pháp chuẩn,

tính độ thu hồi, sử dụng vật liệu chuẩn trong nghiên cứu này chúng tôi xác định

độ đúng thông qua việc xác định độ thu hồi

chuẩn Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ

của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu

hồi (R%) được tính như sau:

%100)(

c

m c m

C

C C

R

Sau khi tính độ thu hồi, so sánh kết quả tính được với quy định của AOAC

(phụ lục A2) Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau Thông

thường độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng cho phép của AOAC ở nồng độ

chất tương ứng

2.4.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [8]

* Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu

cho độ nhạy của phương pháp Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện nhỏ

- Cách xác định LOD của phương pháp:

Thêm chuẩn ở nồng độ thấp trên nền mẫu thực không phát hiện chất phân

độ thấp có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Với mỗi nền mẫu tiến hành

phân tích lặp lại 2 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise

ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

Hàm lượng chất phân tích được nhân với giá trị độ thu hồi cao nhất tương ứng với

từng nền mẫu Từ đó, xác định được LOD hiệu chỉnh của phương pháp phân tích

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu

đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

Hình 2.3 Xác định LOD bằng cách tính S/N

* Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà tại đó ta có thể

định lượng được bằng phương pháp phân tích và cho kết quả có độ chính xác mong

muốn

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ phụ thuộc vào

từng phương pháp, kỹ thuật và điều kiện trang thiết bị cụ thể mà lựa chọn phương

pháp xác định, tính toán cho phù hợp

và nhiễu đường nền LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10) Do đó,

có thế tính LOQ từ LOD theo công thức:

LOQ = 10/3 * LOD = 3,33 * LOD