Tối ưu phương pháp xác định adenosine trong một số thự phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Họ tên tác giả luận văn Lê Thị Thúy TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm) Hà Nội – Năm 2014 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực, cố gắng thân nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cám ơn TS Vũ Hồng Sơn Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Lê Thị Hồng Hảo - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia giao đề tài, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo khoa Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm tồn thể thầy giáo trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người giúp đỡ dẫn dắt suốt thời gian học tập trường Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người bên cạnh động viên, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt trình học tập Hà Nội, ngày tháng Học viên Lê Thị Thúy năm 2014 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực báo cáo cảm ơn thơng tin trích dẫn báo cáo ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Học viên Lê Thị Thúy năm 2014 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, thực phẩm chức xuất gần đón nhận dè dặt người tiêu dùng ngày lan rộng sóng rộng khắp Hiện nay, với phát triển kinh tế tồn vấn nạn xã hội, ô nhiễm môi trường, ám ảnh vệ sinh an toàn thực phẩm nỗi lo sức khỏe bệnh tật khiến cho sản phẩm thực phẩm chức trở thành hy vọng, cứu cánh cho người gia đình Đặc biệt sản phẩm tăng cường sức khỏe đông trùng hạ thảo Sách y học cổ truyền Trung Quốc coi đơng trùng hạ thảo vị thuốc có tác dụng “Bổ phế ích can, bổ tinh điền tuỷ, huyết hố đàm”, “Bổ phế ích thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “Tư âm tráng dương, khư bệnh kiện thân”; loại thuốc “Tư bổ dược thiện”, chữa “Bách hư bách tổn” Bên cạnh đó, nghiên cứu cổ truyền thực nghiệm đại xác định đơng trùng hạ thảo khơng có tác dụng phụ thể người động vật Đặc điểm vượt trội đông trùng hạ thảo hàm lượng cao adenosine thành phần (5,08890 mcg/g) giúp thể dồi lượng để hoạt động hiệu nhanh chóng xố triệu chứng mệt mỏi Adenosine hợp chất có vai trị quan trọng q trình chuyển hố lượng thể như: giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên tim mạch; cải thiện lực bắp, giảm sinh trưởng tế bào xấu, tăng lượng oxy máu… Vì vậy, việc bổ sung adenosine hàm lượng cao cho thể vô cần thiết giúp thể dồi lượng để hoạt động hiệu Tuy nhiên, điều kiện nuôi cấy đông trùng hạ thảo khác dẫn đến thành phần nguyên liệu hàm lượng hoạt chất khác Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng, nhà sản xuất không ngừng cải tiến công nghệ để đưa dòng sản phẩm vấn đề đặt chất lượng sản phẩm thị trường Trên thực tế, có sản phẩm thực phẩm chức công bố hàm lượng đông trùng hạ thảo cao với giá bán đắt phân tích cho thấy chất lượng không đạt công bố Nhiều người tiêu dùng tiền mà khơng có tác dụng mong Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy muốn Do đó, việc phát triển kỹ thuật phân tích thành phần hoạt chất adenosine sản phẩm thực phẩm chức đông trùng hạ thảo vơ cần thiết Nó cơng cụ giúp cho nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng sản phẩm thực phẩm chức nhằm đảm bảo quyền lợi cho người tiêu dùng Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Tối ưu phương pháp xác định adenosine số thực phẩm chức đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC" với mục tiêu sau: - Tối ưu phương pháp định tính định lượng adenosine nguyên liệu thực phẩm chức đông trùng hạ thảo - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng adenosine số nguyên liệu sản phẩm thực phẩm chức đông trùng hạ thảo Trên giới công bố số phương pháp phân tích adenosine kỹ thuật: sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS… Phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC để xác định hàm lượng adenosine sản phẩm thực phẩm chức đông trùng hạ thảo Phương pháp có độ nhạy độ xác cao Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung đông trùng hạ thảo 1.1.1 Đặc điểm đông trùng hạ thảo [21, 38, 40] Cordyceps (đơng trùng hạ thảo) lồi nấm dược liệu quý kỳ lạ thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes, coi thần dược có giá trị cao y học Trung Quốc nhiều kỷ Đó dạng cộng sinh lồi nấm túi có tên khoa học Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc với sâu non (ấu trùng) lồi trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp sâu non lồi Hepialus armoricanus Ngồi cịn 40 lồi khác thuộc chi Hepialus bị Cordyceps sinensis ký sinh Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh "Cord" = "chùy", "ceps" = "đầu" Nấm có dạng giống sâu, với đuôi cành nhỏ, mọc Khi sấy khô, có mùi cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng – 11 cm, trọng lượng khoảng 0,06g sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống tằm, dài chừng 3–5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngồi có màu vàng sẫm nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía gần đầu nhỏ hơn, có cặp chân, đôi rõ Chất đệm nấm hình que cong mọc từ sâu non, dài sâu non chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên căng đầy, màu trắng vàng, chất đệm nấm dai bên ruột rỗng, có màu trắng ngà Khi nấm đạt đến độ thành thục tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu sâu biến thành xác khô Nấm thể thành thục phát tán bào tử chung quanh khoảng vài cm, gặp gió phát tán cao Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm qua ăn phải bào tử nấm qua thở sâu Nấm phát triển chất dinh dưỡng sâu, sử dụng hết chất dinh dưỡng sâu làm sâu chết khô Đến mùa hè, nấm phát triển thành mọc từ đầu sâu vươn khỏi mặt đất Thời gian để nấm phát triển thành dạng thể kéo dài thể sâu tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè Chỉ phát đông trùng hạ thảo vào Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy mùa hè số cao nguyên cao mặt biển từ 3500 đến 5000m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam Trung Quốc 1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo [38, 40] Đông trùng hạ thảo Miles Berkeley mô tả lần vào năm 1843 với tên gọi Sphaeria sinensis Đến năm 1878, nghiên cứu loài Pier Andrea Saccardo chuyển loài sang chi Cordyceps Đến năm 2007, tiến hành phân loại họ Cordycipitaceae Clavicipitaceae, kết tách số chi Cordyceps sang chi Ophiocordyceps tạo nên họ Ophiocordycipitaceae Chi nấm Cordyceps có tới 350 lồi khác nhau, riêng Trung Quốc tìm thấy 60 lồi Tuy nhiên người ta nghiên cứu nhiều loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link Loài thứ hai gọi nhộng trùng thảo Dưới hình ảnh số đơng trùng hạ thảo Hình 1.1 Hình ảnh Cordyceps sinensis Hình 1.2 Hình ảnh Cordyceps militaris Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy 1.1.3 Thành phần đông trùng hạ thảo [33, 35, 40] Đơng trùng hạ thảo mội lồi nấm quý có giá trị kinh tế cao thành phần cấu tạo có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị như: hợp chất nucleoside, polysaccharide, protein hợp chất nitragenous, sterol, vitamin, khoáng chất * Nucleosides [20] Đây thành phần có giá trị đặc biệt đông trùng hạ thảo, gồm số hợp chất như: guanosine, uridine, deoxyuridines, 2’3’dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine, cordycepin [3’-deoxyadenosine], cordycepin triphosphate, guanidine, deoxyguanidine Trong đó, adenosine nucleoside có hoạt chất sinh học để đánh giá chất lượng đông trùng hạ thảo Đây hợp chất tự nhiên có giá trị dược liệu thần kỳ Dưới cấu tạo số nucleoside: Hình 1.3 Cấu tạo số nucleoside đông trùng hạ thảo Theo nghiên cứu H.Fan cộng [23] tiến hành phân tích để xác định hàm lượng nucleosides Cordyceps sinensis tự nhiên, nuôi trồng Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy cordyceps militaris ni trồng, kết phân tích cho thấy hàm lượng nucleoside khác đông trùng hạ thảo khác địa điểm nuôi trồng khác khác Hơn nữa, đông trùng hạ thảo có chứa số nucleoside chiếm tỷ lệ cao như: adenosine, guanosine, uridine, cordycepin Đặc biệt, cordyceps sinensis tự nhiên hàm lượng adenosine cao hàm lượng cordycepin thấp ngược lại cordyceps militaris ni trồng Kết phân tích bảng sau: Bảng 1.1 Hàm lượng 13 nucleoside đông trùng hạ thảo * Polysaccharides Một số polysaccharides chất dẫn xuất đường khác acid cordycepic [d-mannitol] Nghiên cứu cho thấy polysaccharides có hiệu việc điều tiết đường máu, chống di hiệu chống ung thư tăng cường miễn dịch * Proteins hợp chất nitragenous Cordyceps chứa protein, peptide 17 acid amin thiết yếu khác Ngồi cịn chứa số dipeptide cyclic không phổ biến bao gồm cyclo -[Gly-Pro], Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy cyclo - [Leu-Pro], cyclo -[Ala-Leu], cyclo - [Ala-Val] Cyclo - [Thr-Leu] Khối lượng nhỏ polyamine bao gồm 1,3 diamino propane, cadaverine, spermidine, spermine pustrescine nhận dạng Hợp chất chứng minh có tác dụng kháng sinh * Sterols Một số sterol tìm thấy đơng trùng hạ thảo gồm: ergosterol, delta - 3- ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol campasterol Các hợp chất có liên quan tới sex-steroid chống rối loạn tình dục * Các thành phần cấu tạo khác Ngồi thành phần đơng trùng hạ thảo cịn có chứa số thành phần khác có giá trị cao như: - Các vitamin cần thiết cho thể (trong 100g đơng trùng hạ thảo có 0,12 mg vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, cịn có vitamin B2, vitamin E, vitamin K ) - Chứa 28 acids béo bão hòa, chưa bão hòa dẫn xuất - Các hợp chất phân cực chiết xuất từ đông trùng hạ thảo gồm: hợp chất hydrocarbon, alcohol aldehyde Đặc biệt hợp chất chuỗi hydrocarbon aromatic polycylic (PAH) sản xuất Cordyceps sinensis Đây coi hợp chất chuyển hóa thứ cấp Những hợp chất phản ứng với polypropylene sử dụng túi nuôi trồng nấm sản sinh sản phẩm phụ gây độc đông trùng hạ thảo, làm chậm tăng trưởng kéo dài thời gian sinh trưởng loài Thậm chí polypropelene sản phẩm phụ PAH giết chết sinh vật có lợi cho phát triển đơng trùng hạ thảo Vì vậy, nấm cordyceps sinensis phải trồng cốc vật chứa đựng kim loại Những hợp chất PAH có môi trường sống, chất dễ bay (không ổn định) dễ bị bị khô Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy Phụ lục H Sắc đồ khảo sát độ lặp lại phương pháp * Nền mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.387/86198 25 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H1 Sắc đồ mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo (Lặp 1) mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.393/79547 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H2 Sắc đồ mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo (Lặp 2) Adenosine/10.398/77561 mAU 20 260nm4nm (1.00) 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 12.5 10.0 15.0 Hình H3 Sắc đồ mẫu ngun liệu đơng trùng hạ thảo (Lặp 3) Adenosine/10.372/77843 mAU 20 260nm4nm (1.00) 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 12.5 10.0 15.0 Hình H4 Sắc đồ mẫu ngun liệu đơng trùng hạ thảo (Lặp 4) Adenosine/10.375/85914 mAU 25 260nm4nm (1.00) 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H5 Sắc đồ mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo (Lặp 5) mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.378/81074 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H6 Sắc đồ mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo (Lặp 6) 81 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy * Nền mẫu viên nang cứng Adenosine/10.298/117855 mAU 260nm4nm (1.00) 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình H7 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 1) Adenosine/10.303/107120 mAU 260nm4nm (1.00) 200 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình H8 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 2) Adenosine/10.297/133505 mAU 260nm4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình H9 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 3) Adenosine/10.297/133505 mAU 260nm4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 12.5 10.0 Hình H 10 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 4) Adenosine/10.298/114365 mAU 260nm4nm (1.00) 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình H 11 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 5) Adenosine/10.297/131198 mAU 260nm4nm (1.00) 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình H 12 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang cứng (Lặp 6) 82 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy * Độ lặp lại phương pháp mẫu viên nang mềm Adenosine/10.372/185491 mAU 260nm4nm (1.00) 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 13 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 1) Adenosine/10.370/202229 mAU 260nm4nm (1.00) 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 14 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 2) Adenosine/10.376/226931 mAU 260nm,4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 12.5 10.0 7.5 15.0 Hình H 15 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 3) Adenosine/10.363/185921 mAU 260nm4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 16 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 4) Adenosine/10.366/205233 mAU 260nm4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 12.5 10.0 15.0 Hình H 17 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 5) Adenosine/10.366/226809 mAU 260nm4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 18 Sắc đồ độ lặp lại mẫu viên nang mềm (Lặp 6) 83 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy * Độ lặp lại phương pháp mẫu dạng lỏng Adenosine/10.361/68752 mAU 40 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 10.0 7.5 12.5 15.0 Hình H 19 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 1) Adenosine/10.368/69520 mAU 260nm4nm (1.00) 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 20 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 2) Adenosine/10.366/61494 mAU 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 21 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 3) Adenosine/10.356/62089 mAU 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 22 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 4) Adenosine/10.364/70277 40 mAU 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 12.5 10.0 15.0 Hình H 23 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 5) Adenosine/10.360/69852 mAU 260nm4nm (1.00) 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình H 24 Sắc đồ độ lặp lại mẫu dạng lỏng (Lặp 6) 84 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy Phụ lục I Độ thu hồi phương pháp * Trên mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo Adenosine/10.397/147392 mAU 260nm4nm (1.00) 25 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I1 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo thêm chuẩn mức thấp (0,0525mg adenosine) Adenosine/10.392/192279 mAU 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I2 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo thêm chuẩn mức trung bình (0,105mg adenosine) mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.377/307844 50 40 30 20 10 0.0 2.5 7.5 5.0 12.5 10.0 15.0 Hình I3 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu nguyên liệu đông trùng hạ thảo thêm chuẩn mức cao (0,21mg adenosine) * Độ thu hồi phương pháp mẫu TPCN dạng viên nang cứng Adenosine/10.304/192124 mAU 260nm4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình I4 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang cứng thêm chuẩn mức thấp (0,0525mg adenosine) 85 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy Adenosine/10.304/243255 mAU 260nm4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình I5 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang cứng thêm chuẩn mức trung bình (0,105mg adenosine) mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.306/396272 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình I6 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang cứng thêm chuẩn mức cao (0,210mg adenosine) * Độ thu hồi phương pháp mẫu TPCN dạng viên nang mềm Adenosine/10.372/251750 mAU 260nm4nm (1.00) 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I7 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang mềm thêm chuẩn mức thấp (0,0525mg adenosine) Adenosine/10.370/340454 mAU 260nm4nm (1.00) 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I8 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang mềm thêm chuẩn mức trung bình (0,105mg adenosine) Adenosine/10.367/486932 mAU 260nm4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I9 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu viên nang mềm thêm chuẩn mức cao (0,210mg adenosine) 86 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy * Độ thu hồi phương pháp mẫu dạng lỏng Adenosine/10.364/112169 mAU 260nm4nm (1.00) 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I10 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu dạng lỏng thêm chuẩn mức thấp (31,5μg adenosine) Adenosine/10.362/148357 mAU 75 260nm4nm (1.00) 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I11 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu dạng lỏng thêm chuẩn mức trung bình (63μg adenosine) Adenosine/10.359/239714 mAU 260nm4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình I12 Sắc đồ độ thu hồi phương pháp mẫu dạng lỏng thêm chuẩn mức cao (126μg adenosine) 87 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy Phụ lục K Sắc đồ phân tích mẫu thực Adenosine/10.195/15746 mAU 40 260nm4nm (1.00) 30 20 10 0.0 2.5 5.0 10.0 7.5 12.5 15.0 Hình K1 Sắc đồ phân tích mẫu đơng trùng hạ thảo organic Adenosine/10.178/324061 mAU 600 260nm4nm (1.00) 500 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình K2 Sắc đồ phân tích mẫu linh chi đơng trùng hạ thảo Adenosine/10.183/219523 mAU 260nm4nm (1.00) 300 250 200 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình K3 Sắc đồ phân tích mẫu TPCN đơng trùng hạ thảo mAU 260nm4nm (1.00) Adenosine/10.208/203402 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình K4 Sắc đồ phân tích mẫu TPCN viên nang mềm Adenosine/10.171/368538 mAU 260nm4nm (1.00) 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình K5 Sắc đồ phân tích mẫu TPBS đông trùng hạ thảo 88 Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy Phụ lục L Bảng thông tin mẫu thực Bột đông trùng hạ thảo TPBS viên nang mềm Hàm lượng adenosine (theo công bố) (mg/100g; mg/viên) 400 ± 10% (mg/100g) 300 ± 10% (mg/3 viên) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Trùng thảo linh chi Nước đông trùng hạ thảo TPCN Viên đông trùng hạ thảo Cao linh chi đông trùng hạ thảo TPCN sâm đông trùng hạ thảo TPCN viên nang đông trùng hạ thảo TPCN Linh chi đông trùng hạ thảo TPCN viên đông trùng hạ thảo TPCN đông trùng hạ thảo TPCN đông trùng hạ thảo trị hen xuyễn Đông trùng hạ thảo Organic Viên nang mềm đông trùng hạ thảo TPCN viên đông trùng hạ thảo Nước uống bổ dưỡng đông trùng hạ thảo TPCN đông trùng hạ thảo Hàn quốc Đông trùng hạ thảo viên TPCN đông trùng bổ phế TPBS đông trùng hạ thảo Nước uống đông trùng hạ thảo Viên nang đông trùng hạ thảo TPCN cao đông trùng hạ thảo TPCN sợi đông trùng hạ thảo TPCN cordyceps militaris TPCN Ginseng cordyceps militaris Cao linh chi đông trùng hạ thảo Cao hồng sâm đông trùng hạ thảo TPCN đông trùng hạ thảo Viên nang cứng đồng trùng hạ thảo 0,7 - 0,9 (mg/100ml) 0,63 ±10% (mg/30ml) ≥ 15 mg/100g 83,2 ± 10% (mg/100g) 3,8 ± 10% (mg/100g) 0,11 ± 15% (mg/viên) 10,0 ± 20% (mg/100g) ≥ 0,15g/100g 25 ± 20% (mg/100g) 70 ± 10% (mg/viên) 0,11 ± 20% (mg/viên) 0,10 ±10% (mg/viên) 166,7 ± 20% (mg/viên) 0,75 ± 15% (mg/100ml) 80,5 ± 20% (mg/100g) 4,0 ± 15% (mg/100g) 0,35 ± 10% (mg/viên) đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo 50 mg đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo đông trùng hạ thảo TT Tên sản phẩm 89 Hàm lượng adenosine phân tích (mg/100g; mg/viên) 380 (mg/100g) 280 (mg/3 viên) 0,90 (mg/100ml) 0,70 (mg/30ml) 15,5 (mg/100g) 80,5 (mg/100g) 3,6 (mg/100g) 0,10 (mg/viên) 8,8 (mg/100g) 0,34 (g/100g) 23,2 (mg/100g) 65 (mg/viên) 0,12 (mg/viên) 0,075 (mg/viên) 15,8 (mg/viên) 0,48 (mg/100ml) 7,5 (mg/100g) 2,8 (mg/100g) 0,22 (mg/viên) 0,75 (mg/viên) 0,91 (mg/100ml) 0,21 (mg/viên) 0,12 (mg/viên) 321 (mg/100g) 5,5 (mg/100g) 9,1 (mg/100g) 2,8 (mg/100g) 2,6 (mg/100g) 4,2 (mg/viên) 0,50 mg/viên Kết luận Gần với cơng bố Thấp cơng bố Dương tính với adenosine MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung đông trùng hạ thảo 1.1.1 Đặc điểm đông trùng hạ thảo 1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo 1.1.3 Thành phần đông trùng hạ thảo 1.1.4 Tác dụng đông trùng hạ thảo Giới thiệu adenosine 10 1.2.1 Cấu tạo adenosine 10 1.2.2.Tính chất adenosine 11 1.2.3 Tác dụng dược lý adenosine 12 1.3 Phương pháp xác định adenosine 15 1.3.1 Phương pháp sắc ký mỏng (TLC) 15 1.3.2 Phương pháp điện di mao quản (CE) điện di mao quản gắn khối phổ (CEMS 16 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng 17 1.3.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC/MS) 17 1.3.3.2.Phương pháp sắc ký lỏng tạo cặp ion (IP-RP-LC–MS) 19 1.3.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) 20 1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 21 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 23 1.4.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng 23 1.4.2 Một số đại lượng đặc trưng HPLC 26 1.4.2.1 Thời gian lưu 26 1.4.2.2 Hệ số đối xứng pic 26 1.4.2.3 Độ phân giải R 26 1.4.3 Phân tích định tính định lượng HPLC 27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 28 2.2.1 Hóa chất 28 2.2.2 Thiết bị 28 2.2.3 Dụng cụ 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 31 2.4.1 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 32 2.4.2 Tính đặc hiệu chọn lọc .34 2.4.3 Xác định độ lặp lại 35 2.4.4 Xác định độ (độ thu hồi) 36 2.4.5 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tối ưu điều kiện xác định adenosine hệ thống HPLC 38 3.1.1 Tối ưu detector 38 3.1.2 Tối ưu cột sắc ký 39 3.1.3 Tối ưu thành phần pha động 41 3.1.4 Tối ưu chương trình rửa giải gradient 43 3.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 46 3.2.1 Tối ưu dung môi loại chất béo 46 3.2.2 Tối ưu dung môi chiết mẫu 47 3.2.3 Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu 48 3.2.4 Tối ưu thời gian chiết mẫu 49 3.2.5 Tối ưu số lần chiết mẫu 49 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng số chất thuộc nhóm nucleosides có đơng trùng hạ thảo đến chất phân tích 50 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 56 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 56 3.3.2 Đánh giá độ chọn lọc phương pháp 57 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại hệ thống 58 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp 59 3.3.5 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 62 3.4 Xác định hàm lượng adenosine mẫu nguyên liệu TPCN đông trùng hạ thảo 63 3.4.1 Xác định hàm lượng adenosine số nguồn nguyên liệu đông trùng hạ thảo 63 3.4.2 Xác định hàm lượng adenosine số TPCN đông trùng hạ thảo 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ Tên Tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril ADP Adenosine diphosphate Adenosin diphosphat AMP Adenosine monophosphate Adenosin monophosphat AOAC ATP cAMP CE-MS Association of Official Analytical Chemist Hội phân tích hố học Adenosine triphosphate Adenosin triphosphat cyclic adenosine monophosphate Cyclic adenosin monophosphat Capillary electrophoresis–mass spectrometry Điện di mao quản gắn khối phổ CNS central nevous system Hệ thống thần kinh trung ương EtOH Ethanol Ethanol GMP Guanosine monophosphate Guanosin monophosphat HPLC IP-RP LC-MS High performance liqid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Tạo cặp ion - pha ngược Ion pair - reserve phase Liqid chromatography - mass spectromephy Sắc ký lỏng - khối phổ LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng Methanol Methanol PDA Photo diod array Detector mảng diot TLC Thinner liqid chromatography Sắc ký mỏng MeOH Thực phẩm chức TPCN UPLC Ultra performance chromatography liqid Sắc ký lỏng siêu hiệu DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Hình ảnh Cordyceps sinensis Hình 1.2 Hình ảnh Cordyceps militaris .4 Hình 1.3 Cấu tạo số nucleoside đông trùng hạ thảo Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo adenosine 111 Hình 1.5 Con đường chuyển hóa thành adenosine thể 11 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 25 Hình 1.7 Sắc ký đồ phân tích sắc ký 27 Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 30 Hình 2.2 Đồ thị tương quan tín hiệu đo nồng độ chất phân tích 33 Hình 2.3 Xác định LOD cách tính S/N 37 Hình 3.1 Phổ hấp thụ adenosine sử dụng detector PDA 39 Hình 3.2 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm phân tích cột X-Brigde C18 40 Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm phân tích cột Symmetry C18 40 Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm phân tích cột IntertSustain C18 40 Hình 3.5 Sắc đồ adenosine nồng độ 10,5 ppm sử dụng pha động H2O ACN 42 Hình 3.6 Sắc đồ adenosine nồng độ 10,5 ppm sử dụng pha động H2O MeOH 42 Hình 3.7 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm sử dụng pha động H2O:MeOH=92:8 44 Hình 3.8 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm với pha động H2O:MeOH=80:20 44 Hình 3.9 Sắc đồ chuẩn adenosine 5,25 ppm với thành phần pha động H2O:MeOH theo chương trình gradient .45 Hình 3.10 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm với thành phần pha động theo chương trình gradient 45 Hình 3.11 Sắc đồ chuẩn adenosine 10,5 ppm với thành phần pha động theo chương trình gradient 45 Hình 3.12 Hàm lượng adenosine thu sử dụng dung môi chiết H2O, MeOH, EtOH với tỷ lệ khác 47 Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ trình chiết mẫu 48 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết mẫu 49 Hình 3.15 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn nucleoside (adenosine nồng độ 10,5 ppm; uridine, guanosine, cordycepin nồng độ 1,0 ppm) 51 Hình 3.16 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn nucleoside (adenosine nồng độ 10,5 ppm; uridine, guanosine, cordycepin nồng độ 5,0 ppm) 51 Hình 3.17 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn nucleoside (adenosine nồng độ 10,5 ppm; uridine, guanosine, cordycepin nồng độ 8,0 ppm) 51 Hình 3.18 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn nucleoside (adenosine nồng độ 10,5 ppm; uridine, guanosine, cordycepin nồng độ 20 ppm) 51 Hình 3.19 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn nucleoside(adenosine nồng độ 10,5 ppm; uridine, guanosine, cordycepin nồng độ 40 ppm) 51 Hình 3.20 Sắc đồ xác định hệ số đối xứng adenosine 52 Hình 3.21 Sắc đồ phân tích mẫu thực chưa bổ sung chuẩn .53 Hình 3.22 Sắc đồ phân tích mẫu thực bổ sung hỗn hợp chuẩn .53 Hình 3.23 Phổ hấp thụ uridine 54 Hình 3.24 Phổ hấp thụ guanosine .54 Hình 3.25 Phổ hấp thụ adenosine 54 Hình 3.26 Phổ hấp thụ cordycepin 54 Hình 3.27 Quy trình chiết mẫu xác định adenosine nguyên liệu TPCN đông trùng hạ thảo .55 Hình 3.28 Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào nồng độ adenosine .566 Hình 3.29 Đường chuẩn adenosine (nồng độ 0,50 - 10,5ppm) .57 Hình 3.30 Độ chọn lọc chuẩn adenosine nồng độ 10,5 ppm 58 Hình 3.31 Độ chọn lọc mẫu nguyên liệu đơng trùng hạ thảo 58 Hình 3.32.Độ chọn lọc mẫu TPCN đông trùng hạ thảo dạng viên nang mềm 58 Hình 3.33 Độ chọn lọc mẫu TPCN đông trùng hạ thảo dạng viên nang cứng 58 Hình 3.34 Độ chọn lọc mẫu TPCN đơng trùng hạ thảo dạng lỏng 58 Hình 3.35 Sắc đồ mẫu ngun liệu đơng trùng hạ thảo LOD 62 Hình 3.36 Sắc đồ mẫu TPCN đông trùng hạ thảo dạng viên nang mềm LOD 62 Hình 3.37 Sắc đồ mẫu TPCN đơng trùng hạ thảo dạng lỏng LOD 63 Hình 3.38 Hàm lượng adenosine mẫu TPCN đông trùng hạ thảo 64 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Hàm lượng 13 nucleoside đông trùng hạ thảo Bảng 3.1 Thành phần pha động khảo sát sử dụng 42 Bảng 3.2 Rửa giải chất phân tích theo chương trình isocratic .494 Bảng 3.3 Rửa giải chất phân tích theo chương trình gradient nồng độ 44 Bảng 3.4 Hàm lượng adenosine lần chiết mẫu khác .49 Bảng 3.5 Độ phân giải adenosine-guanosine, adenosine-cordycepine 52 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào nồng độ adenosine 56 Bảng 3.7 Đánh giá độ chệch điểm chuẩn 57 Bảng 3.8 Độ lặp lại thời gian lưu diện tích píc chuẩn adenosine nồng độ 10,5 ppm tiêm lặp lại 10 lần vào hệ thống HPLC .599 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp mẫu dạng nguyên liệu 60 Bảng 3.10 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp mẫu TPCN viên nang mềm 60 Bảng 3.11 Độ lặp lại độ thu hồi mẫu TPCN dạng viên nang cứng 61 Bảng 3.12 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp mẫu dạng lỏng 61 Bảng 3.13 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) adenosine mẫu khác 62 Bảng 3.14 Hàm lượng adenosine phận khác nguyên liệu đông trùng hạ thảo 63 ... dụng nhiều phương pháp khác để xác định adenosine thực phẩm như: phương pháp sắc ký mỏng, phương pháp điện di mao quản, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Tuy... chúng tơi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC để xác định hàm lượng adenosine sản phẩm thực phẩm chức đông trùng hạ thảo Phương pháp có độ nhạy độ xác cao Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thúy... phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC" với mục tiêu sau: - Tối ưu phương pháp định tính định lượng adenosine nguyên liệu thực phẩm chức đông trùng hạ thảo - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm