Xác định một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC

Các steroid là các hợp chất có khối lượng phân tử tương đối cao, do đó muốn sử dụng phân tích bằng phương pháp sắc ký khí, yêu cầu phải được dẫn xuất trước với các thuốc thử để tạo hợp c

NGUYỄN ĐỨC THANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

NGUYỄN ĐỨC THANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: ThS Bùi Đình Sơn

Nơi thực hiện: Viện KNVSATTP Quốc gia

HÀ NỘI - 2014

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Đình Sơn đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm vệ sinh

an toàn thực phẩm quốc gia đã tạo moị điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Hà nội, ngày 7 tháng 5 năm 2014

Nguyễn Đức Thanh

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Giới thiệu một số steroid trong nghiên cứu 2

1.5 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.4.4 Độ lặp lại (độ chính xác) 19

3.2 Tối ưu điều kiện xác định cortiosteroid trên thiết bị HPLC 22

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hóa học

phân tích

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

Bảng 2.1 Các chất chuẩn corticosteroid 14

Bảng 2.2 Yêu cầu độ lặp lại tại các nồng độ khác nhau theo AOAC 20

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 21

Bảng 2.4 Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 21

Bảng 3.1 Bảng khảo sát thành phần pha động 24

Bảng 3.2 Hiệu suất qua cột chiết pha rắn C18 với dung môi rửa giải MeOH 31

Bảng 3.3 Độ lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 corticosteroid 33

Bảng 3.4 Các phương trình hồi quy tuyến tính của 6 corticosteroid 34

Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện và định lượng của 6 corticosteroid 35

Bảng 3.6 Nồng độ chất phân tích cho vào nền mẫu ở các mức khác nhau 36

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn thấp 37

Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn trung bình 38

Bảng 3.9 Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn cao 39

Bảng 3.10 Kết quả phân tích mẫu thực 42

Hình 1.2 Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký 11 Hình 1.3 Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn 12 Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 16 Hình 2.2 Đường chuẩn trên nền mẫu thực 18 Hình 2.3 Xác định LOD bằng cách tính S/N 19 Hình 3.1 Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C18 23 Hình 3.2 Sắc đồ phân tích trên cột HiQ SIL C18 23 Hình 3.3 Sắc đồ phân tích với pha động H2O – THF 24 Hình 3.4 Sắc đồ phân tích với pha động H2O – MeOH 25 Hình 3.5 Sắc đồ phân tích với pha động H2O – ACN 25 Hình 3.6 Sắc đồ phân tích với pha động KH2PO4 – ACN 25 Hình 3.7 Sắc đồ phân tích theo chương trình 1 26 Hình 3.8 Sắc đồ phân tích theo chương trình 2 27 Hình 3.9 Sắc đồ phân tích theo chương trình 3 27 Hình 3.10 Sắc đồ phân tích theo chương trình 4 28 Hình 3.11 Sắc đồ phân tích ở điều kiện tối ưu 29 Hình 3.12 Sắc đồ phân tích dung môi và dung dịch chuẩn 6 corticosteroid 32 Hình 3.13 Sắc đồ tại giới hạn phát hiện của 6 chất phân tích 35 Hình 3.14 Quy trình phân tích mẫu thực 41

Corticosteroid là nhóm chất có gốc steroid được tuyến thượng thận của cơ thể sản xuất ra với tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn dịch Corticosteroid có thể sử dụng để xử lý các biến chứng của bệnh ung thư và điều trị ung thư, sử dụng trong các trường hợp viêm khớp nghiêm trọng Song, việc sử dụng

và điều trị bằng corticosteroid cần có chỉ định của bác sĩ, sử dụng sai mục đích và liều lượng gây ra những tác dụng phụ có thể dẫn tới hậu quả nghiêm trọng

Trong những năm vừa qua, tại Việt Nam cũng như trên thế giới liên tiếp phát hiện các vi phạm trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm: Sữa có chứa melamine để tăng độ đạm, sản phẩm hỗ trợ điều trị xương khớp từ thảo dược nhưng lại chứa dexamethasone, piroxicam, furosemide…

Do đó để giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ quan chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là đối với thực phẩm

chức năng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Xác định một số corticosteroid trong

thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC” với các mục tiêu sau:

+ Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng

+ Ứng dụng quy trình đã xây dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu một số corticosteroid trong nghiên cứu

Corticosteroid là nhóm chất trong công thức có khung steroid và có chung cấu tạo là ol - 21 - dion - 3,20 pregna - 4 - en và rất ít ngoại lệ

Hình 1.1 Cấu trúc khung cơ bản của steroid

Dưới đây là một số corticosteroid được nghiên cứu trong đề tài này:

Bảng 1.1 Giới thiệu một số corticosteroid

phân tử

Khối lượng phân tử (g/mol)

Tính chất vật lý Công thức cấu tạo

TT Tên Công thức

phân tử

Khối lượng phân tử (g/mol)

Tính chất vật lý Công thức cấu tạo

264oC

TT Tên Công thức

phân tử

Khối lượng phân tử (g/mol)

Tính chất vật lý Công thức cấu tạo

Nhiệt độ nóng chảy 231-

234oC

1.2 Vai trò của nhóm corticosteroid [1], [2]

Dựa vào tác dụng dược lý cơ bản, các corticosteroid được phân thành hai dạng: mineralocorticoid và glucocorticoid Các mineralocorticoid làm thay đổi cân bằng nước - điện giải bằng cách giúp tái hấp thu natri, bài tiết hydro và kali ở ống thận

xa, gây phù và cao huyết áp Glucocorticoid cũng có một số tác dụng của mineralocorticoid đồng thời tham gia vào một số chu trình chuyển hóa khác gồm: tái tạo đường, phân bố lại mỡ, chuyển hóa protein và cân bằng calci

Kháng viêm và ức chế miễn dịch: Glucocorticoid có tác dụng chống lại các

biểu hiện của quá trình viêm, do làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian gây viêm như cytokin, ecosanoid, giảm giải phóng histamin

Tác dụng chuyển hóa: Glucocorticoid làm tăng đường huyết lúc đói để cung

cấp glucose cho các mô phụ thuộc glucose như não và tim

Tác dụng lên chất điện giải và cân bằng nước: Mineralocorticoid liều cao gây

giữ natri và nước, đồng thời gây đào thải kali, điều đó có thể dẫn đến phù và nhược

cơ Các dẫn xuất tổng hợp ít gây tác dụng này Ngăn hấp thu calci ở ruột và tăng đào thải qua thận nên giảm dự trữ calci trong cơ thể Sự đào thải Ca2+ qua thận làm tăng calci niệu Có thể trị calci niệu do mineralocorticoid bằng lợi tiểu

1.3 Tình hình sử dụng Corticosteroid

Corticosteroid là nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới trong nhiều năm qua Corticosteroid thường được coi là con dao hai lưỡi mà cả hai lưỡi đều hết sức sắc bén

Năm 1949, Hench, Richstein và Kendall đã dùng cortison để điều trị cho một phụ nữ 29 tuổi gần như tàn phế vì chứng thấp khớp Thành công này đã mở ra cho những người bệnh thấp khớp một niềm hy vọng lớn, vì cho đến thời điểm đó việc giúp cho người bệnh giảm bớt đau đớn và đem họ trở về với công việc thường nhật hầu như là điều bất khả kháng Những đột phá trong điều trị viêm khớp đã đem lại cho êkíp của Hench giải Nobel y học danh giá vào năm sau đó, năm 1950

Corticosteroid trở thành một thần dược, các labo tìm cách sản xuất các dạng thuốc có thể tiêm, để có tác dụng nhanh hơn, hoặc thay đổi cấu trúc hóa học để kéo dài thời gian tác dụng của thuốc; các nhà lâm sàng học thì tìm các ứng dụng điều trị trong nhiều loại bệnh khác nhau từ thấp khớp, cho đến hen suyễn, dị ứng, phù, mề đay, sốc thuốc, các bệnh lý tại các cơ quan khác nhau như thận, da, mạch máu, có căn nguyên miễn dịch Trong nhiều trường hợp, corticosteroid cho thấy những khả năng đa dạng của nó và hứa hẹn cho việc giải quyết một số bệnh lý mạn tính Tuy nhiên, việc sử dụng ồ ạt và đại trà cũng làm cho người ta phát hiện ra những tác dụng phụ của thuốc sớm hơn Hàng loạt các biến chứng nguy hiểm do

quá liều corticoid như suy tuyến thượng thận, xuất huyết tiêu hóa, loãng xương, xẹp đốt sống, gù vẹo cột sống, tăng đường máu, tăng huyết áp, teo cơ, rối loạn tâm thần, trầm cảm, đục thủy tinh thể, suy giảm chức năng miễn dịch gây nhiễm trùng cơ hội, chậm phát triển thể chất ở trẻ em… đã làm cho ngành y phải đưa ra những cảnh báo khẩn cấp cho việc lạm dụng corticosteroid

Hiện nay ở Việt Nam, tình trạng lạm dụng các loại thuốc corticosteroid đang diễn ra khá phổ biến ở các cơ sở khám chữa bệnh tư nhân, thuộc nhiều tỉnh thành trong cả nước Rất nhiều người bệnh đang phải hàng ngày gánh chịu những hậu quả khôn lường do việc lạm dụng các thuốc này gây ra

1.4 Các phương pháp xác định corticosteroid

1.4.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [11]

M.Ebrahimi [11] đã phân tích 17, 20β-dihytroxy-4-pregenen-3-one sử dụng enzyme acethylcholinesterase làm chất phát hiện Phương pháp dựa trên nguyên lý

sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tạo thành cộng hợp kháng nguyên - kháng thể Cộng hợp kháng nguyên - kháng thể này sẽ tiếp hợp với kháng thể thứ 2 được đánh dấu bằng enzym acethylcholinesterase Phức hợp này sẽ được tạo màu với thuốc thử Ellman và đo quang ở bước sóng 405nm Phương pháp cho kết quả nhanh chóng, chính xác và độ nhạy cao

1.4.2 Phương pháp điện di mao quản [9]

Phương pháp phân tích cortisol tự do trong nước tiểu được Lokinendi V.Rao và cộng sự phát triển năm 1999 [9] Mẫu được làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột SPE C18 biến đổi trên nền chất trơ của polytetrafluoroethylane Mẫu nước tiểu được đưa nhanh qua cột đã được hoạt hóa trước với 250μl methanol và 1ml nước cất Sau đó, cột được rửa 2 lần, mỗi lần 1ml hỗn hợp aceton : nước tỷ lệ 1 : 9 (v/v) Cuối cùng, rửa giải với 80μl ACN và phân tích trên hệ thống điện di mao quản Sử dụng hệ đệm 75mmol/l SDS, 20% ACN (v/v) và 20mmol/l MES (pH 6,0) Ống mao quản đường kính trong 50μm x 375μm x 37cm Mẫu được bơm vào hệ thống dưới áp suất 5psi trong 20s và nhiệt độ cột được duy trì ở 16 ± 0,10C, detector

UV bước sóng 254 nm và thế 10kV Phương pháp cho độ thu hồi 89 - 94%, giới hạn phát hiện là 10μg/l

1.4.3 Phương pháp sắc ký khí [14]

Theo tài liệu hướng dẫn của hãng Thermo Fisher Scientific [14], phương pháp GC-MS/MS có thể phân tích được các steroid Thông số thiết bị gồm: thể tích bơm mẫu là 1μl, sử dụng cột Rtx-CLP 0,32mm x 20m x 0,5micron và tốc độ khí là 1ml/phút Chương trình gradient nhiệt độ cài đặt 600C trong 1 phút sau đó tăng lên

2200C tốc độ 400C/phút, tăng tiếp lên 2600C tốc độ 10o/phút và giữ 1 phút ở nhiệt

độ 2600C, tiếp đó tăng lên 3000C với tốc độ 400C/phút và giữ 10 phút ở nhiệt độ này Hãng khảo sát thấy phương pháp có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính từ 4pg đến 4ng Giới hạn phát hiện trong mẫu nước tiểu thêm chuẩn là 50ng/ml Các steroid có đến 70% có mảnh con tương đồng nhau khi quét phổ

Các steroid là các hợp chất có khối lượng phân tử tương đối cao, do đó muốn sử dụng phân tích bằng phương pháp sắc ký khí, yêu cầu phải được dẫn xuất trước với các thuốc thử để tạo hợp chất dễ bay hơi rồi mới tiến hành phân tích Do đó, hóa chất cũng như thao tác thực hiện phức tạp, quá trình dẫn xuất có thể không hoàn toàn gây ra sai số phân tích

Để định lượng hàm lượng prednison, prednisolon, dexamethasone và cortisol trong dịch huyết thanh, tác giả Valerie A.Frerichs, Kathleen M Tornatore [15] cũng dùng phương pháp LC-MS Các chất được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi gồm 50% methanol và 50% dung dịch đệm acetat 5mM, pH 3,5 ở nồng độ 1ppm Mẫu được thu thập, thêm chuẩn sau đó được bảo quản ở -700C trong 3 tháng Khi phân tích, giã đông mẫu và tiến hành xử lý chiết tách các steroid Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,2 - 0,58ppb và giới hạn định lượng của phương pháp từ 5,4 - 10,7ppb tương ứng với từng hợp chất

Adam Tolgyesi và cộng sự [7] năm 2011 đã phân tích các corticosteroid trong

mỡ lợn sử dụng sắc ký khối phổ Các tác giả tiến hành nghiên cứu đối với 5 chất thuộc nhóm corticosteroid bao gồm methyl prednisolon, methyl prednison, prednisolon, dexamethasone, flumethasone Phương pháp có độ thu hồi từ 81-100%, giới hạn phát hiện trong khoảng 0,1 - 0,3μg/kg, thời gian phân tích chỉ 7,5phút Độ lệch chuẩn tương đối trong phòng thí nghiệm và độ tái lặp giữa các ngày phân tích cũng cho kết quả trong giới hạn cho phép

1.4.4.2 Phương pháp sắc kí lỏng với detector huỳnh quang [16]

Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng detector huỳnh quang để tăng độ nhạy và

độ chọn lọc Bản thân các steroid không có khả năng phát huỳnh quang, vì vậy khi

sử dụng phương pháp này các steroid được tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang

Wei Gao và cộng sự [16] xác định cortisol trong tóc bằng cách cho cortisol tạo dẫn xuất với axit sulfuric trong methanol (70:30 theo thể tích) trong 2 phút ở nhiệt

độ 700C Dẫn xuất sau đó được cho qua cột SPE C18 để làm sạch và làm giàu mẫu Phân tích trên hệ thống sắc ký với các điều kiện: Cột ODS C18 (250cm x 4,6mm x 5μm), pha động gồm nước và methanol, detector huỳnh quang với bước sóng kích thích là 360nm và phát xạ là 480nm Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1pg/mg Hiệu suất thu hồi qua cột SPE là 81,4 ± 3,3% đối với nội chuẩn, 100,3 ± 5,2% đối với cortisol ở nồng độ 20ng/ml Độ lệch chuẩn tương đối giữa các ngày là 7,3%

1.4.4.3 Phương pháp sắc kí lỏng với detector UV-Vis [8], [12]

Để phân tích tồn dư dexamethasone và prednisolon trong sữa bò, Eszter Desi và cộng sự [8] đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu và phân tích trên sắc ký lỏng với detector UV Phương pháp sử dụng cột C18, pha động gồm ACN và nước cất với chương trình gradient, detector 240nm, thể tích bơm mẫu 100μl Phương pháp phân tích có thể ứng dụng để phân tích dexamethason và prednisolon trong sữa đạt yêu cầu cho phép của Châu Âu với giới hạn phát hiện của dexamethason và prednisolon lần lượt là 0,075μg/kg và 0,05 μg/kg

Qiang Fu và cộng sự [12] phân tách 26 hợp chất liên quan với betamethason bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo Betamethason và các hợp chất liên quan được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi axit acetic và ACN tỷ lệ 0,1:100 (v/v) Phương pháp sử dụng cột C18 ACE3 (15cm x 4,6mm x 3μm), pha động gồm 2 kênh: kênh A là 0,1% methanesulfonic acid, kênh B là hỗn hợp tert-butanol và 1,4 dioxane tỉ lệ 7:93 (v/v) với chương trình gradient pha động, tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích bơm mẫu là 50μl, detector UV 254nm Tổng thời gian phân tích là 68 phút Phương pháp tách được các chuẩn rõ ràng, peak cân đối, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện thu được của betamethason là 0,05mg/kg và 0,02mg/kg, với các hợp chất khác là 0,01mg/kg và 0,02mg/kg

1.5 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng [3], [4], [5]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.5.1.1 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

1.5.1.2 Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

+ Pha động phải trơ với pha tĩnh

+ Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

+ Hoà tan được mẫu

+ Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại:

+ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược

+ Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…

Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi

là gradient pha động

+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp chất có tính dẫn điện…

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được phát triển như: detector PDA,

MS, cho độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn

1.5.2 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [3], [4]

Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp

Hình 1.2 Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký

Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn hoặc so sánh

1.5.3 Phương pháp chiết pha rắn [5]

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu với mục đích để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp

Các chất ảnh hưởng được loại bỏ

Cột SPE được nhồi bằng những hạt nhỏ, xốp có các nhóm chức khác nhau Chất lỏng qua cột dưới tác dụng của áp suất hoặc chân không

Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 1.3 Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn

Bước 1: Hoạt hoá chất hấp phụ pha rắn

+ Làm ướt vật liệu nhồi, chuyển các nhóm chức của chất hấp phụ về dạng hoạt

động

+ Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ

+ Không được để chất hấp phụ bị khô

Bước 2: Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột

+ Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ

+ Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thể bị giữ lại

+ Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch mẫu phân tích

Bước 3: Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

+ Giữ lại chất phân tích

+ Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng, tạp bẩn

Bước 4: Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp

+ Phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ với mục đích tách được chất phân tích vào dung dịch rửa giải

+ Dung môi được chọn phù hợp để đạt hiệu quả cao đồng thời càng ít chất gây ảnh hưởng tới phép phân tích càng tốt

Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến do những ưu điểm vượt trội sau:

+ Hiệu suất thu hồi cao

+ Khả năng làm giàu, làm sạch chất phân tích lớn

+ Giảm lượng dung môi sử dụng

+ Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích

+ An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt

Với đối tượng nghiên cứu là thực phẩm chức năng, thành phần rất đa dạng Việc làm sạch dung dịch phân tích trước khi đưa vào phân tích trên hệ thống HPLC là rất quan trọng Khi dung dịch phân tích càng sạch, sự ảnh hưởng nền đối với chất phân

tích càng ít, đồng thời tuổi thọ của cột sắc ký cũng được kéo dài

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu, Máy lắc vortex VELP, Máy

li tâm lạnh Hermle, Cân phân tích (0,1mg và 0,01mg), Cân kĩ thuật (0,01g), Máy cất quay chân không Eyela

1 Cortison acetat Viện kiểm nghiệm thuốc TW 99,7%

2 Hydrocortison acetat Viện kiểm nghiệm thuốc TW 99,8%

3 Prednison Viện kiểm nghiệm thuốc TW 99,8%

4 Prednisolon Viện kiểm nghiệm thuốc TW 99,7%

5 Methyl prednisolon Viện kiểm nghiệm thuốc TW 99,9%

6 Betamethason Viện kiểm nghiệm thuốc TW 100,1%

- Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: cân chính xác khoảng 0,1000g trên cân phân tích 10-4g từng chất chuẩn corticoteroid hòa tan và định mức 100,00ml bằng methanol Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 6 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian 100ppm: lấy chính xác 1,00ml dung dịch chuẩn gốc 1000ppm vào bình định mức 10,00ml và định mức tới vạch bằng methanol

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10ppm: hút lần lượt 1,00ml mỗi chuẩn đơn 100ppm vào bình định mức 10,00ml, định mức tới vạch bằng methanol

- Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 1, 2, 5ppm được pha trong methanol

+ Các loại hóa chất, dung môi khác: Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), n-hexan (Merck 99,9%), Kalidihydrophotphat (Merck), Nước cất dùng cho sắc ký lỏng

+ Chuẩn bị pha động: Kênh A là dung dịch KH2PO4 20mM trong nước, kênh B

là ACN

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Đối tượng nghiên cứu: Thực phẩm chức năng

+ Nội dung nghiên cứu của đề tài này là:

- Xây dựng quy trình phân tích một số chất thuộc nhóm corticosteroid bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng với detector UV

- Lấy mẫu và áp dụng phương pháp để đánh giá một số mẫu thực tế

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

+ Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm cân, làm đẹp, tăng cường sinh lực, hỗ trợ trong điều trị và phòng viêm xương khớp + Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

+ Địa điểm: Thành phố Hà nội

+ Đơn vị mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu

+ Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường

2.3.2 Phương pháp phân tích

+ Nguyên tắc: Các corticosteroid được tách ra khỏi nền mẫu bằng methanol, cô đuổi dung môi methanol Hòa tan phần cặn trong nước, làm sạch qua cột chiết pha rắn C18, dịch sau khi qua cột SPE được tách và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV

+ Quy trình phân tích dự kiến như sau:

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến

+ Tóm tắt quy trình:

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi để chiết corticosteroid

- Đảo trộn đều mẫu bằng máy lắc Vortex

- Rung siêu âm để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi chiết

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần bã

- Cô quay gần cạn, hòa cặn, cho dịch qua cột SPE để làm sạch và làm giàu chất phân tích

- Bơm dịch rửa giải vào hệ thống HPLC để định tính và định lượng chất phân tích có trong mẫu

2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [6]

2.4.1 Tính đặc hiệu và chọn lọc

+ Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích + Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến phân tích nhiều chất trong cùng một quy trình Tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu

Cô quay gần khô

Hòa cặn, qua cột SPE C18

do các phương pháp phân tích thường có nhiều chất cùng xuất hiện, nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

+ Cách thực hiện: Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp, bố trí thí nghiệm như sau:

- Phân tích mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần với từng loại nền mẫu Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu chất phân tích

- Phân tích mẫu thử hoặc mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu 6 lần Mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thử phải có tín hiệu chất phân tích

2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

+ Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích có quan hệ tuyến tính với nhau

+ Cách xác định: cần khoảng 6 - 10 dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, thực hiện đo tín hiệu của các dung dịch đó và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ

+ Xây dựng đường chuẩn: Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật khác nhau, có một số loại đường chuẩn chủ yếu sau:

Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn, đo tín hiệu y tương ứng với nồng độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có đường chuẩn là phương trình đường thẳng: y = ax + b

Đường chuẩn trên nền mẫu trắng

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau, trong khoảng tuyến tính ước lượng ở trên Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng thường cho độ tin cậy cao hơn so với xây dựng trên chuẩn tinh khiết vì có thể loại trừ một phần ảnh hưởng của nền mẫu Tuy nhiên thực tế khó tìm được nền mẫu trắng phù hợp Do đó, thường sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực

Đường chuẩn trên mẫu thực:

Phân tích mẫu thực có cho thêm các nồng độ chuẩn khác nhau tương tự như với mẫu trắng Vẽ đồ thị tín hiệu đo phụ thuộc vào nồng độ chuẩn thêm, dạng đường chuẩn trên nền mẫu thực thường có dạng như sau:

Hình 2.2 Đường chuẩn trên nền mẫu thực

Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được các

ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

2.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

+ Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp có thể định tính được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tín hiệu chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu nền

Cách xác định LOD: Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà S/N = 3

2.4.4 Độ lặp lại (độ chính xác)

+ Độ lặp lại (độ chụm) thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo so với giá trị trung bình, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch tương đối RSD

+ Cách xác định: Tiến hành thí nghiệm lặp lại n lần (thường thực hiện 6 lần) Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán liên quan như sau:

Giá trị trung bình:

n

i x

kết quả thí nghiệm

+ Đánh giá độ lặp lại hay độ chụm của phương pháp: yêu cầu RSD không được cao hơn giá trị cho phép Dưới đây là tiêu chuẩn thường được sử dụng:

Bảng 2.2 Yêu cầu độ lặp lại tại các nồng độ khác nhau theo AOAC

+ Có nhiều cách tính độ đúng như: dùng so sánh với phương pháp chuẩn, tính

độ thu hồi, sử dụng vật liệu chuẩn trong nghiên cứu này chúng tôi xác định độ đúng thông qua việc xác định độ thu hồi

+ Tính độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn Độ thu hồi H được tính như sau:

%100)(

C

C C

H

Trong đó: Cm+c: Nồng độ của mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ của mẫu

Cc: Nồng độ của chuẩn thêm vào mẫu

+ Đánh giá độ thu hồi:

Sau khi tính độ thu hồi, so sánh kết quả tính được với các giá trị cho phép

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC

Bảng 2.4 Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu

2 Trên 1 μg/kg đến dưới 10 μg/kg Trên 1 đến dưới 10ppb 70-110

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích

Các steroid trong phân tử có nối đôi liên hợp nên có khả năng hấp thụ UV do đó

có thể sử dụng detector hấp thụ phân tử để phân tích Chất phân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, được dẫn vào flowcell của đầu đo và được chiếu bởi một chùm tia tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

Tham khảo một số tài liệu [2], [5], [8], [12] chúng tôi tiến hành xác định các corticosteroid trên hệ thống sắc ký lỏng HPLC-UV với các điều kiện sơ bộ như sau: + Cột pha đảo C18

+ Cột Xbridge C18 (150mm × 2,1mm × 3,5µm) và tiền cột

+ Cột HiQ SIL C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) và tiền cột

Cố định các điều kiện phân tích khác:

+ Pha động: kênh A: dung dịch KH2PO4 20mM trong nước; kênh B: ACN + Detector UV tại bước sóng 254nm