1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Xác định adenosine trong thực phẩm chức năng có chứa đông trùng hạ thỏa bằng phương pháp HPLC

66 1,5K 3

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 66
Dung lượng 1,61 MB

Nội dung

Tuy nhiên, hiện nay tại Việt nam chưa có phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng hoạt chất chính trong Đông trùng hạ thảo nên việc phát triển phương pháp phân tích các hoạt chất chính nó

Trang 1

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

Trang 2

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

CÓ CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

Trang 3

giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm Vệ sinh

an toàn thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất và các bộ môn khác trong Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 09 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Anh

Trang 4

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 2

1.1 Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo 2

1.1.1 Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2

1.1.2 Phân loại Đông trùng hạ thảo 2

1.1.3 Thành phần của Đông trùng hạ thảo……… 3

1.1.4 Tác dụng của Đông trùng hạ thảo……… 4

1 2 Giới thiệu về adenosine……….……… 6

1.2.1 Cấu tạo của adenosine……… 6

1.2.2 Chuyển hóa và tác dụng của adenosine……… 7

1.3 Phương pháp xác định adenosine……… 8

1.3.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC……… 8

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản (CE)……… 9

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng……… 9

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)………… 11

1.4.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng……… 11

1.4.2 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC……… 13

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng 15

2.2 Hóa chất và dụng cụ 15

2.2.1 Thiết bị 15

2.2.2 Dụng cụ 15

2.2.3 Hóa chất 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

Trang 5

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 19

3.2 Tối ưu điều kiện xác định adenosine trên hệ thống HPLC………… 19

3.2.1 Lựa chọn cột tách sắc ký………

3.2.2 Khảo sát thành phần pha động………

3.2.3 Khảo sát chương trình rửa giải gradient

3.2.4 Điều kiện tối ưu của quá trình sắc ký

19 21 23 26 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 27

3.3.1 Khảo sát dung môi chiết ………

3.3.2 Khảo sát dung môi loại béo………

3.3.3 Khảo sát nhiệt độ chiết………

3.3.4 Khảo sát thời gian chiết … ………

3.3.5 Khảo sát số lần chiết………

27 28 29 30 30 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích……… 32

3.4.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn………

3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp ………

3.4.3 Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp

3.4.4 Đánh giá độ lặp lại của hệ thống

3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

32 33 35 36 37 3.5 Đánh giá chất lượng của TPCN có chứa ĐTHT 40

3.6 Bàn luận 41

3.6.1 Đối tượng nghiên cứu 41

3.6.2 Xây dựng quy trình phân tích 41

3.6.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 41

3.6.4 Thẩm định phương pháp 42

Trang 6

PHỤ LỤC

Trang 7

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa phân

tích

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trang 8

Bảng 3.2 Khảo sát số lần chiết mẫu……… 30

Bảng 3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính……… 32

Bảng 3.4 LOD và LOQ của adenosine 34

Bảng 3.5 Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 36

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang mềm 38

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng viên nang cứng 38

Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dạng lỏng 39

Trang 9

Hình 1.2 Hình ảnh của Cordyceps militaris………3

Hình 1.3 Cấu tạo của một số nucleoside trong Đông trùng hạ thảo………… 4

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của adenosine……… 7

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC……… 13

Hình 1.6 Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký……… 13

Hình 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến……… 17

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của adenosine……… 19

Hình 3.2 Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C18………20

Hình 3.3 Sắc đồ phân tích trên cột Symmetry C18……….20

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích trên cột IntertSustain C18………21

Hình 3.5 Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H2O và ACN……… 22

Hình 3.6 Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H2O và MeOH………… 22

Hình 3.7 Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 1……….23

Hình 3.8 Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 2……….24

Hình 3.9 Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 3……….24

Hình 3.10 Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 4……… 25

Hình 3.11 Sắc đồ phân tích theo chương trình gradient 5……… 26

Hình 3.12 Sắc đồ phân tích với điều kiện tối ưu……… 27

Hình 3.13 Khảo sát dung môi chiết …….……… …………27

Hình 3.14: Khảo sát nhiệt độ chiết……… 29

Hình 3.15: Khảo sát thời gian chiết ……… 30

Hình 3.16 Quy trình phân tích mẫu thực ……….31

Hình 3.17 Khảo sát khoảng tuyến tính ……….32

Hình 3.18 Đường chuẩn của adenosine……… 33

Hình 3.19 Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng viên nang tại LOD 34

Hình 3.20 Sắc đồ nền mẫu TPCN dạng lỏng tại LOD 34

Trang 10

Hình 3.24: Độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dạng lỏng 36 Hình 3.25: Đánh giá chất lượng mẫu TPCN có chứa ĐTHT 40

Trang 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc

có tác dụng “Bổ phế ích can, bổ tinh điền tuỷ, chỉ huyết hoá đàm”, “Bổ phế ích thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “Tư âm tráng dương, khư bệnh kiện thân”, là loại thuốc

có thể chữa được “Bách hư bách tổn” Trên lâm sàng, các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không

có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật Trong thành phần hóa học của Đông trùng hạ thảo, adenosine là một trong những hoạt chất chính có tác dụng Adenosine có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá năng lượng của cơ thể Nó giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cơ bắp, giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu… Vì vậy, việc bổ sung adenosine hàm lượng cao giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu

quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi

Tuy nhiên, hiện nay tại Việt nam chưa có phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng hoạt chất chính trong Đông trùng hạ thảo nên việc phát triển phương pháp phân tích các hoạt chất chính nói chung và adenosine nói riêng trong nguyên liệu hay các sản phẩm có chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết Nó là công cụ giúp cho các nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng và giúp cho người tiêu dùng được

sử dụng các sản phẩm đảm bảo chất lượng

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Xác định adenosine trong

thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC"

với các mục tiêu sau:

+ Xây dựng phương pháp xác định adenosine trong TPCN có chứa ĐTHT bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

+ Ứng dụng phương pháp để phân tích sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT trên thị trường Từ đó, đánh giá chất lượng sản phẩm TPCN có chứa ĐTHT

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo [10], [14], [21], [22], [23]

Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) là một loại nấm thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes, được coi là một thần dược có giá trị cao trong y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ Đó là một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học

là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp nhất là loài Hepialus armoricanus, ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh

Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh "Cord" = "chùy", "ceps" = "đầu" Nấm có

dạng giống con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi sấy khô có mùi tanh như

cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11 cm, trọng lượng khoảng 0,06g do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3 – 5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20 - 30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn, có 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu và sâu biến thành xác khô Vào mùa đông, sâu

bị nhiễm bào tử nấm do ăn phải hoặc hít phải bào tử nấm Vào mùa hè, nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất Đông trùng hạ thảo chỉ được phát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam

1.1.2 Phân loại Đông trùng hạ thảo [14]

Chi nấm Cordyceps có tới 680 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy

60 loài Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được 2 loài

Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

Trang 13

Hình 1.1 Hình ảnh của Cordyceps sinensis

Hình 1.2 Hình ảnh của Cordyceps militaris

1.1.3 Thành phần của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [18], [19], [21], [23]

Trong Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý: các hợp chất nucleoside, các polysaccharide, protein và các hợp chất nitragenous, sterol, vitamin, khoáng chất

* Các nucleoside

Đây là thành phần chính có giá trị đặc biệt trong Đông trùng hạ thảo, gồm một

số hợp chất như: deoxyuridine, 2’-3’-dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine, cordycepin [3’-deoxyadenosine], uridine, guanidine, deoxyguanidine, cordycepin triphosphate Trong đó, adenosine là một nucleoside có hoạt tính sinh học chính để đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo

Trang 14

Hình 1.3 Cấu tạo của một số nucleoside trong Đông trùng hạ thảo

* Các nhóm hợp chất khác

Nakamura và cộng sự [18], [19] đã nghiên cứu cho thấy các polysaccharide trong ĐTHT có hiệu quả trong việc điều tiết đường trong máu, chống di căn, có hiệu quả chống ung thư và tăng cường miễn dịch

Cordyceps chứa protein, peptide và 17 acid amin thiết yếu khác Ngoài ra,

Cordyceps còn chứa một số dipeptide cyclic không phổ biến như cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro],… , lượng nhỏ các polyamin như 1,3-diamino propane,… Các hợp chất này được chứng minh là có tác dụng kháng sinh [14]

Một số các sterol có trong Đông trùng hạ thảo như ergosterol, ergosterol peroxide, có tác dụng chống rối loạn tình dục

Các vitamin cần thiết cho cơ thể: trong 100g Đông trùng hạ thảo có 0,12mg vitamin B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2, vitamin E, vitamin K…

Ngoài ra còn có hợp chất hydrocarbon, alcohol và aldehyde,…

1.1.4 Tác dụng của Đông trùng hạ thảo [7], [14], [16], [23]

Đông trùng hạ thảo được sử dụng khá phổ biến trong khoảng 200 năm trước đây ở Trung Quốc và các nước ở Phương Đông Đến năm 1976, nó đã được biết đến

và sử dụng rộng rãi tại các nước phương tây

Trang 15

Đông trùng hạ thảo có tác dụng bổ phổi, thận, cầm máu, tan đờm, điều trị ho mãn tính, điều trị ra mồ hôi trộm và đảm bảo phục hồi sức khỏe nhanh cho người bị bệnh và tăng cường sức đề kháng

Cải thiện chức năng gan: chống xơ gan, viêm gan mãn tính và các bệnh liên quan đến gan khác Thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi sử dụng TPCN có chứa ĐTHT trên 33 bệnh nhân viêm gan B và 8 bệnh nhân xơ gan cho thấy trên 71% bệnh nhân có cải thiện tình trạng bệnh lý

Cải thiện chức năng thận: nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy 51% số bệnh nhân đã cải thiện được bệnh thận mãn tính khi sử dụng 1 tháng các sản phẩm từ Cordyceps

Tăng khả năng hấp thụ O2, có khả năng làm giảm bệnh phổi mãn tính

Cải thiện chức năng tim: điều trị rối loạn nhịp tim và suy tim mãn tính

Bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do

Giảm kích thước của khối u và chống lại ung thư: dùng polysaccharide chiết xuất từ Cordyceps với liều 1-10mg/kg trọng lượng mỗi ngày cho chuột có khối u cho thấy có tác dụng chống khối u sarcoma 180 Mizuno [16], năm 1999 đã nghiên

cứu dùng -(1,3)-D-glucan, phân đoạn CO-N, dẫn xuất từ ĐTHT C.ophioglossoides

để chống lại chuỗi tế bào sarcoma 180 với liều 0,5mg/kg trên chuột Kết quả, khối u

bị hạn chế phát triển với tỷ lệ đạt đến 98% Trong một nghiên cứu điều trị 50 bệnh nhân bị ung thư phổi với liều điều trị 6g/ngày cùng với hoá trị, khối u giảm xuống 46% Khi điều trị các loại ung thư khác nhau với liều 6g/ngày trong vòng hai tháng cho thấy bệnh được cải thiện đáng kể, kiểm tra tế bào bạch cầu thấy tăng cao ở các bệnh nhân có khối u giảm 50%

Điều tiết khả năng miễn dịch: khi các bệnh nhân bị thiếu khả năng miễn dịch, như ở bệnh nhân ung thư, viêm gan B và HIV được sử dụng Đông trùng hạ thảo hỗ trợ điều trị, kết quả cho thấy số lượng và tác động của bạch cầu trong máu tăng Ngược lại, với bệnh nhân tăng miễn dịch quá cao như bệnh bạch cầu lympho hoặc thấp khớp khi dùng Đông trùng hạ thảo cho thấy số lượng và tác động của bạch cầu trong máu giảm và số lượng hồng cầu lại tăng

Trang 16

Duy trì lượng cholesterol tốt: Theo một số nghiên cứu C.sinensis có khả năng giảm lượng cholesterol tổng xuống 10-21% và triglycerid xuống 9-26% đồng thời làm tăng hàm lượng cholesterol có tỷ trọng cao (HDL - High density Lipoprotein) từ 27 - 30%

Hỗ trợ các triệu chứng lão hóa: Nghiên cứu lâm sàng trên một số bệnh nhân lớn tuổi bị mệt mỏi và các triệu chứng liên quan đến lão hóa sau khi sử dụng các sản phẩm từ Đông trùng hạ thảo trong 30 ngày Mệt mỏi của họ đã giảm 92%, cảm giác của họ về lạnh giảm 89% và hiện tượng chóng mặt giảm 83%, một số bệnh nhân có vấn đề hô hấp được cải thiện rõ rệt

Cải thiện chức năng tình dục

Một số hợp chất có hoạt tính sinh học được sử dụng nhiều trong lĩnh vực y học như 2’,3’- dideoxyadenosine (được coi là chất antiretroviruses) dùng cho điều trị lây nhiễm HIV (các biệt dược: DidannosineTM hay VidexTM)

Các nghiên cứu cổ truyền cũng như hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật Liều uống ĐTHT an toàn đối với chuột thí nghiệm là trên 45g/1kg thể trọng

Với những tác dụng như trên, Đông trùng hạ thảo được coi là một thần dược được sử dụng rộng rãi trong y học Trong đó, adenosine là thành phần hoạt chất chính để đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo

1 2 Giới thiệu về adenosine

1.2.1 Cấu tạo của adenosine [13], [20], [22]

Adenosine là một nucleoside nhân purin Đây là hợp chất chứa N có cấu trúc phân tử hai vòng gồm một phân tử adenine liên kết với một đường ribose nhờ liên kết β-N9-glycosidic

Công thức phân tử C10H13N5O4, khối lượng phân tử 267,241g/mol

Tên thương mại: adenocard

Công thức cấu tạo của adenosine:

Trang 17

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của adenosine

Adenosine ở dạng bột tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước Độ hòa tan tăng lên

khi nhiệt độ tăng và pH giảm

1.2.2 Chuyển hóa và tác dụng của adenosine [1], [7], [13], [20]

Trong cơ thể, adenosine được tạo thành do sự thủy phân AMP bởi enzym nucleotidase, một phần bị chuyển hóa ngược trở lại tạo thành AMP bởi enzym adenosine kinase, một phần chuyển hóa thành inosine nhờ enzym adenosine deaminase, sau đó chuyển hóa thành hypoxanthine nhờ enzym nucleosidase và thành xanthin nhờ enzym xanthin oxydase, sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hóa

5'-là tạo thành acid uric

Adenosine là một nucleoside nội sinh ảnh hưởng nhiều quá trình sinh lý của

qúa trình trao đổi chất của cơ thể như chuyển hóa năng lượng cũng như truyền tín hiệu cho AMP vòng

* Đặc tính kháng viêm

Adenosine được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể A2A Nồng độ adenosine ngoại bào ở tế bào bình thường là khoảng 300nM Tuy nhiên, để đáp ứng với tổn thương tế bào nồng độ này được nhanh chóng nâng lên

600 - 1200nM Vì vậy, chức năng chính của adenosine là ngăn ngừa tổn thương mô

vành, mạch não và điều hòa nhịp tim

Trang 18

* Tác dụng trên tim

Adenosine trực tiếp kiểm soát các chức năng của mô tim, đồng thời nó có khả năng bảo vệ tim chống lại một số chuyển hóa có hại bằng cách giảm sự trao đổi chất tại cơ tim và tăng lưu lượng máu ở động mạch vành

Adenosine được coi là thuốc điều trị hiệu quả rối loạn nhịp nút nhĩ – thất, rối loạn nhịp trên thất cấp Hồi phục được nhịp xoang ở người bị rối loạn nhịp nhanh trên thất kịch phát

* Tác dụng trên phổi

Adenosine có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau liên quan đến viêm đường hô hấp như bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa acid, tế bào lympho và đại thực bào

* Tác dụng trên hệ thống thần kinh trung ương

Adenosine có tác dụng tốt với rối loạn thần kinh như: thiếu não cục bộ, động kinh, các bệnh thoái hóa thần kinh và đau dây thần kinh Vì vậy, adenosine đã được

sử dụng nhiều trong y học để sản xuất thuốc dùng để điều trị rối loạn nhịp tim, thuốc chống loạn nhịp tim, bệnh liên quan đến hệ thống thần kinh

cloroform-ethylacetate-isopropanol-L.Wuqing và cộng sự [8] xác định adenosine trong viên nang Jinshuibao Adenosine được tách trên bản mỏng silica GF254 – CMC - Na2HPO4 với dung môi

Trang 19

tương tự như trên, phát hiện tại 2 bước sóng là 260nm và 300nm Đường chuẩn được xây dựng trong khoảng 0,65 - 5,2μg với r = 0,9995, độ thu hồi của phương pháp là 99,5% và hệ số biến thiên 3,7 %

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản (CE) [6], [12]

Li Hai Ying và cộng sự [12] đã tách và định lượng adenosine, adenin, uridine bằng dung dịch đệm dinatri tetraborat 15mM và natridihydrophosphat 14mM (pH = 9,5) với 5% MeOH theo thể tích, điện thế 18kV và detector UV bước sóng 254nm

Hệ số tương quan của phương pháp R≥ 0,9985

Feng-Qing Yang và cộng sự [6] đã tiến hành xác định 12 nucleoside và nucleobase (cytosine, adenine, guanine, cytidine, cordycepin, adenosine, hypoxanthine, guanosine, inosine, 2-deoxyuridine, uridine và thymidine) trong một

số loài Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS) Mẫu được hòa tan bằng H2O 950C, rung siêu âm ở nhiệt độ 75oC trong 30 phút Sau

đó đưa dịch chiết về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,25μm Dịch chiết được bơm vào hệ thống CE-MS với pha động là đệm formic 10mM chứa 10% methanol, tốc

độ dòng 3μL/phút Phương pháp cho kết quả hàm lượng nucleoside và nucleobase

trong cordyceps sinensis là 9138 ± 4823μg/g cao hơn so với C.militaris là 3722 ±

1446μg/g

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng [9], [11], [17], [24], [25]

Lan -Fang Huang và cộng sự [9] đã tiến hành xác định thành phần hoạt tính

của Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris gồm adenin, hypoxanthin,

cordycepin và các sản phẩm chuyển hóa của nó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI-MS Phương pháp sử dụng pha động gồm H2O, methanol và acid formic với tỷ lệ 85 : 14 : 1 (theo thể tích), cột VP - ODS (2,0 x 150mm) của hãng Shimadzu, lựa chọn ion [M + H]+ tại m/z là 136, 137, 268, 252, 302 để phân tích định lượng cho 4 thành phần hoạt tính Đường chuẩn được xây dựng cho adenin với nồng độ từ 1,4 - 140μg/mL, hypoxanthine từ 0,6 - 117,5μg/mL, cho adenosine từ 0,5 - 128,5μg/mL và cordycepin từ 0,5 - 131,5μg/mL Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của adenin là 0,5 và 1,4μg/mL, hypoxanthin là 0,2 và 0,6μg/mL,

Trang 20

adenosine và cordycepin là 0,1 và 0,5μg/mL Độ thu hồi của phương pháp trong khoảng 93,7 - 107%

Xiao Feng Xue và cộng sự [25] tiến hành phân tích adenosine trong sữa ong chúa Adenosine được chiết bằng ethanol : H2O tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích Dịch chiết mẫu được bơm vào hệ thống HPLC với cột sắc ký C18 và dung môi gồm 2 kênh: kênh A là acid phosphoric 0,4% và kênh B là MeOH Detector UV bước sóng 257nm Độ thu hồi của phương pháp trong khoảng 91,6 - 98,3% với độ lệch chuẩn nhỏ hơn 5,3% Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng là 0,017 và 0,048μg/mL

Li chen và cộng sự [11] xác định adenosine và cordycepin trong Đông trùng

hạ thảo Mẫu được chiết với H2O, sau đó dịch chiết được phân tích trên cột Eclipse XDB -CN Pha động gồm MeOH : H2O theo tỷ lệ 7 : 93, sử dụng detector PDA tại bước sóng 260nm Phương pháp có độ thu hồi trong khoảng từ 93,8 - 102,9%, với

độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 3,62% Giới hạn định lượng của adenosine và cordycepin là 0,21 và 0,083mg/lít Phương pháp đơn giản, nhanh, độ chính xác cao

và giá thành thấp

Hemanth Kumar, M.Spandana [17] phân tích đồng thời adenosine, cordycepin

và sản phẩm chuyển hóa của cordyceps sinensis bằng phương pháp HPLC Điều

kiện phân tích: cột C18 ProtoSIL (250nm x 4,6mm x 5μm), pha động MeOH : H2O

tỷ lệ 20 : 80 theo thể tích, tốc độ dòng 1mL/phút, detector UV bước sóng 254nm, nhiệt độ buồng cột 300C Hàm lượng của adenosine và cordycepin khoảng 0,288 và 0,346mg/g Độ thu hồi 101,1%, độ lệch chuẩn tương đối là 1,33%

Theo dược điển Trung Quốc [24], adenosine được chiết tách từ nguồn nguyên liệu Đông trùng hạ thảo như sau: cân chính xác 0,5g mẫu cho vào bình cầu, thêm 10mL MeOH 90%, đậy nắp, lắc đều, gia nhiệt và đun hồi lưu trong 30 phút, làm nguội, thêm methanol 90% đến lượng chính xác, lắc đều, lọc Chạy sắc ký với điều kiện như sau: pha động là đệm phosphat (pH = 6,5) và MeOH tỷ lệ 17 : 3, cột pha tĩnh octandecylsilane, phát hiện tại bước sóng 260nm

Trang 21

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng [2], [3], [4]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.4.1.1 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

1.4.1.2 Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

+ Pha động phải trơ với pha tĩnh

+ Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

+ Hoà tan được mẫu

+ Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại:

Trang 22

+ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược

+ Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…

Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi

+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp chất có tính dẫn điện…

+ Detector PDA: dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ của hợp chất có trong hỗn hợp mà chùm tia bức xạ chiếu qua Dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ, xác định được chất phân tích

1.4.1.4 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

- Phần tách là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ

Trang 23

- Phần phát hiện và xử lí số liệu gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1.4.2 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [2], [3]

Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp

Hình 1.6 Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký

Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, so sánh hoặc thêm chuẩn

* Phương pháp đường chuẩn

- Pha chế một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau

- Đo đáp ứng Si của các dung dịch chuẩn và lập đường cong phụ thuộc của S vào C:

S = f(C)

- Chọn khoảng nồng độ phụ thuộc tuyến tính

- Đo tín hiệu đáp ứng Sx và nội suy nồng độ Cx từ đường chuẩn

Trang 24

* Phương pháp so sánh

- Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn

- Đo mật độ quang của dung dịch cần xác định X

- Tính nồng độ của dung dịch X theo công thức sau:

ch

ch X X D

C D

* Phương pháp thêm chuẩn

- Đo cường độ đáp ứng của mẫu phân tích Sx

- Pha chế một số dung dịch có nồng độ Cx

- Đo nồng độ chất chuẩn đối chiếu CR khác nhau: Cx + CR, i

- Đo đáp ứng của các dung dịch Si

- Xây dựng đồ thị sự phụ thuộc Si = f(CR,i)

- Chọn khoảng phụ thuộc tuyến tính Tính nồng độ Cx

Trang 25

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu: TPCN có chứa ĐTHT

2.2 Hóa chất và dụng cụ

2.2.1 Thiết bị

siêu âm có chế độ gia nhiệt, cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg), cân

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

* Chuẩn adenososine từ sigma aldrich độ tinh khiết ≥ 99%

- Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/mL: cân chính xác khoảng 0,1000g adenosine chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác 10-4, hòa tan và định mức 100mL bằng H2O Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian (200µg/mL): lấy 2mL dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10mL và định mức tới vạch bằng H2O

- Các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0µg/mL được pha trong H2O

* Các loại hóa chất, dung môi khác:

- Methanol (Merck 99,9%), n-hexan (Merck 99,9%), ethanol (Merck 99,9%), diethyl ether (Merck 99,9%), ether dầu hỏa (Merck 99,9%), ethyl acetate (Merck 99,9%)…

Trang 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

- Đối tượng mẫu: TPCN có chứa ĐTHT

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Địa điểm lấy mẫu: thành phố Hà nội

- Khối lượng mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu

- Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường

2.3.2 Phương pháp phân tích

Nguyên lý: Adenosine được hòa tan trong dung môi phù hợp, tiến hành rung siêu âm, ly tâm Dịch chiết được định mức 50mL, lọc và bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA

* Quy trình tóm tắt:

- Mẫu được đồng nhất kỹ

- Cân mẫu vào ống ly tâm, với nền mẫu chứa nhiều béo cần loại béo trước khi phân tích

- Thêm dung môi chiết mẫu vào ống ly tâm

- Lắc vortex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều

- Rung siêu âm để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi chiết

- Để nguội đến nhiệt độ phòng

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và lắng phần bã

- Chiết lặp mẫu với dung môi trên

- Gộp dịch chiết mẫu và định mức đến vạch

- Lọc

- Bơm vào hệ thống HPLC

Trang 27

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến

2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [5]

Sau khi xây dựng phương pháp phân tích cần phải được thẩm định theo quy định của USFDA, AOAC, USP các thông số cần thẩm định bao gồm:

- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc (Specifility/Selectivity)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration)

- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng (Limit of Quatification – LOQ)

- Độ đúng (Trueness)

- Độ chụm (Precision)

- Độ ổn định của phương pháp (Robustness/Ruggeness)

Dung môi chiết

Chiết lặp

HPLC Định mức

Siêu âm

Dịch chiết

Ly tâm

Lắc vortex Loại béo (nếu cần)

Lọc Cân mẫu

Cặn

Trang 28

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào: Kỹ thuật áp dụng, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm Trong phạm vi và thời gian nghiên cứu, chúng tôi thực hiện thẩm định phương pháp thông qua việc đánh giá các thông số: Tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu suất thu hồi), độ chụm (thông qua độ lặp lại)

Trang 29

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích

Chúng tôi tiến hành phân tích adenosine trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector PDA với các điều kiện như sau:

Chất phân tích sau khi được tách khỏi cột sắc ký, được dẫn vào flowcell của đầu đo và được chiếu bởi một chùm tia tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

Trang 30

sử dụng rộng rãi, do tính phổ biến, tính kinh tế và có hiệu quả cao Do đó, chúng tôi lựa chọn hệ sắc ký pha đảo, khảo sát khả năng tách của chất phân tích trên một số cột C18 và cố định các điều kiện phân tích khác với nồng độ adenosine 10,5ppm:

Hình 3.2 Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C 18

Hình 3.3 Sắc đồ phân tích trên cột Symmetry C 18

Trang 31

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích trên cột IntertSustain C 18

Với cột X-Brigde C18, thời gian lưu ngắn (khoảng 3,5 phút), do đó khi phân tích trên nền mẫu thực sẽ bị ảnh hưởng bởi tạp chất do không tách được chất phân tích và tạp chất Hơn nữa, cột X-Brigde C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm) có kích

thước hạt nhỏ nên áp suất của cột cao có hại cho bơm và hệ thống sắc ký Nếu hoạt động liên tục ở áp suất cao như vậy, bơm dễ xảy ra hiện tượng áp suất không ổn định dẫn đến tốc độ dòng không ổn định

chân peak doãng, thời gian lưu ngắn (khoảng 6,1 phút) Như vậy, khi phân tích trên nền mẫu thực có thể chất phân tích bị lẫn peak tạp hoặc sẽ bị dính peak

Khi sử dụng cột IntertSustain C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) tín hiệu peak

nhọn, cân đối, độ rộng chân peak nhỏ khoảng 0,2 phút, thời gian lưu 10,3 phút Vì

vậy khi phân tích trên nền mẫu thực, chất phân tích có thể được tách tốt, tránh được hiện tượng chồng peak, dính peak với các tạp chất khác Do đó, trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng cột IntertSustain C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) để tách và định lượng adenosine đồng thời tiến hành các khảo sát tiếp theo

3.2.2 Khảo sát thành phần pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc

ký Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của peak sắc ký

Trang 32

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu các pha động khác nhau gồm: Kênh A là

H2O, kênh B là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác

Quá trình khảo sát cho kết quả như sau:

Peak rất nhọn, cân đối, độ rộng chân peak nhỏ, tín hiệu chất phân tích cao hơn, tín hiệu nhiễu đường nền rất thấp

Hình 3.5 Sắc đồ phân tích sử dụng pha động H 2 O và ACN

Trang 33

Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy:

Có thể sử dụng cả 2 dung môi là MeOH và ACN để tách và định lượng adenosine Tuy nhiên, khi sử dụng MeOH tín hiệu peak rất nhọn, cân đối, độ nhạy cao, nhiễu đường nền thấp hơn so với dung môi ACN Hơn nữa, giá trị kinh tế mang lại khi sử dụng dung môi MeOH lớn hơn rất nhiều so với dung môi là ACN

Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng MeOH làm thành phần pha động để phân tích adenosine

3.2.3 Khảo sát chương trình rửa giải gradient

Trong thành phần cấu tạo của Đông trùng hạ thảo có chứa rất nhiều các chất thuộc nhóm nucleoside có tính chất tương tự nhau, nếu chỉ rửa giải chất phân tích theo chương trình cố định pha động, các chất trong nhóm có thể có cùng thời gian lưu dẫn đến hiện tượng chồng peak hoặc dính peak Do vậy, để tăng độ nhạy của tín hiệu peak, tăng khả năng tách sắc ký, tránh hiện tượng doãng peak, chồng peak, dính peak, chúng tôi khảo sát chương trình gradient để tách và định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo và cố định các thông số khác

Ngày đăng: 29/07/2015, 08:43

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích phần 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hóa học phân tích phần 2
Tác giả: Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung
Nhà XB: Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật
Năm: 2007
3. Cao Minh Quang (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao, Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tác giả: Cao Minh Quang
Nhà XB: Nhà xuất bản Y học
Năm: 2006
4. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Giáo trình Các phương pháp tách
Tác giả: Nguyễn Văn Ri
Năm: 2009
5. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội.Tiếng Anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh
Tác giả: Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia
Nhà XB: Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật
Năm: 2010
6. Feng-Qing Yang, Liya Ge, Jean Wan Hong Yong, Swee Ngin Tan, Shao- Ping Li (2009),"Determination of nucleosides and nucleobases in different species if Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50, 307-314 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination of nucleosides and nucleobases in different species if Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry
Tác giả: Feng-Qing Yang, Liya Ge, Jean Wan Hong Yong, Swee Ngin Tan, Shao- Ping Li
Năm: 2009
7. J. Zhao, J. Xie, L.Y. Wang, S.P. Li (2013), "Advanced development in chemical analysis of Codyceps", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Sách, tạp chí
Tiêu đề: Advanced development in chemical analysis of Codyceps
Tác giả: J. Zhao, J. Xie, L.Y. Wang, S.P. Li
Năm: 2013
8. L. Wuqing, Long Xinhua, et al (1996), "Determination of adenosin in Jinshuibao capsule by TLC scanning", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 1 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination of adenosin in Jinshuibao capsule by TLC scanning
Tác giả: L. Wuqing, Long Xinhua, et al
Năm: 1996
9. Lan-Fang Huang, Yi-Zeng Liang, Fang-Qui Guo, Zhi-Feng Zhou, Ben-Mei Cheng (2003), "Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 33, 1155-1162 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS
Tác giả: Lan-Fang Huang, Yi-Zeng Liang, Fang-Qui Guo, Zhi-Feng Zhou, Ben-Mei Cheng
Năm: 2003
10. Lei Huang, Qizahang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009), "Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp.", African Journal of Microbiology Research, Vol. 3, 957-961 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp
Tác giả: Lei Huang, Qizahang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou
Năm: 2009
11. Li Chen, Yan Aiguo, Cai Chunyan, Liu Zhiping (2012), "Fast determination of adenosine and cordycepin in Cordyceps and its deserted solid medium", Chinese Journal of Chromatography,Vol. 30 Issue (07), 711-715 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Fast determination of adenosine and cordycepin in Cordyceps and its deserted solid medium
Tác giả: Li Chen, Yan Aiguo, Cai Chunyan, Liu Zhiping
Năm: 2012
12. Li Hai Ying, Yang Geng Liang, Wang De Xian, Liu Hai Yan, Li Bao Hui (2001), "Determination of the active components in artificial cordyceps by capillary zone electrophoresis", Journal of Hebei University (Natural Science Edition) Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination of the active components in artificial cordyceps by capillary zone electrophoresis
Tác giả: Li Hai Ying, Yang Geng Liang, Wang De Xian, Liu Hai Yan, Li Bao Hui
Năm: 2001
13. Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria, Riccardo Polosa (2006), "Adenosine in the airways: Implications and applications", European Journal of Pharmacology, 533, 77-88 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Adenosine in the airways: Implications and applications
Tác giả: Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria, Riccardo Polosa
Năm: 2006
14. M.G. Shashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar, B. Manohar (2013), "Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement - A review", Journal of Functional foods Sách, tạp chí
Tiêu đề: Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement - A review
Tác giả: M.G. Shashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar, B. Manohar
Năm: 2013
15. Ma Yan, Wang Yu, Yang Guang-zhao, Yu Rong-min (2008), "Determination of nucleosides in Cordyceps sinensis preparation by dual- wavelength TLC-scanning", China Pharmacy, 30 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination of nucleosides in Cordyceps sinensis preparation by dual-wavelength TLC-scanning
Tác giả: Ma Yan, Wang Yu, Yang Guang-zhao, Yu Rong-min
Năm: 2008
16. Mizuno T. (1999), "Medicinal effects and utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr. (Mitosporicfungi) Chinese caterpillar fungi", International Journal of Medicinal Mushrooms, 1, 251-262 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Medicinal effects and utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr. (Mitosporicfungi) Chinese caterpillar fungi
Tác giả: Mizuno T
Năm: 1999
17. Mr. Hemanth Kumar, M. Spandana (2013), “Simultaneous extraction, determination and analysis of adenosine, cordycepin and other derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC method”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Volume 2, Issue 4 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Simultaneous extraction, determination and analysis of adenosine, cordycepin and other derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC method”, "Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry
Tác giả: Mr. Hemanth Kumar, M. Spandana
Năm: 2013
18. Nakamura K., Konoha K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M. (2003), "Combined effects of Cordyceps sinensis and methotrexate on hematogenic lung metastasis in mice", Recept. Chan, 9, 329-334 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Combined effects of Cordyceps sinensis and methotrexate on hematogenic lung metastasis in mice
Tác giả: Nakamura K., Konoha K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M
Năm: 2003
21. R. Russell, M. Paterson (2008), "Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?", Phytochemistry, 69, 1469- 1495 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory
Tác giả: R. Russell, M. Paterson
Năm: 2008
22. Richard Alan Miller (2009), "The Codyceps sinensis medicinal mushroom", Nexusmagazine Sách, tạp chí
Tiêu đề: The Codyceps sinensis medicinal mushroom
Tác giả: Richard Alan Miller
Năm: 2009
23. S.P. Li, F.Q. Yang, Karl W.K. Tsim (2006). "Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 1571-1584 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine
Tác giả: S.P. Li, F.Q. Yang, Karl W.K. Tsim
Năm: 2006

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w