Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.4.1.1. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP- HPLC).
+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)
+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37
Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực. Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế.
1.4.1.2. Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh
+ Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký + Hoà tan được mẫu
+ Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector Có thể chia pha động làm hai loại:
+ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược.
+ Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…
Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là gradient pha động.
1.4.1.3. Detector trong sắc ký
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp
+ Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (Vis).
+ Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp chất có tính dẫn điện…
+ Detector PDA: dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ của hợp chất có trong hỗn hợp mà chùm tia bức xạ chiếu qua. Dựa vào sự thay đổi cường độ bức xạ, xác định được chất phân tích.
1.4.1.4. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.
- Phần tách là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lí số liệu gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 1.4.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [2], [3]
Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất. Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp.
Hình 1.6. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký
Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, so sánh hoặc thêm chuẩn.
* Phương pháp đường chuẩn
- Pha chế một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau
- Đo đáp ứng Si của các dung dịch chuẩn và lập đường cong phụ thuộc của S vào C:
S = f(C) - Chọn khoảng nồng độ phụ thuộc tuyến tính
- Đo tín hiệu đáp ứng Sx và nội suy nồng độ Cx từ đường chuẩn
* Phương pháp so sánh
- Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn - Đo mật độ quang của dung dịch cần xác định X - Tính nồng độ của dung dịch X theo công thức sau:
ch ch X
X D
C C D .
* Phương pháp thêm chuẩn
- Đo cường độ đáp ứng của mẫu phân tích Sx. - Pha chế một số dung dịch có nồng độ Cx
- Đo nồng độ chất chuẩn đối chiếu CR khác nhau: Cx + CR, i
- Đo đáp ứng của các dung dịch Si - Xây dựng đồ thị sự phụ thuộc Si = f(CR,i)
- Chọn khoảng phụ thuộc tuyến tính. Tính nồng độ Cx