Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.6.4. Thẩm định phương pháp
Sau khi xây dựng quy trình phân tích, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo AOAC. Các tiêu chí thẩm định đều đạt theo yêu cầu của AOAC, khoảng tuyến tính của phương pháp rộng, cho phép định lượng adenosin trong các đối tượng đa dạng, hạn chế sai số khi phải làm giàu mẫu hoặc pha loãng mẫu.
3.6.5. Kết quả phân tích mẫu thực
Do chưa có tiêu chuẩn cho các sản phẩm của đông trùng hạ thảo nên trong nghiên cứu này chúng tôi tạm thời chấp nhận chế phẩm đạt yêu cầu khi hàm lượng nằm trong khoảng 90 – 110% so với hàm lượng ghi nhãn. Với điều kiện đó, có 57,1% chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng.
Như vậy, một lượng không nhỏ sản phẩm không đạt yêu cầy hoặc không công bố hàm lượng, vì vậy chúng tôi cho rằng cần phải kiểm soát chặt chẽ các sản phẩm thực phẩm chức năng hơn nữa.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định hàm lượng adenosine trong TPCN có chứa ĐTHT bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA, chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
1. Tối ưu hóa được các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao cho xác định adenosine trong TPCN bao gồm:
- Khảo sát và tìm được các điều kiện tối ưu cho phân tích sắc ký: cột sắc ký Intersustain C18 (250mm ì 4,6mm ì 5àm); pha động gồm 2 kờnh: kờnh A là H2O, kênh B là MeOH; chương trình rửa giải gradient, detector PDA bước sóng 260nm.
- Xây dựng được quy trình chiết mẫu: Mẫu được loại béo bằng n-hexan (nếu mẫu chứa béo). Sau đó, chiết trong hỗn hợp H2O : MeOH tỷ lệ 9 : 1, sử dụng máy rung siêu âm có cài đặt nhiệt độ 100oC, chiết lặp 2 lần, với tổng thời gian 30 phút.
2. Xây dựng được đường chuẩn từ 0,105 - 210μg/mL, phương pháp có giới hạn phát hiện 14 - 20μg/kg hoặc μg/L và giới hạn định lượng tương ứng từ 46,67 – 66,67μg/kg hoặc μg/L tùy từng nền mẫu, độ lệch chuẩn tương đối từ 1,11 – 5,20%
và độ thu hồi 85,95 – 104,80%.
3. Đã phân tích trên 20 mẫu TPCN có chứa ĐTHT đang lưu thông trên thị trường Hà Nội. Kết quả phân tích cho thấy có 57,1% mẫu có hàm lượng adenosine đạt so với công bố trên nhãn. Các sản phẩm còn lại không đạt hoặc không công bố cụ thể hàm lượng chất chính này.
Từ các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy phương pháp phân tích đơn giản, có độ nhạy đạt yêu cầu, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng để kiểm nghiệm rộng rãi tại các phòng thí nghiệm có thiết bị HPLC với độ tin cậy cao.
Trong tương lai, chúng tôi sẽ tiếp tục mở rộng phương pháp phân tích đồng thời nhiều chất khác thuộc nhóm nucleosides. Và tiếp tục mở rộng đối tượng phân tích, không chỉ trong phạm vi TPCN mà trên các đối tượng sản phẩm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà nội.
2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích phần 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội.
3. Cao Minh Quang (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao, Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội.
5. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà nội.
Tiếng Anh
6. Feng-Qing Yang, Liya Ge, Jean Wan Hong Yong, Swee Ngin Tan, Shao- Ping Li (2009),"Determination of nucleosides and nucleobases in different species if Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50, 307-314.
7. J. Zhao, J. Xie, L.Y. Wang, S.P. Li (2013), "Advanced development in chemical analysis of Codyceps", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.
8. L. Wuqing, Long Xinhua, et al (1996), "Determination of adenosin in Jinshuibao capsule by TLC scanning", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 1.
9. Lan-Fang Huang, Yi-Zeng Liang, Fang-Qui Guo, Zhi-Feng Zhou, Ben-Mei Cheng (2003), "Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 33, 1155-1162.
10. Lei Huang, Qizahang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009), "Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp.", African Journal of Microbiology Research, Vol. 3, 957-961.
11. Li Chen, Yan Aiguo, Cai Chunyan, Liu Zhiping (2012), "Fast determination of adenosine and cordycepin in Cordyceps and its deserted solid medium", Chinese Journal of Chromatography,Vol. 30 Issue (07), 711-715
12. Li Hai Ying, Yang Geng Liang, Wang De Xian, Liu Hai Yan, Li Bao Hui (2001), "Determination of the active components in artificial cordyceps by capillary zone electrophoresis", Journal of Hebei University (Natural Science Edition).
13. Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria, Riccardo Polosa (2006), "Adenosine in the airways: Implications and applications", European Journal of Pharmacology, 533, 77-88.
14. M.G. Shashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar, B. Manohar (2013),
"Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement - A review", Journal of Functional foods.
15. Ma Yan, Wang Yu, Yang Guang-zhao, Yu Rong-min (2008),
"Determination of nucleosides in Cordyceps sinensis preparation by dual- wavelength TLC-scanning", China Pharmacy, 30.
16. Mizuno T. (1999), "Medicinal effects and utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr. (Mitosporicfungi) Chinese caterpillar fungi", International Journal of Medicinal Mushrooms, 1, 251-262.
17. Mr. Hemanth Kumar, M. Spandana (2013), “Simultaneous extraction, determination and analysis of adenosine, cordycepin and other derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC method”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Volume 2, Issue 4.
18. Nakamura K., Konoha K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M. (2003), "Combined effects of Cordyceps sinensis and methotrexate on hematogenic lung metastasis in mice", Recept. Chan, 9, 329-334.
19. Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Kwon Y.M., Shinozuka K., Kunitomo M. (1999), "Inhibitory effect of Cordycceps sinensis on spontaneous liver metastasis of lewis lung carcinoma and B16 melanoma cells in syngeneic
mice ", Jpn. J. Pharmacol, 79, 335-341.
20. R. Guieu, B. Dussol, G. Halimi, G. Bechis, F. Sampieri, Y. Berland, J.
Sampol, F. Couraud and H. Rochat (1998), "Adenosine and the Nervous System:
Pharmacological data and therapeutic perspectives", Gen. Pharmac., Vol. 31, No.
4, 553-561.
21. R. Russell, M. Paterson (2008), "Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?", Phytochemistry, 69, 1469- 1495.
22. Richard Alan Miller (2009), "The Codyceps sinensis medicinal mushroom", Nexusmagazine.
23. S.P. Li, F.Q. Yang, Karl W.K. Tsim (2006). "Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 1571-1584.
24. The Ministry of Health of the People's Republic of China (2010), The Pharmacopoeia of the People's Republic of China (PPRC).
25. Xiao Feng Xue, Jin Hui Zhou, Li Ming Wu, Liang Hu Fu, Jing Zhao (2009), "HPLC determination of adenosine in royal jelly", Food Chemistry, 115(2), 715-719.
Hình A1.1. Hình ảnh của Cordyceps capitata
Hình A1.2. Hình ảnh của Cordyceps ditmarri
Hình A1.3. Hình ảnh của Cordyceps gracilis và Cordyceps sphecophata
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0
500 1000 1500 2000
Adenosine/10.316/16570
Hình A2.1. Sắc đồ chuẩn 263ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0 500 1000 1500 2000
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.311/15379030
Hình A2.2. Sắc đồ chuẩn 210ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0 250 500
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.331/3616964
Hình A2.3. Sắc đồ chuẩn 50,30ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0
50 100
Adenosine
Hình A2.4. Sắc đồ chuẩn 21,00ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0 25 50 75 100 125
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.321/744575
Hình A2.5. Sắc đồ chuẩn 10,50ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0 25 50
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.309/371489
Hình A2.6. Sắc đồ chuẩn 5,03ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -5
0 5 10
Adenosin
Hình A2.7. Sắc đồ chuẩn 2,10ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
-2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.311/74495
Hình A2.8. Sắc đồ chuẩn 1,05ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 2.5 5.0
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.307/37186
Hình A2.9. Sắc đồ chuẩn 0,50ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -1
0 1
Adenosine/10.3
Hình A2.10. Sắc đồ chuẩn 0,21ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
-1.0 -0.5 0.0 0.5
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.318/7771
Hình A2.11. Sắc đồ chuẩn 0,105ppm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0
100 200 300
Adenosine/10.177/3
Hình A3.1. Sắc đồ mẫu 08131791nk
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
0 50 100 150 200 250 300
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.175/77607
Hình A3.2. Sắc đồ mẫu 11131425dv
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
0 100 200 300 400
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.171/368538
Hình A3.3. Sắc đồ mẫu 2116nk
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0
25 Adenosin
Hình A3.4. Sắc đồ mẫu 83-2dv
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
0 25 50 75
mAU
260nm4nm (1.00)
Adenosine/10.208/203402
Hình A3.5. Sắc đồ mẫu 776nk
Giá trị trung bình
n i x
x
n
i
1
x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi, dùng để ước lượng xu hướng của giá trị trung tâm (giá trị thực).
Độ lệch chuẩn SD SD
1 )
( 2
n
x xi tb
SD nói lên mức độ dao động của các kết quả đo xi xung quanh giá trị trung bình, thể hiện sự sai lệch phân tán của một dãy kết quả thí nghiệm so với giá trị trung bình của nó.
Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
% 100
% xtb
RSD SD
Biểu thị sự biến động, phân tán của các kết quả thí nghiệm.
Đánh giá độ chụm:
Nếu theo 1 tiêu chuẩn hoặc 1 quy trình chính thống có công bố RSD (%) thì RSD (%) tính được phải nhỏ hơn hoặc bằng RSD (%) cho phép.
Nếu theo 1 tiêu chuẩn, 1 quy trình chính thống không công bố thì người ta thường so sánh RSD (%) tính được so với RSD (%) cho phép ở nồng độ chất tương ứng theo AOAC. RSD (%) tính được không được lớn hơn trị giá trong bảng ở hàm lượng chất tương ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn.
Bảng B1.1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)
1 100 1 100% 1,3
2 10 10-1 10% 1,8
3 1 10-2 1% 2,7
6 0,001 10-5 10ppm 7,3
7 0,0001 10-6 1 ppm 11
8 0,00001 10-7 100ppb 15
9 0,000001 10-8 10ppb 21
10 0,0000001 10-9 1ppb 30
Phụ lục B2: Đánh giá độ thu hồi
Thông thường độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng cho phép của AOAC ở nồng độ chất tương ứng. Trong trường hợp phân tích các chất hàm lượng vết có thể tham khảo tiêu chuẩn của hội đồng châu Âu.
Bảng B2.1. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
1 100 1 100% 98-102
2 10 10-1 10% 98-102
3 1 10-2 1% 97-103
4 0,1 10-3 0,1% 95-105
5 0,01 10-4 100ppm 90-107
6 0,001 10-5 10ppm 80-110
7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110
8 0,00001 10-7 100ppb 80-110
9 0,000001 10-8 10ppb 60-115
10 0,0000001 10-9 1ppb 40-120
Còn ở châu Âu thì độ thu hồi cho phép theo bảng như sau: