Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được Bảng 3.3 Kết quả định lượng sibutramin trong nang cứng NC07 Bảng 3.4 Kết quả định lượng sibutramin trong n

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ MINH HẰNG

XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ MINH HẰNG

XÁC ĐỊNH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM GIẢM BÉO BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

TS Lê Đình Chi

TS Lê Thị Hồng Hảo ThS Cao Công Khánh

là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ - Hà Nội

đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo

và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo

và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn các thành viên trong Nhóm Tải Báo đã hướng dẫn và giúp tôi tìm tài liệu để hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2014

Sinh viên

Dương Thị Minh Hằng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét chung về chất giảm béo 2

1.2 Tổng quan về sibutramin 2

1.2.1 Cấu trúc- tính chất lý hóa 2

1.2.2 Tính chất dược động học, tác dụng dược lý 3

1.2.3 Một số phương pháp phân tích sibutramin 5

1.3 Tổng quan về HPLC 8

1.3.1 Khái niệm chung 8

1.3.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 8

1.3.3 Thiết bị sắc ký lỏng 10

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Nguyên vật liệu - thiết bị 15

2.2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2.2.Thiết bị 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC 16

2.4.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18

2.4.3 Thẩm định quy trình 19

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Thực nghiệm và kết quả 20

3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích sibutramin 20

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu để chiết sibutramin trong thực phẩm giảm béo 24

3.1.3 Thẩm định phương pháp 28

3.1.4 Kết quả áp dụng phương pháp xác định sibutramin trong một số sản phẩm 36

3.2 Bàn luận 37

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Kiến nghị 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT

Analytical Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

thực phẩm

Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được

Bảng 3.3 Kết quả định lượng sibutramin trong nang cứng NC07

Bảng 3.4 Kết quả định lượng sibutramin trong nang mềm NM07

Bảng 3.7 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường

Bảng 3.8 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 32 Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 33 Bảng 3.10 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 34 Bảng 3.11 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 34 Bảng 3.12 Kết quả phân tích sibutramin trong các thực phẩm

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 10

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin với pha

Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL 25

Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết bằng

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 100 µg/mL 26

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu nang mềm chiết bằng dung môi

Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải 28 Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 200 µg/mL 29

Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không

Hình 3.15 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không

chứa sibutramin được thêm chuẩn sibutramin 29

Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,5 µg/mL 35 Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramin 0,2 µg/mL 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Béo phì là một vấn đề sức khỏe trên toàn thế giới, nó có thể tác động không tốt đến chất lượng cuộc sống Báo cáo gần đây nhất của WHO đã chỉ ra rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được xếp vào lớp thừa cân; trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu phụ nữ đã béo phì Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3 tỉ người thừa cân và trên

700 triệu người béo phì Một số liệu khác cho thấy gần 43 triệu trẻ em dưới 5 tuổi đã bị thừa cân vào năm 2010 [25] Chính vì thế nhu cầu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên Phương pháp điều trị giảm béo chính là ăn kiêng kết hợp hoạt động thể lực, và thuốc điều trị béo phì cũng được sử dụng để tăng cường tác dụng Thực phẩm chức năng giảm béo tự nhiên ra đời như một lựa chọn thay thế cho thuốc giảm béo tổng hợp và trở thành biện pháp tốt hơn bởi lẽ theo một cách tổng quát thì chúng an toàn hơn Song tác dụng của những sản phẩm đó lại thấp hơn những tác nhân giảm béo tổng hợp, do vậy để tăng hiệu quả, chúng thường được cho thêm những chất hóa học giảm béo hiệu quả khác một cách bất hợp pháp, trong đó có sibutramin là chất đã bị cấm sử dụng [4], [12], [16] Do đó việc phát hiện được sibutramin có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sản phẩm này Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, đề tài “Xác định sibutramin trong thực phẩm giảm béo bằng HPLC” được tiến hành nhằm:

- Xây dựng phương pháp phát hiện sibutramin có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào kiểm tra sibutramin trong một số mẫu thực phẩm giảm béo thiên nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chung về chất giảm béo

Những chất giảm béo sử dụng đầu tiên gồm có nhóm các chất cường adrenalin (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol, diethylpropion, phenylpropanolamin) và nhóm chất cường serotonin (fenfluramin, dexfenfluramin) Tuy nhiên, phenylpropanolamin - một tác nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cấm lưu hành tại thị trường Mỹ vào tháng 10 năm 2000 do báo cáo tăng nguy cơ biến cố mạch máu não như xuất huyết đột quỵ khi nó được sử dụng như một chất giảm cân ở phụ nữ [14] Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc dù cũng có hiệu quả trong việc

hỗ trợ giảm cân nhưng chúng cũng đã bị cấm lưu hành trên thị trường Mỹ từ tháng 9 năm 1997 do các báo cáo về thay đổi van tim và tăng huyết áp động mạch phổi [15] Sibutramin (thuộc nhóm chất ức chế tái thu hồi serotonin-noradrenalin) chính thức được lưu hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó

nó đã được sử dụng cho điều trị béo phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới

Sibutramin đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo phì Các dữ liệu lâm sàng trong một và hai năm đã chứng minh rằng sibutramin, cùng với một chế độ ăn uống ít calo, đã gây ra tác dụng giảm cân ban đầu và bền vững [21] Tuy nhiên sibutramin lại có những tác dụng phụ trầm trọng liên quan đến các nguy cơ tim mạch như tăng nhịp tim, tăng huyết

áp thậm chí là nhồi máu cơ tim [24], do đó nó đã bị cấm lưu hành trên nhiều thị trường như thị trường châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam [4]

1.2 Tổng quan về sibutramin

1.2.1 Cấu trúc- tính chất lý hóa

- Công thức phân tử: C17H26ClN (Khối lượng phân tử: 297,5)

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của sibutramin [5]

- Tên khoa học: cyclobutan-methylamin [5]

(+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N,N-dimethyl Dạng thường dùng: Sibutramin hydroclorid monohydrat

- Độ tan: Độ tan của sibutramin (C17H26ClN) trong nước (pH 7,4) là 0,04 mg/mL, của sibutramin hydrochlorid monohydrat là 5,2 mg/mL Sibutramin base tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [5]

- Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramin base có nhiệt độ nóng chảy là 55.15oC và enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramin hydroclorid monohydrat có nhiệt độ nóng chảy ở 1190C [5]

- Sibutramin base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS Cực đại hấp thụ tại bước sóng 225nm [23]

1.2.2 Tính chất dược động học, tác dụng dược lý

Dược động học [13]

- Hấp thu: Sibutramin hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77%) Thời gian để thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ

- Phân bố: phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô

- Chuyển hóa: Khi dùng đường uống sibutramin bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu Sibutramin được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4 thành hai amin (gọi là chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tương ứng là 14 và 16 giờ Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2 đạt được sau 3-4 giờ

- Thải trừ: Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu

Tác dụng dược lý:

- Sibutramin đã được đánh giá như một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng do các cơ chế đã được chứng minh là tác động đó cũng tương tự như các thuốc chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạn như amitriptylin Tuy nhiên, sibutramin không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao gồm cả buồn ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21]

- Sibutramin là một chất ức chế tái thu hồi serotonin - noradrenalin, thúc đẩy giảm cân ở người béo phì Nó làm giảm cảm giác thèm ăn, cho cảm giác no

và gây ra sự sinh nhiệt [21]

- Trong cơ thể, sibutramin chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-desmethyl sibutramin) và sibutramin tác động dược lý chủ yếu thông qua 2 chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [11], [8]

- Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramin có hiệu quả như một chất giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày [21]

- Tác dụng không mong muốn:

Sibutramin đồng thời cũng kích thích quá mức hệ thần kinh trung ương

và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (cảm giác khác thường như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy

ra Hơn thế nữa nó còn liên quan đến tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim và thường tăng nguy cơ đau tim cũng như đột quỵ [20] Do

những nguy cơ này sibutramin đã bị cấm lưu hành trên thị trường châu Âu từ ngày 21/1/2010 [12].Từ tháng 8 năm 2010, Mỹ đã thêm một chống chỉ định mới cho các bệnh nhân trên 65 tuổi do các tác dụng phụ thực tế qua các nghiên cứu lâm sàng của sibutramin [17] Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa sibutramin đã bị rút số đăng ký lưu hành từ tháng 4/2011 [4]

1.2.3 Một số phương pháp phân tích sibutramin

Đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố đưa ra phương pháp xác định sibutramin sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: GC-MS [22], [9]; HPLC [23], [7], [6], [26]; HPTLC [7]; LC-MS/MS [10]; IR [18]

Bảng 1.1 Tóm tắt các quy trình phân tích sibutramin đã được công bố

lab, Brazil)

-Cột Phenyl Hypersil C18 (250 x 4,6

mm, 5 μm) -Pha động: acetonitril - amoni dihydrophosphat 50 mM, pH 6,0 (35 : 65)

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút -Nhiệt độ cột: 30oC -Detector PDA: 225 nm -Thể tích tiêm mẫu: 20µL

Chiết bằng methanol-nước (65:35) trước khi tiêm sắc ký

Chiết bằng acetonitril - nước (1:1)

và pha loãng trước khi

[7]

-Nhiệt độ cột: 25oC -Detector huỳnh quang (Kích thích

225 nm, bức xạ 316 nm) -Thể tích tiêm mẫu: 5µL

-Pha động: acetonitril - kali dihydrophosphat 0,025M, pH 4,0 (35 : 65)

-Tốc độ dòng: 2,5 mL/phút -Nhiệt độ cột: 25oC

-Detector PDA: 225 nm

-Thể tích tiêm mẫu: 20µL

Chiết bằng methanol trước khi tiêm sắc ký

phosphoric 0,02M, pH 3,0 (tỷ lệ theo gradient)

-Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút -Nhiệt độ cột: 300C

-Detector PDA: 222 nm -Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

Chiết bằng methanol, rung siêu

âm ở 600C, pha loãng, lọc thô

-Pha động: n-hexan - aceton - amoniac (10 : 1 : 0,1)

-Quét sắc đồ ở 225 nm, tốc độ 10 mm/giây

-Hiện vết: Phun thuốc thử Dragendoft

Chiết bằng acetonitril - nước (1 : 1)

sử dụng máy lắc xoáy

[7]

GC-MS Viên nén, -Thiết bị : sắc ký khí HP-6890, Mẫu được [9]

viên

nang, trà

túi

detector HP 5973 -Cột: HP-5-MS (30m×0,25mm, bề dày phase : 0,25mm)

-Chương trình nhiệt độ : bắt đầu ở

110oC, tăng 10 oC/phút đến 280 oC và duy trì trong 3 phút

-Khí mang: Heli với tốc độ 0,6 ml/phút

-Phổ được thu thập trong khoảng m/z

từ 40 - 400

hòa trong nước, kiềm hóa bằng Natri carbonat đến

pH 10 Chiết bằng methyl chlorid, sau khi tách các lớp, làm khô bằng natri sulphat khan rồi phân tích bằng GC-

-Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút -Nhiệt độ cột: 200C

-Thể tích tiêm: 5 µL -Detector: Sử dụng kỹ thuật ESI (ion hóa tia điện) để ion hóa chất phân tích

và phân tích khối phổ 2 lần MS/MS

Mẫu được chiết bằng tert-butyl ether, thêm vào chất chuẩn nội propranolol hydroclorid rồi phân tích bằng HPLC-ESI/MS/MS

[10]

Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích sibutramin, HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng do điều kiện thiết bị sẵn có Vì

vậy, trong nghiên cứu này, HPLC được lựa chọn làm kỹ thuật để xây dựng quy trình phân tích sibutramin trong thực phẩm chức năng giảm béo

1.3 Tổng quan về HPLC

1.3.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp

lý [1]

1.3.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký

Thời gian lưu:

Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian lưu tR

Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động)

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM

Hệ số phân bố K:

K =

M

S C C

CS, CM: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

Hệ số dung lượng k’:

k’ =

M S M

M

S S

V

V K V C

V C

.

.

M

M R t

t

t 

Trong đó: VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số VS/VM

B

t t

t t k

k K

Trong đó:

KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước)

k’A,k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B

(tR)A, (tR)B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B

Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1 Trong phân tích sắc ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2 Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài

Số đĩa lý thuyết:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2

2 / 1

2

55,5

t H

L

Trong đó:

L: chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết;

H: chiều cao của đĩa lý thuyết;

W: chiều rộng của pic sắc ký;

W1/2: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic

Độ phân giải của cột:

Độ phân giải (RS) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong

A R B R

B A

A R B R

W W

t t

W W

t t

, 2 / 1 , 2 / 1

.18,1

WA, WB tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B;

W1/2,A, W1/2,B tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với một nửa chiều cao của pic

1.3.3 Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]

Buồng cột

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]

a Hệ thống cung cấp pha động:

- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi

hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)

và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ…

Hệ thống cấp

dung môi

Cột sắc ký Detector

Hệ thống thu

nhận và xửa lý

số liệu (máy

ghi, máy tính)

- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp

suất cao

 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: mỗi bình chứa dung môi có một van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu

 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao

- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm

đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo

b Bộ phận tiêm mẫu:

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL Có vòng chứa mẫu lớn hơn

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm

- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa, cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào cột hằng định nên độ lặp lại cao

c Cột sắc ký

- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn

- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký

để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi

thọ cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước hạt lớn hơn

- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:

- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:

UV gần và Vis Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi

xử lý Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in

ra dưới dạng bản phổ bằng máy in

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước

e Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

(NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU) 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của sibutramin

Đối tượng mẫu phân tích là các thực phẩm chức năng dưới một số dạng bào chế: viên nang cứng, viên nang mềm Các mẫu phân tích được lấy từ viện

KN ATVSTP QG có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau và được

mã hóa như bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích

NC01 Pretty woman Dược phẩm Jemo-Pharm

NC03 Viên nang thanh quả áo đình

Yunan Baian Medicinal Science & Technology co., LTD

25/3/2015

NC05 Viên nang không nhãn mác Không rõ 23/6/2014 NC06 Viên nang không nhãn mác Không rõ 15/5/2014

NM01 Doctor’s Choice Slim&slim Dramerico group LLC 21/12/2016 NM02 Viên nang không nhãn mác Không rõ Không rõ

NM05 Viên nang mềm không nhãn Không rõ Không rõ

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: kali dihydrophosphat (Merck), amoni acetat (Merck)

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma

- Máy ly tâm Hermle Z383K

- Máy lắc Vortex IKA

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 mL, 50 mL, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL

- Ống ly tâm 50 mL

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích sibutramin

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramin trong thực phẩm chức năng

- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thịtrường

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích sibutramin bằng HPLC

Nghiên cứu phân tích sibutramin chúng tôi tiến hành là một nhánh trong một đề tài lớn hơn nhằm xây dựng quy trình phân tích các chất có tác dụng làm giảm cân có mặt trái phép vào thực phẩm chức năng Trong số các chất này có phenolphthalein (do tác dụng nhuận tràng) và furosemid (do tác dụng lợi tiểu) là hai đối tượng cũng từng bị phát hiện có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng, đồng thời lại rất khó tách khỏi sibutramin bằng HPLC nếu

có mặt trong cùng nền mẫu (từ các kết quả nghiên cứu sơ bộ) Chính vì vậy, trong khi xây dựng quy trình phân tích sibutramin trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt mục tiêu cần khảo sát các điều kiện sắc ký cho phép tách riêng sibutramin khỏi phenolphthalein và furosemid để nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tế của quy trình

- Pha tĩnh: chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:

Bảng 2.2: Danh mục các pha động khảo sát

Pha động 3 CH3COONH4 0,05M (pH 3,5) Acetonitril

pha động 4 CH3COONH4 0,05M ( pH 3,5) Methanol

- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [23], [7], [26], chúng tôi khảo sát với tốc độ dòng 1 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 200 nm đến 450 nm

- Bước sóng phát hiện: 225 nm (do sibutramin có bước sóng hấp thụ cực đại

là 225 nm) [23]

- Nhiệt độ cột: 300C

- Dung dịch chuẩn sibutramin gốc 500 µg/mL: Cân chính xác một lượng chất đối chiếu sibutramin hydroclorid monohydrat tương đương khoảng 50,0 mg sibutramin vào cốc có mỏ 50 mL, hòa tan bằng 20 mL methanol

và chuyển vào bình định mức 100mL, dùng methanol tráng cốc, chuyển dịch tráng cốc vào cùng bình định mức, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc kỹ Bảo quản trong tủ lạnh

- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 40,0 mL dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 mL, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ sibutramin 200 µg/mL)

- Các dung dịch chuẩn sibutramin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc

- Dung dịch đánh giá độ phân giải: chuẩn bị dung dịch hỗn hợp sibutramin, furosemid và phenolphthalein trong methanol có nồng độ mỗi chất là sibutramin 200 µg/mL, furosemid 100 µg/mL, phenolphthalein 100 µg/mL

- Dung dịch đệm amoni acetat 0,05 M (pH 3,5): cân chính xác khoảng 1,93

g muối amoni acetat hoà tan vào khoảng 400 mL nước, chỉnh đến pH 3,5, định mức 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm

- Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,05M (pH 4,0): cân chính xác khoảng 3,4 g muối kali dihydrophosphat, hòa tan vào khoảng 400 mL nước, thêm 5mL tetrahydrofuran, chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric 5%, định mức bằng nước cất 2 lần tới 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm

2.4.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của sibutramin và tham khảo nhiều bài báo, nghiên cứu [23], [7], [16], [26], chúng tôi khảo sát khả năng chiết sibutramin

từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau đây: methanol, ethanol, nước, acetonitril, aceton

Quy trình chiết sibutramin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

- Xác định khối lượng trung bình thuốc trong nang, đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 - 0,4 mg) vào ống ly tâm 50 mL