Nghiên cứu phân tích sibutramin chúng tôi tiến hành là một nhánh trong một đề tài lớn hơn nhằm xây dựng quy trình phân tích các chất có tác dụng làm giảm cân có mặt trái phép vào thực phẩm chức năng. Trong số các chất này có phenolphthalein (do tác dụng nhuận tràng) và furosemid (do tác dụng lợi tiểu) là hai đối tượng cũng từng bị phát hiện có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng, đồng thời lại rất khó tách khỏi sibutramin bằng HPLC nếu có mặt trong cùng nền mẫu (từ các kết quả nghiên cứu sơ bộ). Chính vì vậy, trong khi xây dựng quy trình phân tích sibutramin trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt mục tiêu cần khảo sát các điều kiện sắc ký cho phép tách riêng sibutramin khỏi phenolphthalein và furosemid để nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tế của quy trình.
- Pha tĩnh: chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)
- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:
Bảng 2.2: Danh mục các pha động khảo sát
Thành phần pha động (%) Chế độ chạy máy A B Pha động 1 KH2PO4 0,05M (pH 4,0) Methanol Gradient Pha động 2 KH2PO4 0,05M (pH 4,0) Acetonitril
Pha động 3 CH3COONH4 0,05M (pH 3,5) Acetonitril
pha động 4 CH3COONH4 0,05M ( pH 3,5) Methanol
- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [23], [7], [26], chúng tôi
khảo sát với tốc độ dòng 1 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.
- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 200 nm đến 450 nm.
- Bước sóng phát hiện: 225 nm (do sibutramin có bước sóng hấp thụ cực đại
là 225 nm) [23].
- Nhiệt độ cột: 300C.
- Dung dịch chuẩn sibutramin gốc 500 µg/mL: Cân chính xác một lượng
chất đối chiếu sibutramin hydroclorid monohydrat tương đương khoảng 50,0 mg sibutramin vào cốc có mỏ 50 mL, hòa tan bằng 20 mL methanol và chuyển vào bình định mức 100mL, dùng methanol tráng cốc, chuyển dịch tráng cốc vào cùng bình định mức, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc kỹ. Bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 40,0 mL dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 mL, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ sibutramin 200 µg/mL).
- Các dung dịch chuẩn sibutramin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung
dịch chuẩn làm việc.
- Dung dịch đánh giá độ phân giải: chuẩn bị dung dịch hỗn hợp sibutramin,
furosemid và phenolphthalein trong methanol có nồng độ mỗi chất là sibutramin 200 µg/mL, furosemid 100 µg/mL, phenolphthalein 100 µg/mL.
- Dung dịch đệm amoni acetat 0,05 M (pH 3,5): cân chính xác khoảng 1,93
g muối amoni acetat hoà tan vào khoảng 400 mL nước, chỉnh đến pH 3,5, định mức 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm.
- Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,05M (pH 4,0): cân chính xác
khoảng 3,4 g muối kali dihydrophosphat, hòa tan vào khoảng 400 mL nước, thêm 5mL tetrahydrofuran, chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric 5%, định mức bằng nước cất 2 lần tới 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm.