Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ADENOSINE TRONG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps spp.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Chử Văn Mến*; Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Văn Long* Nguyễn Thị Lan Hương*; Bùi Thị Thu Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đối tượng: Đông trùng hạ thảo Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký để định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo HPLC Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Kết quả: xác định điều kiện sắc ký thích hợp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo gồm: cột C18 Phenomenex (4,6 mm ì 250 mm, àm) vi h dung mụi pha động dung dịch đệm phosphate acetonitril, tỷ lệ 92/8, detector UV bước sóng 259 nm Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát (LOD), độ đúng, độ xác Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo phương pháp HPLC * Từ khóa: Đơng trùng hạ thảo; HPLC; Adenosine Determination of Adenosine in Cordyceps spp by HPLC Summary Objectives: Establishment and validation of adenosine quantification in Cordyceps spp by high performance liquid chromatography Materials: Cordyceps spp Methods: Determine chromatographic conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp using HPLC The validation was carried out in accordance with ICH guideline and USP-34 Results: The suitable chromatographic conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp., including: C18 Phenomenex columns (4.6 mm x 250 mm, µm) with mobile phase of phosphate buffer and acetonitrile, at the ratio of 92/8, the detection wave length of 259 nm The quantitative method was validated on system compatibility, selectivity, linear range, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), precision and accuracy Conclusion: The HPLC method for adenosine quantitation has been developed and fully validated in accordance with ICH guideline * Key words: Cordyceps spp.; HPLC; Adenosine ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng hạ thảo, thuốc cổ truyền tiếng Trung Quốc, có tên khoa học Cordyceps sinensis Cordyceps militaris, ký sinh ấu trùng số lồi trùng sâu chết Đông trùng hạ thảo phân bố chủ yếu số tỉnh Trung Quốc Tibet, Qinghai, Sichuan, Yunnan Gansu Đây vị thuốc có nhiều * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 24/06/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/11/2015 Ngày báo đăng: 01/12/2015 18 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 tác dụng quý giá thành cao Đông trùng hạ thảo dùng đơng y có tác dụng bổ thận, bổ khí điều trị trường hợp mệt mỏi, mồ đêm, giảm lực tình dục, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, vô lực sau ốm nặng, bệnh phổi, bệnh thận, suy thận, loạn nhịp tim bện gan [1, 2] Nghiên cứu dược lý học hiệu đại cho thấy: Đơng trùng hạ thảo có tác dụng cải thiện nhiều hệ thống quan thể tuần hoàn, miễn dịch, quan tạo máu, tim mạch, phổi tuyến nội tiết thể [3, 4] Cho tới nay, hoạt chất Đơng trùng hạ thảo xác nhận nucleoside adenosine tiêu để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng Đơng trùng hạ thảo [3, 5] Adenosine có tác dụng dập tắt trạng thái kích thích tế bào thần kinh trung ương ức chế giải phóng nhiều chất dẫn truyền thần kinh tiền sinap [6, 7] Để đảm bảo hiệu chữa bệnh Đông trùng hạ thảo, việc đánh giá chất lượng Đông trùng hạ thảo quan trọng Nghiên cứu tiến hành: Định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo nhằm đánh giá chất lượng loại dược liệu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, hóa chất thiết bị - Dược liệu: Đông trùng hạ thảo Phòng Dược Hợp chất tự nhiên, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y cung cấp Mẫu lưu Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y - Hóa chất: + Chất chuẩn adenosine (Shanghai Tauto Biotech Co., Ltd Trung Quốc) + Ethanol 96, methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích + Acetonitril, đệm phosphate, nước cất lần: đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC - Merck - Thiết bị, dụng cụ: + Bình chiết siêu âm Soniclean, chiết hồi lưu dung môi + Máy HPLC Alliance Water 2695D; detector PDA + Cân phân tích Sartorius có độ xác 0,1 mg + Bộ lọc hút chân không Alltech (Mỹ) + Màng lọc nylon Sartorius Minisart kích thước lỗ lọc 0,45 µm Phƣơng pháp nghiên cứu - Xây dựng phương pháp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo dựa đánh giá thơng số: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát giới hạn định lượng - Qua tham khảo tài liệu [3, 5] thực nghiệm, xây dựng điều kiện phân tích HPLC sau: + Hệ thống HPLC + Detector PDA, bước sóng 259 nm + Chương trình rửa giải isocratic với hệ pha động acetonitrile/dung dịch đệm phosphate pH 6,5 (tỷ lệ 8/92) + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút + Thể tích tiêm: 10 µl 19 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Dung dịch thử: cân xác g bột dược liệu (được nghiền tới kích thước thích hợp) cho vào bình hồi lưu, thêm xác 50 ml methanol 90%, cân bình, ghi xác khối lượng Tiến hành chiết phương pháp hồi lưu 60 phút Để nguội, cân lại bình, bổ sung methanol 90% đến khối lượng ban đầu Lắc đều, lọc qua màng 0,45 μm, sau đó, đem phân tích sắc ký - Dung dịch chuẩn: cân xác 10,0 mg chất chuẩn adenosine hòa tan vào bình định mức 10 ml với methanol để dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/ml (dung dịch A) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tính tƣơng thích hệ thống Đánh giá cách tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký với điều kiện nêu Kết trình bày bảng sắc ký đồ dung dịch chuẩn adenosine, dịch chiết từ Đông trùng hạ thảo ghi hình 1, Adenosine Hình 1: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn adenosine Adenosine Hình 2: Sắc ký đồ dịch chiết dược liệu 20 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Bảng 1: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký Nội dung Kết Diện tích píc Stb = 3978562 RSD = 0,18% Thời gian lưu tR,tb = 8,58 phút RSD = 0,12% Hệ số bất đối xứng 1,26 Số đĩa lý thuyết 3.600 Kết cho thấy hệ thống sắc ký tương thích với mẫu phân tích với RSD diện tích pic thời gian lưu < 1% Tính đặc hiệu Sử dụng detector PDA để đánh giá tính đặc hiệu phương pháp thời gian lưu píc sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử, xác định phổ UV-VIS Kết cho thấy: phổ hai píc giống hình dạng số đỉnh hấp thụ cực đại, chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao Khoảng tuyến tính Để khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp, chúng tơi tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 2,40; 6,0; 12,0; 30,0; 60,0; 100,0 µg/ml Sau xác định tương quan diện tích píc nồng độ dung dịch chuẩn Bảng 2: Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ adenosine chuẩn Hình 3: Đồ thị tương quan diện tích píc nồng độ adenosine Kết cho thấy: khoảng nồng độ khảo sát, diện tích píc nồng độ adenosine có tương quan tuyến tính chặt chẽ, R2 = 0,9999 Độ lặp lại Tiến hành xác định độ lặp lại phương pháp cách định lượng adenosine với thí nghiệm riêng biệt theo phương pháp chọn Bảng 3: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp Lƣợng Lƣợng Thứ Đông trùng adenosine tự hạ thảo (g) (mg) Hàm lƣợng (%) 2,0001 11,70 0,585 Nồng độ (µg/ml) Diện tích (mAUx min) 2,9992 17,13 0,571 100,00 6674247 2,0024 11,53 0,576 60,00 3978562 2,0015 11,65 0,582 30,00 1989281 2,0016 11,69 0,584 12,00 796987 6,00 398494 2,0023 11,57 0,578 2,40 160345 y = 66682 x - 5338 với R = 0,9999 Thống kê Xtb = 0,579% RSD = 0,92% Kết cho thấy: phương pháp định lượng có độ lặp lại tốt với RSD = 0,92% 21 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Độ Xác định độ phương pháp phương pháp thêm chuẩn + Dung dịch chuẩn gốc: hút xác ml dung dịch chuẩn (dung dịch A), hòa lỗng vào bình định mức 50 ml methanol, lắc kỹ (dung dịch B) + Dung dịch thử gốc: tiến hành chuẩn bị phần dung dịch thử + Dung dịch hỗn hợp: hút xác ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch chuẩn gốc (dung dịch B) vừa đủ tới vạch, lắc Lọc dung dịch qua màng 0,45 µm, sau đó, dung dịch phân tích sắc ký Tiến hành đo HPLC với điều kiện nêu trên, lặp lại thực nghiệm với dung dịch thử khác Bảng 4: Kết khảo sát độ Thứ tự Lƣợng thêm vào (µg) Lƣợng thu hồi (µg) Tỷ lệ (%) thu hồi 60,00 58,91 98,18 60,00 59,23 98,72 60,00 59,52 99,20 60,00 60,64 101,07 60,00 59,43 99,05 Thống kê Tỷ lệ (%) thu hồi tb = 99,24%; RSD = 1,10% Phương pháp định lượng có độ cao với tỷ lệ (%) thu hồi từ 98,18 - 101,07%; RSD = 1,10% - Giới hạn phát giới hạn định lượng dưới: 22 + Nồng độ mẫu thử khoảng 0,8 µg/ml giới hạn phát Tại nồng độ này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp lần diện tích đáp ứng mẫu trắng + Nồng độ mẫu thử khoảng 2,4 µg/ml giới hạn định lượng Tại nồng độ này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp 10 lần diện tích đáp ứng mẫu trắng với độ độ lặp lại mức chấp nhận tiến hành phân tích nồng độ KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Genimi RP-C18; pha động: acetonitrile: đệm phosphate pH6,5 (8:92); detector: UV bước sóng 259 nm Phương pháp định lượng có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích píc nồng độ adenosine khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9999; độ lặp lại (RSD = 0,92%) độ (98,18 - 101,07%) Thời gian phân tích mẫu HPLC phù hợp (khoảng 15 phút) TÀI LIỆU THAM KHẢO Zhu JS, Halpern GM, Johns K The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part I; J Alt Comp Med 1998, 4, pp.289-303 Zhu JS, Halpern GM, Johns K The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part II; J Alt Comp Med 1998, 4, pp.429-457 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 SP Li, FQ Yang, Karl WK Tsim Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2006, 41, pp.15711584 Ashok Kumar Panda, Kailash Chandra Swain Traditional uses and medicinal potential of Cordyceps sinensis of Sikkim, J Ayurveda Integr Med 2011, Jan-Mar, (1), pp.9-13 The Pharmacopoeia Commission of PRC (Eds.) Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Chemical Industry Publishing House, Beijing 2005 Corradetti R, Lo Conte G, Moroni F, Passani MB, Pepeu G Adenosine decreases aspartate and glutamate release from rat hippocampal slices Eur J Pharmacol 1984, Sep 3, 104 (1-2), pp.190-126 C Schmidt, M C Bellingham, D W Richter Adenosinergic modulation of respiratory neurones and hypoxic responses in the anaesthetized cat J Physiol 1995, Mar 15, 483 (Pt 3), pp.769-778 23 ... bảo hiệu chữa bệnh Đông trùng hạ thảo, việc đánh giá chất lượng Đông trùng hạ thảo quan trọng Nghiên cứu tiến hành: Định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo nhằm đánh giá chất lượng loại dược liệu... xác định độ lặp lại phương pháp cách định lượng adenosine với thí nghiệm riêng biệt theo phương pháp chọn Bảng 3: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp Lƣợng Lƣợng Thứ Đông trùng adenosine tự hạ thảo. .. Phƣơng pháp nghiên cứu - Xây dựng phương pháp định lượng adenosine Đông trùng hạ thảo dựa đánh giá thơng số: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn