Xây dựng quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - PHẠM HOÀNG ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - PHẠM HOÀNG ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN PGS.TS PHAN THANH DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Phạm Hồng Anh LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC – KHÓA 2016-2018 Ngành Kiểm nghiệm thuốc Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS Phạm Hoàng Anh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN PGS.TS PHAN THANH DŨNG Từ khóa Collagen, 4-hydroxyprolin, LC-MS/MS, sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC), thực phẩm chức Mở đầu Collagen loại protein cấu trúc phong phú có vai trị quan trọng thể động vật có vú Collagen sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: y học, dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm nên việc kiểm soát chất lượng collagen sản phẩm điều cần thiết Tại Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp LC-MS/MS Do vậy, cần nghiên cứu tìm quy trình định lượng phương pháp LC-MS/MS phù hợp để xác định hàm lượng collagen có thực phẩm chức với yêu cầu dễ thực hiện, độ nhạy cao có khả ứng dụng tốt thực tế Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: mẫu thực phẩm chức dạng rắn có chứa collagen Phương pháp nghiên cứu: định lượng collagen gián tiếp thông qua 4-hydroxyprolin, không qua giai đoạn tạo dẫn chất Quy trình định lượng sử dụng kỹ thuật HILICUPLC-MS/MS, nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) kỹ thuật ghi phổ MRM Khảo sát tìm điều kiện khối phổ điều kiện sắc ký (pha tĩnh, pha động, chương trình gradient pha động, nồng độ đệm, nồng độ acid formic, tốc độ dịng, thời gian tái cân cột) thích hợp để định lượng collagen Khảo sát tìm điều kiện thủy phân tối ưu cho mẫu thử (nhiệt độ, thời gian, thể tích acid hydrocloric N), sau đem phân tích Thẩm định quy trình định lượng dựa quy định AOAC ICH Kết Xác định điều kiện khối phổ điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp HILIC-UPLC-MS/MS Quy trình thủy phân giờ, nhiệt độ thủy phân 110 °C, thể tích acid hydroclorid N ml ứng với lượng cân mg mẫu thử Quy trình thủy phân đạt hiệu suất cao 91,5% chứng minh có tính lặp lại, tính tuyến tính Quy trình thẩm định đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, miền giá trị Đã ứng dụng quy trình để định lượng collagen mẫu thực phẩm chức thị trường Kết luận Đã xây dựng quy trình định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp HILIC-UPLC-MS/MS với độ nhạy cao, có tính đặc hiệu đơn giản Quy trình thẩm định có khả ứng dụng thực tế để định lượng collagen mẫu thực phẩm chức thị trường Master’s Thesis of Pharmaceutical – Academic course 2016-2018 Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210 A QUANTITATIVE METHOD FOR COLLAGEN IN HEALTH SUPPLEMENTS BY LC-MS/MS Pham Hoang Anh Supervisor: Assoc Prof Dr NGUYEN THI NGOC VAN Assoc Prof Dr PHAN THANH DUNG Key words Collagen, 4-hydroxyproline, LC-MS/MS, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), health supplements Introduction Collagen is the most abundant structural protein and plays an important role in mammals Collagen is used in many fields such as medicine, pharmaceutical, cosmetic and food, so a quality control for collagen in products is necessary In Vietnam, we’ve not seen any research for collagen quantification in health supplements using LC-MS/MS method Therefore, it needs to study a quantitative method by LC-MS/MS for collagen quantification in health supplements The method must be easy to implement, high sensitivity and practical application Objects and method of study Objects: solid health supplements containing collagen Method: quantitative analyze collagen through underivatised 4-hydroxyproline The quantitative method uses HILIC-UPLC-MS/MS with electrospray ionization (ESI) and multiple reaction monitoring (MRM) transition to determine target substance Optimize the mass spectrometry and liquid chromatography conditions (static phase, mobile phase, gradient program, buffer concentration, acid formic concentration, flow rate, re-equilibration for column) Investigate the optimum hydrolysis conditions for the sample (temperature, time, volume of acid hydrochloric N) Validate of the quantitative method based on AOAC and ICH guidelines Results The method was optimized the mass spectrometry and liquid chromatography conditions to determine collagen in health supplements by HILIC-UPLC-MS/MS Hydrolyze mg of sample in hours, 110 ° C with mL of acid hydrochloric N The hydrolysis process achieved a high efficiency of 91.5% and has been demontrated repeatable, linear The method was validated for system suitability, specificity, linearity, repeatability, accuracy, analytical range It was applied the method to quantify collagen in health supplements in market Conclusions This study has developed a HILIC-UPLC-MS/MS method for the determination of 4-hydroxyproline to quantification collagen in health supplements The method showed a high sensitivity, specificity and simple Also, the method was validated and was applied to quantify collagen in health supplements in market i MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG .v DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 1.2 SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC) 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN TỨ CỰC (LC-MS/MS) 10 1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN 12 1.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 32 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN COLLAGEN 43 3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 49 3.4 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 54 3.5 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 54 ii CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59 4.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 59 4.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN COLLAGEN 62 4.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 63 4.4 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên gốc Từ tiếng Việt AOAC Association of Official Hiệp hội nhà hố phân Analytical Chemists tích thống Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất khí ionization Atmospheric pressure Ion hóa photon áp photoionization suất khí APCI APPI AQC 6-aminoquinolyl-N-succinimidyl Thuốc thử 6-aminoquinolylcarbamat N-succinimidyl carbamat BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh CI Chemical ionization Ion hóa hóa học DABS-Cl Dimethylamino- Thuốc thử dimethylamino- azobenzensulfonyl clorid azobenzensulfonyl clorid Dược điển Việt Nam phiên Dược điển Việt Nam phiên V V ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử FMOC-Cl 9-fluorenylmethyl cloroformat Thuốc thử 9-fluorenylmethyl DĐVN V cloroformat FT-IR Fourier transform Infrared Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier HILIC HPLC Hydrophilic interaction Sắc ký lỏng tương tác thân chromatography nước High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography HPLC-MS High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography - Mass ghép đầu dò khối phổ spectrometry iv HPLC-MS/MS High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography - Tandem mass ghép đầu dò khối phổ hai lần spectrometry tứ cực IEC Ion exchange chromatography Sắc ký trao đổi ion IP RPLC Ion pairing Reversed - phase Sắc ký pha đảo dùng cặp ion liquid chromatography Liquid chromatography - Mass Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối spectrometry phổ Liquid chromatography - Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối Tandem mass spectrometry phổ hai lần tứ cực MRM Multiple Reaction Monitoring Kỹ thuật ghi phổ MRM MS Mass spectrometry Phổ khối MS/MS Tandem mass spectrometry Hệ thống khối phổ hai lần tứ LC-MS LC-MS/MS cực NPLC Normal - phase liquid Sắc ký lỏng pha thuận chromatography OPA ortho-phthalaldehyd Thuốc thử orthophthalaldehyd PITC Phenylisothiocyanat Thuốc thử phenylisothiocyanat RPLC Reversed - phase liquid Sắc ký lỏng pha đảo chromatography SEC Size exclusion chromatography Sắc ký rây phân tử UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography UPLC-MS/MS Ultra performance liquid USP Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography- tandem mass ghép đầu dò khối phổ hai lần spectrometry tứ cực United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các pha tĩnh thông dụng HILIC Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng collagen 14 Bảng 2.3 Thông tin mẫu thử 17 Bảng 2.4 Danh mục thiết bị sử dụng 19 Bảng 2.5 Danh mục hóa chất sử dụng 20 Bảng 2.6 Các thơng số khảo sát nguồn ion hóa điện tử 20 Bảng 2.7 Thông số cột BEH HILIC cột BEH Amide 21 Bảng 2.8 Chương trình gradient khảo sát pha động 22 Bảng 2.9 Chương trình gradient khảo sát thời gian tái cân cột 24 Bảng 2.10 Giá trị yếu tố khảo sát điều kiện thủy phân 25 Bảng 2.11 Bảng mơ tả thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân 25 Bảng 2.12 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại quy trình thủy phân 26 Bảng 2.13 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính tuyến tính quy trình thủy phân 27 Bảng 2.14 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa tỷ lệ ion 29 Bảng 3.15 Kết khảo sát điều kiện khối phổ 33 Bảng 3.16 Thông số MRM phát trans-4-Hydroxy-L-prolin 33 Bảng 3.17 Kết tiêm lặp lại lần hai loại pha tĩnh 34 Bảng 3.18 Kết tiêm lặp lại hệ pha động 39 Bảng 3.19 Kết khảo sát gradient hệ 39 Bảng 3.20 Kết so sánh chương trình gradient pha động chế độ đẳng dòng 40 Bảng 3.21 Kết khảo sát nồng độ đệm 41 Bảng 3.22 Kết tiêm lặp lại lần hệ 4.2 hệ 4.3 41 Bảng 3.23 Kết tiêm lặp lại 10 lần hệ 4.2 hệ 4.3 41 Bảng 3.24 Kết khảo sát tốc độ dòng 42 Bảng 3.25 Kết khảo sát thời gian tái cân cột 42 Bảng 3.26 Kết khảo sát điều kiện thủy phân collagen 43 PL-56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM 4.5 Độ lặp lại Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-58 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-59 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM 4.6 Độ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-60 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-61 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-62 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-63 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM 4.7 Miền giá trị Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-64 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-65 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-66 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM PHỤ LỤC 5: ĐỊNH LƯỢNG MẪU THỰC Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-67 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-68 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-69 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-70 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... ký định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp LC- MS/ MS Tìm điều kiện tối ưu để thủy phân collagen thực phẩm chức Thẩm định quy trình định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp LC- MS/ MS... quan phương trình hồi quy tuyến tính r ≥ 0,995 [43] 2.2.5 Ứng dụng quy trình định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp LC- MS/ MS Ứng dụng quy trình định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp. .. giá trị Đã ứng dụng quy trình để định lượng collagen mẫu thực phẩm chức thị trường Kết luận Đã xây dựng quy trình định lượng collagen thực phẩm chức phương pháp HILIC-UPLC -MS/ MS với độ nhạy cao,