Xây dựng quy trình định lượng coixol trong cam thảo nam (scoparia dulcis l ) scophulariaceae

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO NAM (Scoparia dulcis L.) Scophulariaceae Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Thị Vân Anh Tp Hồ Chí Minh, 3/2019 THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Xây dựng qui trình định lượng coixol Cam thảo nam (Scoparia dulcis L.) Scophulariaceae - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Trần Thị Vân Anh Email: ttvananh@ump.edu.vn Điện thoại: 0918852989 - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): BM Dược liệu, Khoa Dược - Thời gian thực hiện: 01/07/2018 – 01/07/2019 Mục tiêu: - Xây dựng qui trình định lượng coixol Cam thảo nam - Áp dụng qui trình định lượng để khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái địa phương khác Nội dung chính: - Khảo sát điều kiện sắc kí cho việc phân tích coixol CTN - Khảo sát qui trình chiết kiệt Coixol mẫu dược liệu - Xây dựng quy trình định lượng, khảo sát độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại - Áp dụng quy trình định lượng, tiến hành khảo sát hàm lượng Coixol mẫu CTN thu hái địa phương khác Kết đạt Xác định điều kiện phân tích sắc kí: Cột Cosmosil 2,5 Chlolester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); nhiệt độ cột 35 oC; tốc độ dòng: 0,45 mL/phút; thể tích tiêm mẫu µl; bước sóng phát hiện: 230 nm; chương trình rửa giải (A: nước, B: ACN) 0-3 phút: % B, 3-14 phút: 5-15 % B, 14-15 phút; 15-90 % B, 15-24 phút; 90 % B Qui trình chuẩn bị mẫu: Cân xác 30 mg bột dược liệu CTN cho vào ống nghiệm có nắp ml, thêm xác ml methanol 100%, siêu âm 45 phút 40 oC Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc kí, phân tích theo điều kiện chọn Qui trình định lượng đạt tiêu đánh giá tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác tính tuyến tính Đã áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái thời điểm địa phương khác Hàm lượng coixol mẫu dao động khoảng 0,61 – 2,14 mg/g Qui trình định lượng sử dụng bổ sung tiêu định lượng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu Cam thảo nam Kết đào tạo: Đào tạo Dược sĩ đại học DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Trần Thị Vân Anh Phạm Thị Thanh Hương ii MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CAM THẢO NAM 2.1.1 Đặc điểm thực vật 2.1.2 Thành phần hóa học 2.1.3 Tác dụng dược lý 2.1.4 Công dụng dân gian 15 2.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT COIXOL 15 2.2.1 Cấu trúc hóa học tính chất vật lý 15 2.2.2 Nguồn gốc sinh phát nguyên 16 2.2.3 Tác dụng sinh học 17 2.2.4 Các phương pháp định lượng 19 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 ĐỐI TƯỢNG 21 3.1.1 Nguyên liệu 21 3.1.2 Dung mơi hóa chất 22 3.1.3 Thiết bị - Dụng cụ 22 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng 22 3.2.2 Đánh giá quy trình định lượng 24 3.2.3 Ứng dụng quy trình định lượng coixol dược liệu S dulcis 28 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 4.1 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL 30 4.1.1 Khảo sát điều kiện sắc kí 30 4.1.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu 35 4.2 THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 36 4.2.1 Độ tinh khiết chất đối chiếu 36 4.2.2 Tính tương thích hệ thống 36 4.2.3 Tính đặc hiệu 37 4.2.4 Tính tuyến tính 38 4.2.5 Độ lặp lại 39 4.2.6 Độ 39 4.3 ỨNG DỤNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CÁC MẪU S.DULCIS 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 iii MỞ ĐẦU Theo xu hướng “quay với thiên nhiên” sản phẩm thuốc từ dược liệu ngày ưu chuộng sử dụng nhiều hiệu an tồn, tác dụng phụ Do việc tiêu chuẩn hóa kiểm soát chất lượng dược liệu cần trọng Cam thảo nam (Scoparia dulcis L Scrophulariaceae) dược liệu sử dụng lâu đời y học dân gian Việt Nam nước giới Ấn Độ, Brazil, Colombia, Nhật Bản…với công dụng trị tiểu đường, trị loét dày, trị rắn cắn, giảm đau, hạ sốt, làm mát thể…[1] Là dược liệu sử dụng phổ biến, nhiên tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng S dulcis chưa nâng cao Trong Dược điển Việt Nam V ban hành năm 2018, chuyên luận Cam thảo nam dừng tiêu định lượng chất chiết dược liệu [6] Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học S dulcis đa dạng gồm nhiều nhóm hợp chất khác terpenoid, alkaloid, flavonoid số chất khác [27] Trong đó, coixol alkaloid S dulcis với nhiều tác dụng dược lý chứng minh hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus HIV, điều hòa tiết chất nhầy đường hơ hấp, điều hịa thần kinh [37, 20, 13, 7, 17] Coixol đáp ứng tiêu chí chất marker sử dụng việc tiêu chuẩn hóa dược liệu S dulcis Tiếp nối đề tài nghiên cứu thành phần hóa học S dulcis thực năm trước, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng coixol Cam thảo nam” thực với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng coixol Cam thảo nam phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dị đa sóng (UPLC-PDA) - Ứng dụng quy trình xây dựng để khảo sát hàm lượng coixol Cam thảo nam thu hái số tỉnh, khảo sát thay đổi hàm lượng coixol phận theo thời gian thu hái TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Cam thảo nam 2.1.1 Đặc điểm thực vật Cam thảo nam 10 lồi thuộc chi Scoparia, vị trí chi Scoparia bảng phân loại thực vật theo Takhtajan thể sơ đồ 2.1 Giới thực vật (Plantae) Thực vật bậc cao (Embryobionta) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa môi (Lamiidae) Bộ Hoa môi (Lamiales) Họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Scrophularioidaeae Chi Scoparia Sơ đồ Vị trí phân loại chi Scoparia hệ thống phân loại thực vật 2.1.2 Mô tả thực vật Thân cỏ nhỏ, mọc thẳng đứng, cao 30-80 cm Thân trịn, màu xanh, có 4-6 sọc lồi, nhẵn, mang theo cuống lại Lá đơn, mọc vòng không hay mọc đối (những dưới), hình mác, đầu nhọn, dài 1,5-6 cm, khơng có kèm Bìa có 2/3 phía trên, cưa tù, không đều, sâu 1-2 mm Phiến kéo dài men dọc theo bên cuống lá, mặt sẫm, mặt nhạt Khơng có kèm Gân hình lơng chim lồi mặt dưới; 4-5 cặp gân phụ lồi mặt Cuống dài 5-7 mm Cụm hoa mọc riêng rẻ hay thành đôi nách Hoa gần đều, lưỡng tính, mẫu đơi gặp mẫu 5, màu trắng Cuống hoa mảnh, dài 4-6 mm, màu xanh Lá đài 4, rời, gặp đài, màu xanh, hình bầu dục, dài khoảng 2,5 mm, có gân mặt ngồi, mép có lơng, tồn đồng trưởng với Cánh hoa 4, dính (đôi gặp 5) thành ống ngắn, màu trắng phớt tím; chia thành phiến hình bầu dục, gần nhau, dài khoảng mm, uốn cong ngược bên ngồi hoa nở, nhiều lơng màu trắng, dạng sợi, dài gần nhị đính miệng ống tràng Tiền khai: cánh hoa cùng, cánh cùng, cánh hoa lại xen kẽ Nhị 4, rời, đính miệng ống tràng, xen kẽ cánh hoa; nhị hình sợi màu trắng, đỉnh tím, dài khoảng 1,5 mm Bao phấn hình mũi tên, ơ, đính giữa, hướng trong, khai dọc Hạt phấn hình bầu dục, có rãnh nỗn vị trí trước-sau, dính liền thành bầu ơ, đựng nhiều nỗn, đính nỗn trung trụ vịi nhụy dài khoảng 1,5 mm đính đỉnh bầu Đầu nhụy màu xanh, dành điểm có thùy, có chất dính Quả nang hủy vách, hình cầu, chứa nhiều hạt nhỏ màu đen [Error! Reference source not found.] Hình Hoa thức hoa đồ S dulcis Bộ phận dùng: toàn rễ [3] Phân bố sinh thái: S dulcis có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Cây mọc hoang dại nhiều nơi, vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á Trung Quốc Ở Việt Nam, coi loài cỏ dại, mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam, thường gặp đất hoang, dọc bở đường, dải cát sông Từ độ cao 1000m trở lên dần [3] Tồn S dulcis Hoa lưỡng tính Quả có đài đồng trưởng Quả nang hủy vách Hạt nhỏ màu đen Lá có cưa Hình Đặc điểm thực vật lồi Scoparia dulcis L 2.1.2 Thành phần hóa học Thành phần S dulcis chủ yếu gồm terpenoid (triterpen diterpen), flavonoid, alkaloid, ngồi cịn có tannin, hexacosonol, β-sitosterol, ketonedulcitone, amellin [3] Diterpenoid: Đây thành phần đa dạng cấu trúc hóa học có nhiều tác dụng dược lý S dulcis Cấu trúc diterpenoid S dulcis chia làm nhóm khung chính: labdan, scopadulan, aphidicolan [16] Một số cấu trúc diterpen trình bày Bảng Bảng Cơng thức cấu tạo số diterpenoid S dulcis Nhóm Các hợp chất diterpen CH OH R OCOC6 H5 Labdan R = COOH: Acid scoparic A [20] R = CH2OH: Scopadiol [16] Scopanolal [17] R=COOH Acid scoparic B [13] R1 = Me, R2 = COOH, R3 = OAc Acid 4-epi-7α-O-acetylscoparic A [19] R=COOH Acid scoparic C [13] Acid 7α-O-acetyl-8,17βepoxyscoparic A [19] Scopadulan R1 = CH2OH, R2 = Me, R3 = OH 7α-hydroxyscopadiol [19] R1=H, R2=COOH, R3=CH2OH: Acid scopadulcis A [14] R1=H, R2=CH3, R3=COOH: Acid scopadulcis B [14] R1=H, R2=CH3, R3=CH2OH: Dulcinol [20] R1=H, R3=H, R2=CH2OH: Scopadulcinol [16] R1=OH, R2=R3=CH3: Iso-dulcinol [17] R1=H, R2=COOH, R3=CH3: Acid 4-epi-scopadulcis B[17] R1=H, R2=CH3, R3=CH2OH: Dulcidiol [17] R1=H, R2=COOH, R3=CH3: Acid scopadulcis C [17] R1 = Me, R2 = Me, R3 = OH: Neo-dulcinol R1 = CHO, R2 = Me, R3 = H: Dulcinolal-13-one R1 = Me, R2 = CHO, R3 = OH: 4-epi-7αhydroxydulcinodal-13-one [19] Aphidicolan Scopadulin [15] Aphidicolin Triterpenoid Triterpenoid S dulcis gồm acid ifflaionic, friedelin, α-amyrin, methyl ifflaionate, acid dulcioic, methyl dulcioate, acetoxy methyl dulcioate [10, 25] Đặc biệt acid betulinic glutinol có nhiều tác dụng sinh học kháng viêm trị tiểu đường [10, 39] Bảng Công thức cấu tạo số triterpenoid S dulcis R=O, R1=H: Acid ifflaionic [21] R=O, R1=CH3: Methyl ifflaionate R=H, OH (β), R1=H: Acid dulcioic [21] R=H, OH (β), R1=CH3: Methyl dulcioate R=H, OCOCH3 (β), R1=CH3: Acetoxy methyl dulcioate Friedelin α-amyrin Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chương trình Hình Sắc ký đồ chương trình chạy (Chú thích: cx: pic coixol) Bảng Điều kiện chương trình rửa giải (A: ACN; B: H2O) (F: tốc độ dịng) Chương trình Thời gian (phút) 15 16 25 Thời gian (phút) 20 21 30 Chương trình Chương trình F (ml/ phút) %H2O %ACN %H2O %ACN %H2O %ACN 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 95 95 70 10 10 5 30 90 90 95 95 75 10 90 5 25 10 90 95 95 80 10 90 5 20 10 90 Chương trình F (ml/ %H2O phút) 0,3 95 0,3 95 0,3 85 0,3 10 0,3 10 %ACN 5 15 90 90 Thời gian (phút) 20 21 30 Chương trình F (ml/ %H2O phút) 0,4 95 0,4 95 0,4 85 0,4 10 0,4 10 %ACN 5 15 90 90 Nhận xét: Sắc kí đồ chương trình cho thấy pic coixol tách chưa tốt, dính với tạp 1, hình dạng pic coixol khơng đối xứng Ở chương trình pic coixol đối xứng cịn dính tạp Sắc kí đồ chương trình cho pic coixol pic tách rõ hơn, pic coixol đối xứng Quan sát pic 1, 2, 3, coixol sắc kí đồ thấy chương trình cho độ phân giải tốt, pic tách rõ chương trình 4, pic coixol có độ phân giải (Rs=2,5), hệ số kéo đuôi (As=1,2), số đĩa lý thuyết (N=22400) độ tinh khiết pic đạt yêu cầu 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình Độ tinh khiết pic coixol chương trình Kết luận: Chọn chương trình làm chương trình chạy UPLC Khảo sát tốc độ dòng Tiến hành mục 3.2.1 Kết trình bày Hình 10 Hình 10 Sắc ký đồ tốc độ dòng 0,4; 0,45 0,5 ml/phút Nhận xét: Khi tăng tốc độ dòng từ 0,4 đến 0,5 ml/phút, pic tạp 1, tách xa pic coixol Ở tốc độ dòng 0,5 ml/phút, pic tạp 1, tách xa pic coixol nhiên độ phân giải pic giảm Ở tốc độ dòng 0,4 ml/phút pic tạp 1,2 gần pic coixol Do chọn tốc độ dịng 0,45 ml/phút Khảo sát nhiệt độ cột Tiến hành mục 3.2.1 Kết trình bày hình 11 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 11 Sắc ký đồ nhiệt độ 30oC 35oC Nhận xét: Khi tăng nhiệt độ cột, pic tạp 1,2 tách xa pic coixol Ở nhiệt độ 35 oC, pic tạp 1, tách xa pic coixol đảm bảo thông số độ phân giải, hệ số kéo đuôi, số đĩa lý thuyết, độ tinh khiết pic Kết luận: Chọn nhiệt độ cột 35 oC Quan sát sắc kí đồ chương trình 5, pic coixol xuất khoảng phút thứ 10 Để tiết kiệm dung môi thời gian, khai triển gradient tới phút 14 (xác lập tỷ lệ dung môi phút thứ 14 85% H2O: 15% ACN) sau tăng tỉ lệ ACN để tiến hành rửa cột từ phút 15 kéo dài 10 phút Vì mẫu phân tích mẫu dược liệu chứa nhiều tạp nên thời gian rửa cột kéo dài 10 phút để cột rửa sạch, đảm bảo kết định lượng xác Chương trình chạy mẫu thay đổi thành chương trình Bảng Bảng Chương trình chạy Tốc độ dịng: 0,45 ml/phút Nhiệt độ cột: 35 oC Thể tích tiêm mẫu: µl Thời gian % H2O %ACN 95 95 14 85 15 15 10 90 24 10 90 Kết chạy theo chương trình trình bày Hình 3.13 3.14, pic coixol đạt yêu cầu độ phân giải, hệ số kéo đuôi, số đĩa lý thuyết, độ tinh khiết pic 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 12: Sắc kí đồ chương trình rửa giải độ tinh khiết pic coixol Kết luận: Điều kiện sắc ký xây dựng sau: cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm), nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dịng: 0,45 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 1µl, bước sóng phát 230 nm, pha động A (H2O), B (ACN), chương trình rửa giải – phút: 5% B, – 14 phút: -15 % B, 14 – 15 phút: 15-90 % B, 15 – 24 phút: 90% B Cân cột vòng phút lần chạy liên tiếp 4.1.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Thăm dị dung mơi chiết: Tiến hành mục 3.2.1 Kết chọn dung môi MeOH chiết coixol mẫu tốt Thăm dò thời gian chiết: Tiến hành mục 3.2.1, Kết chọn thời gian chiết 45 phút tối ưu Thăm dò nhiệt độ chiết: Tiến hành mục 3.2.1 Kết khảo sát cho thấy chiết nhiệt độ 40oC cho diện tích pic coixol lớn Thăm dị tỉ lệ dung mơi; dược liệu, số lần chiết Chiết mẫu dược liệu với tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 1,5 ml) lần chiết 1, 2, có diện pic coixol Để thuận lợi cho việc xử lý mẫu, tăng tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: ml), sau chiết lần với điều kiện chọn, mẫu ly tâm, bã dược liệu chiết lần lần với ml dung môi Kết cho thấy lần chiết thứ 2, pic coixol chiếm 1,84% Như chiết kiệt coixol lần chiết, thuận tiện cho việc xử lý mẫu Kết khảo sát điều kiện chiết coixol từ dược liệu (quy trình xử lý mẫu) trình bày tóm tắt Bảng Bảng 9: Kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu Dung mơi Diện tích pic coixol ACN 100% MeOH 100% MeOH 90% MeOH 80% 176637 267393 2657908 259075 35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Thời gian chiết Diện tích pic coixol Nhiệt độ chiết Diện tích pic coixol Số lần chiết Diện tích pic coixol 25 phút 45 phút 65 phút 85 phút 250877 253807 25342 245027 35oC 40oC 50oC 60oC 277383 281318 244950 234015 Lần 64780 (98,15% Lần Lần Không 1220 (1,84%) phát Từ kết khảo sát, qui trình chiết coixol xác định: Cân xác 30 mg bột dược liệu CTN cho vào ống nghiệm có nắp ml, thêm xác ml methanol 100%, siêu âm 45 phút 40 oC Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc kí, phân tích theo điều kiện chọn 4.2 Thẩm định qui trình định lượng 4.2.1 Độ tinh khiết chất đối chiếu Tiến hành Mục 3.2.1 Kết trình bày Hình 13 Hình 13 Sắc ký đồ chuẩn coixol Sử dụng tích phân tự động tính độ tinh khiết chuẩn coixol 98,10% 4.2.2 Tính tương thích hệ thống Tiến hành phân tích lần mẫu CTN (mẫu thu hái TP.HCM 3/2018) chiết theo qui trình để kiểm tra tính phù hợp hệ thống Phép thử có giá trị pic coixol pic lân cận tách hoàn toàn (Rs>1,5) 36 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết thực nghiệm cho thấy giá trị RSD % thời gian lưu diện tích pic 1,5 (Bảng 10) Như quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Bảng 10: Kết thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình Lần tiêm mẫu Lần Lần Lần Lần Lần Lần S Rt N k' As α Rs TB SD RSD% 71216 73501 73884 73706 73220 74371 73316 1099,2 1,499 10,40 10,38 10,40 10,41 10,39 10,391 10,394 0,0138 0,133 19036,37 19147,83 19176,85 19311,4 19178,6 19063,23 19152,38 97,97997 0,511581 44,22 44,10 44,24 44,27 44,17 44,18 44,20 1,17 1,16 1,17 1,16 1,12 1,19 1,16303 1,25 1,25 1,33 1,33 1,33 1,25 1,29 4,74 5,11 9,07 9,15 9,33 4,66 7,01 Đạt Đạt Đạt Đạt Yêu cầu RSD < 2% RSD < 2% RSD < 2% k’ > 0,8 < As < 1,5 1,05 < a 1,5 Kết luận: Các thông số đạt yêu cầu, quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống 4.2.3 Tính đặc hiệu Triển khai sắc kí mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử mẫu thử thêm chất đối chiếu Quan sát thời gian lưu diện tích pic coixol mẫu Sắc kí đồ mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu đối chiếu coixol, mẫu thử mẫu thêm chất đối chiếu có pic với thời gian lưu tương ứng với pic coixol, thêm chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích pic coixol tăng lên (Hình 14) Phổ UV-Vis pic coixol mẫu thử tương ứng với mẫu đối chiếu; pic coixol mẫu thử, mẫu đối chiếu, mẫu thử thêm chất đối chiếu đạt độ tinh khiết kiểm tra phần mềm Empower Sắc kí đồ mẫu trắng Sắc kí đồ mẫu đối chiếu 37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc kí đồ mẫu thử Sắc kí đồ mẫu thử thêm đối chiếu Hình 14 Kết khảo sát tính đặc hiệu 4.2.4 Tính tuyến tính Nồng độ khảo sát từ 1,0 đến 500 µg/mL Kết khảo sát cho thấy phương trình hồi qui y=10586x+5847,5 với hệ số tương quan R2 = 0,9998 (Hình 15) Theo trắc nghiệm t, hệ số a có ý nghĩa, hệ số b khơng có ý nghĩa Theo trắc nghiệm F phương trình tương thích với độ tin cậy 95% Như phương trình tuyến tính coixol ӯ = 10586X Nồng độ (µg/ml) 500 Diện tích đỉnh 5316897 250 2600811 100 1096068 50 553902 25 262399 10 110423 58272 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 y = 10586x + 5847.5 R² = 0.9998 100 200 300 400 500 600 9479 Hình 15 Tương quan nồng độ diện tíc pic coixol Giới hạn phát giới hạn định lượng Tiến hành mục 3.2.1 Kết trình bày hình 16 0,125 µg/ml 0,5 µg/ml Hình 16: Sắc kí đồ phân tính coixol nồng độ 0,125 µg/ml 0,5 µg/ml 38 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Giá trị LOD LOQ xác định 0,125 µg/ml 0,5 µg/ml 4.2.5 Độ lặp lại Tiến hành xử lý sắc ký mẫu thử khác để thẩm định độ lặp lại Bảng trình bày kết thực khảo sát độ lặp lại, RSD hàm lượng coixol mẫu < 2% Kết cho thấy qui trình đạt độ lặp lại Bảng 11 Kết thẩm định độ lặp lại Khối lượng mẫu (mg) 30,0 30,0 300 30,0 30,0 30,0 Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu TB SD RSD% Diện tích pic 71388 71466 73542 70715 73916 71766 72132,17 1289,162 1,787 Hàm lượng mg/g 0,80 0,80 0,82 0,79 0,82 0,80 0,805 0,012 1,787 4.2.6 Độ Sử dụng phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch thử tỷ lệ nồng độ để thẩm định độ Bảng 12 trình bày kết khảo sát độ Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi nằm khoảng 99,0 % -106,0 % Như qui trình có độ cao Bảng 12 Kết khảo sát độ KL thêm vào (µg) Diện tích pic KL tìm thấy (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) 24,3 19,5 118921 19,7 101,03 24,3 24,3 19,5 120002.1 20,1 103,08 19,5 117029.0 19,0 97,44 24,3 24,4 135678.0 25,9 106,15 24,3 24,4 134326.6 25,4 104,10 24,3 24,4 135678.0 25,9 106,15 24,3 29,5 147570.1 30,3 102,71 24,3 29,5 149191.8 30,9 104,75 24,3 29,5 150002.6 31,2 105,76 KL sẵn % chuẩn thêm vào 80% 100 % 120 % có Trung bình % 100,51 RSD = 2,33 % 105,46 RSD = 0,97 % 104,41 RSD = 1,27 % 39 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tóm lại: Qua kết thăm dò điều kiện chiết mẫu, điều kiện khai triển sắc kí thẩm định qui trình, qui trình định lượng coixol xác lập sau Chuẩn bị mẫu: Cân xác 30 mg bột dược liệu (tồn cây, lá, hoa quả, thân) S dulcis cho vào ống nghiệm có nắp ml, thêm xác ml methanol 100% Siêu âm 45 phút 40 oC Lấy ống nghiệm ra, để dịch lắng phút Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm cho vào vial 1,5 ml triển khai UPLC Chuẩn bị phân tích UPLC: - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu Acquity UPLC (Warters), đầu dò PDA (Warters) - Cột sắc ký: Cosmosil 2,5 Cholester (2,0 ID x 75 mm; 2,5 µm) - Tốc độ dòng: 0.45 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 oC - Thể tích tiêm mẫu: 1µl - Chương trình chạy: – phút: 5% ACN, – 14 phút: -15 % ACN, 14 – 15 phút: 15-90% ACN, 15 – 24 phút: 90% ACN Cân cột vòng phút lần chạy liên tiếp - Thời gian phân tích: 24 phút - Ghi nhận kết tính tốn hàm lượng theo cơng thức mục 3.2.1 4.3 Ứng dụng qui trình định lượng coixol mẫu S.dulcis Áp dụng qui trình tiến hành định lượng mẫu Cam thảo nam thu hái Tp HCM 12 tháng (10/2017 -9/2018) mẫu Cam thảo nam thu hái địa phương khác vào tháng 3/2018 (kết trình bày Hình Hình 4) 40 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hàm lượng coixol CTN theo tháng 3.00 2.43 Hàm lượng mg/g 2.50 2.00 2.30 1.99 1.89 1.71 1.50 0.91 1.00 0.99 0.85 0.61 0.75 1.17 0.81 0.50 0.00 Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng 10 Tháng 11 Tháng 12 Hình 17: Khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái 12 tháng TPHCM Hàm lượng coixol mẫu CTN thu hái địa phương 2.5 2.14 1.99 Hàm lượng mg/g 1.75 1.5 1.18 1.16 0.93 1.25 1.07 1.06 0.83 0.67 0.46 0.5 DL VT HT BD GL KH LA ĐN1 TN ĐN LD TPHCM Hình 18: Hàm lượng coixol mẫu CTN thu hái địa phương khác (3/2018) Nhận xét: Khảo sát hàm lượng coixol CTN theo thời gian thu hái cho thấy có thay đổi, từ tháng 12 - tháng 3, hàm lượng coixol dao động khoảng 1,9 -2,4 mg/g, từ tháng hàm lượng coixol mẫu bắt đầu giảm, khoảng tháng - tháng 10 hàm lượng coixol thấp < 1,0 mg/g Thời điểm thu hái thường hướng dẫn tài liệu là: mùa xuân đến mùa hạ (Error! Reference source not found.) , qua kết khảo sát cho thấy hàm lượng coixol mẫu S dulcis cao khoảng tháng 12-3, đề xuất việc thu hái S dulcis nên tập trung vào thời gian Khảo sát hàm lượng coixol theo địa điểm thu hái 12 tỉnh cho thấy hàm lượng coixol mẫu S dulcis dao động khoảng 0,46 - 2,14 mg/g Hàm lượng coixol cao 41 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh với mẫu thu hái tỉnh Bình Dương (2,14 mg/g), thấp tỉnh Gia Lai (0,46 mg/g) Như vậy, hàm lượng coixol S dulcis thay đổi theo vùng địa lý thu hái Các mẫu thu hái tỉnh phía Nam (Bình Dương, Đồng Nai, Long An, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM) có hàm lượng cao tỉnh Tây Nguyên (Đắc Lắc, Gia Lai) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đề tài thực mục tiêu đặt ra: Xây dựng quy trình định lượng coixol S dulcis Chuẩn bị mẫu: Cân xác 30 mg bột dược liệu (toàn cây, lá, hoa quả, thân) S dulcis cho vào ống nghiệm có nắp ml, thêm xác ml methanol 100% Siêu âm 45 phút 40 oC Lấy ống nghiệm ra, để dịch lắng phút Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm cho vào vial 1,5 ml triển khai UPLC Chuẩn bị phân tích UPLC: - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu Acquity UPLC (Warters), đầu dò PDA (Warters) - Cột sắc ký: Cosmosil 2,5 Cholester (2,0 ID x 75 mm; 2,5 µm) - Tốc độ dịng: 0.45 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 oC - Thể tích tiêm mẫu: 1µl - Chương trình chạy (A: H2O; B: ACN): – phút: 5% B, – 14 phút: -15 % B, 14 – 15 phút: 15-90% B, 15 – 24 phút: 90% B Cân cột vòng phút lần chạy liên tiếp - Thời gian phân tích: 24 phút - Ghi nhận kết tính tốn hàm lượng theo cơng thức Mục 2.2.3 Thẩm định quy trình định lượng đạt yêu cầu - Đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu -Khoảng tuyến tính coixol thuộc khoảng từ – 500 µg/ml -Giới hạn phát (LOD) 0,125 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,5 µg/ml -Có độ lặp lại độ đạt yêu cầu Ứng dụng quy trình xây dựng để định lượng coixol S dulcis - Khảo sát hàm lượng coixol theo địa điểm thu hái 12 tỉnh cho thấy hàm lượng coixol mẫu S dulcis dao động khoảng 0,046% - 0,214% Hàm lượng coixol cao với mẫu thu hái tỉnh Bình Dương (0,214%), thấp tỉnh Gia Lai 42 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh (0,046%) Như vậy, hàm lượng coixol S dulcis thay đổi theo vùng địa lý thu hái Các mẫu thu hái tỉnh phía Nam (Bình Dương, Đồng Nai, Long An, Bà Rịa – Vũng Tàu, TPHCM) có hàm lượng cao tỉnh Tây Nguyên (Đăc Lăc, Gia Lai) - Khảo sát thay đổi hàm lượng coixol phận theo thời gian thu hái TPHCM, lượng coixol tập trung nhiều hoa và thân, khoảng thời gian từ tháng 12 đến tháng mẫu S dulcis có chứa nhiều coixol Vì đề xuất thu hái Cam thảo nam nên tập trung vào thời gian Các hướng nghiên cứu tiếp theo: - Khảo sát hàm lượng coixol mẫu S.dulcis thu hái số tỉnh miền Trung, miền Bắc để có số liệu thống kê, từ qui định giới hạn hàm lượng coixol S.dulcis đạt - Thẩm định quy trình định lượng mẫu cao S.dulcis để xây dựng cao định chuẩn - Xác định số chất marker khác alkaloid S.dulcis, từ tiến hành xây dựng quy trình định lượng đồng thời nhiều hợp chất S.dulcis để nâng cao tiêu chuẩn 43 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Phương Bình (2016), Khảo sát thành phần hóa học Cam thảo nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Y dược TP.HCM Trần Thị Thanh Diệu (2016), Khảo sát thành phần alkaloid Cam thảo Nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Y dược TP.HCM Viện Dược Liệu (2006), Cây Thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 334-336 Lý Kiến Hoa (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học cao dichloromethan Cam thảo nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM) Tôn Nữ Liên Hương, Bùi Minh Phúc, Huỳnh Diễm Tú, Lê Thị Thùy Trang (2016), “Các hợp chất methoxylflavonoid coixol phân lập từ cam thảo đất (Scoparia dulcis Linn)”, Tạp chí Hóa học, 54(5), 586-590 Bộ Y tế (2018), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1096-1097 Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Ali A., Haq F U., Arfeen Q., Sharma K.R., Adhikari A., Musharraf S.G (2017), “Sensitive Quantification of Coixol, a Potent Insulin Secretagogue, in Scoparia dulcis Extract using High Performance Liquid Chromatography combined with Tandem Mass Spectrometry and UV Detection”, Biomedical chromatography, 31(10) Butterstein M., Weisinger A., Faulkner J (1988), “The Plant Metabolite , 6Methoxybenzoxazolinone , Stimulates an Increase in Secretion of Follicle-Stimulating Hormone and Size of Reproductive Organs in Microtuspinetorum”, Biology of Reproduction, 38(4), 817–820 Chen J., Montanari A M., Widmer W W (1997), “Two New Polymethoxylated Flavones, a Class of Compounds with Potential Anticancer Activity, Isolated from Cold Pressed Dancy Tangerine Peel Oil Solids”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45(2), 364-368 Chiu-Ming C., Ming-Tyan C (1976), “6-methoxybenzoxazolinone and triterpenoids from roots of Scoparia dulcis”, Phytochemistry, 15(12), 1997-1999 De Farias Freire S M., Da Silva Emim J A., Lapa A J et al 1993), “Analgesic and antiinflammatory properties of Scoparia dulcis L Extracts and glutinol in rodents”, Phytherapy Research, 7(6), 408-414 Freire S M., Torres L M., Roque N F et al (1991), “Analgesic activity of a triterpene isolated from Scoparia dulcis L (Vassourinha)”, Memorias Instuto Oswaldo Cruz, 86( 2), 149-151 Gomita Y., Ichimaru Y., Moriyama M et al (1981), “Behavioral and EEG effects of coixol (6-methoxybenzoxazolone), one of the components in Coix lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf”, Folia Pharmacol Jpn, 77(3):245-259 Hancock R D., (1993), “Venipuncture vs Arterial catheter activated partial thromboplastin times in heparinized patients” Dimensions of Critical Care Nursing, 12(5), 238-245 44 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Hayashi K., Niwayama S., Hayashi T et al, “In vitro and in vivo antiviral activity of scopadulcic acid B from Scoparia dulcis, Scrophulariaceae, against herpes simplex virus type 1”, Antiviral Research, 9(6), 345-354 Hayashi T (2000), “Biologically active diterpenoids from Scoparia dulcis L (Scrophulariaceae)”, Studies in Natural Product Chemistry, 21(part B), 689-727 Hayashi T., Gotoh K., Ohnishi K et al (1994), “6-Methoxy-2-benzoxazolinone in Scoparia dulcis and its production by cultured tissues” Phytochemistry,37(6),16111614 Hayashi T., Uchida K., Hayashi K et al, (1988), “A cytotoxic flavone from Scoparia dulcis L., Chemical and Pharmacetical Bulletin, 36(12), 4849-4851 Huber Ludwing (2007) Validation and qualification in analytical laboratories, second edition, pp.125-161 Jae H., Jiho L., Su R., Park H (2014), “Suppressive effects of coixol, glyceryl trilinoleate and natural products derived from Coix lachryma-jobi var ma-yuen on gene expression, production and secretion of airway MUC5AC mucin”, Archives of Pharmacal Research, 38(5), 620-627 Latha M., Pari L., Mohan K (2009), “Antidiabetic effects of scoparic acid D isolated from Scoparia dulcis in rats with streptozotocin-induced diabetes”, 23(16), 1528-1540 Li W L., Zheng H C., Bukuru J et al (2004), “Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus”, 92(1), 1-21 Li Y., Chen X., Satake M (2004), “Acetylated Flavonoid Glycosides Potentiating NGF Action from Scoparia dulcis, Journal of Natural Products, 67(4), 725-727 M R Mishra, A Mishra, D K Pradhan et al, “Antidiabetic and Antioxidant Activity of Scoparia dulcis Linn” Indian journal of pharmaceutical sciences, 75(5), 610-614 Mahato S B., Das M C., Sahu N P (1981), “Triterpenoids in Scoparia dulcis”, Phytochemistry, 20(1), 171-173 Mesía-Vela S., Bielavsky M., Torres L M B et al (2007), “In vivo inhibition of gastric acid secretion by the aqueous extract of Scoparia dulcis L in rodents”,Journal of Ethnopharmacology, 111(2), 403-408 Mishra M R., Behera R K., Jha S et al (2011), “A brief review on phytoconstituents and ethnopharmacology of Scoparia dulcis Linn (Scrophulariaceae)”, International Journal of Phytomedicine, 3(4), 422-438 Nagao T., Otsuka H., Kohda H., Sato T (1985), “Benzoxazinones from Coix lachrymajobi var ma-yuen”, Phytochemistry, 24(12), 2959-2962 Negus C (1987), “Effect of 6-Methoxybenzoxazolinone Breeding Performance in Microtucs on Sex Ratio montanus and effort”, Biology of Reproduction 36, 255-260 Nishino H., Hayashi T., Arisawa M et al (1993), “Antitumor-promoting activity of scopadulcic acid B, isolated from the medicinal plant Scoparia dulcis L.” Oncology (Switzerland), 50(2), 100-103 Praveen T K., Dharmaraj S., Bajaj J et al (2009), “Hepatoprotective activity of petroleum ether , diethyl ether , and methanol extract of Scoparia dulcis L against CCl4-induced acute liver injury in mice”, 41(3), 110-115 Ratnasooriya W D (2009), “A Review on Herbs Used in treatment of Diabetes Mellitus by Sri Lankan Ayurvedic and Traditional Physicians”, Research article, 30(4), 373-391 45 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Report T D (2002), “Technical Data Report for Vassourinha (Scoparia dulcis)”, Austin, Texas: Sage Press Riel M A., Kyle D E., Milhous W K (2002), “Efficacy of Scopadulcic Acid A against Plasmodium falciparum in Vitro”, 65(4), 614-615 Sahoo A K., Madhavan V (2009), “Hepatoprotective Evaluation of Scoparia Hepatoprotective Evaluation of Scoparia” 6(1), 1553-1573 Schadler H., Butterstein M (1988), “The Plant Metabolite Stimulating Hormone to Enhance Interacts with Ovarian Growth”, Biology of Reproduction, 39(2), 465-471 Sharma K.R., Adhikari A., Hafizur R M et al (2015), “Potent insulin secretagogue from Scoparia dulcis Linn of nepalese origin”, Phytotherapy Research, 29(10), 16721675 Thaggikuppe P., Razdan R., Neelathahalli M (2008), “Hepatoprotective activity of Scoparia dulcis Linn against carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis in rats”, Asian Journal of Traditional Medicines, 3(4), 153-159 Tsai J C., Peng W H., Chiu T H et al (2011) “Anti-inflammatory effects of Scoparia dulcis L and betulinic acid, The American Journal of Chinese Medicine , 39(5), 943956 Wang H X., Ng T B (2002), “Demonstration of antifungal and anti-human immunodeficiency virus reverse transcriptase activities of 6-methoxy-2benzoxazolinone and antibacterial activity of the pineal indole 5-methoxyindole-3acetic acid”, Comparative Biochemistry and Physiology, 132(2), 261-268 Wu W H , Chen T Y., Lu R W et al (2012), “Benzoxazinoids from Scoparia dulcis (sweet broomweed) with antiproliferative activity against the DU-145 human prostate cancer cell line”, Phytochemistry, 83, 110-115 Zhang X., Habib F K., Ross M., et al (1995), “Isolation and characterization of a cyclic hydroxamic acid from a pollen extract, which inhibits cancerous cell growth in vitro” Journal of medicinal chemistry, 38(4), 735-738 Zulfiker A H., Ripa F A., Rahman M M et al (2010), “Antidiabetic and antioxidant effect of Scoparia dulcis in alloxan induced albino mice” International Journal of PharmTech Research, 2(4), 2527-2534 Zulfiker A H., Siddiqua M., Nahar L et al (2011), “In Vitro Antibacterial, Antifungal & Cytotoxic Activity of Scoparia dulcis L.”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3( 2), 198-203 International Conference on Harmonization (ICH), Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology, May 1997 46 ... -Giới hạn phát (LOD) 0,125 µg/ml, giới hạn định l? ?ợng (LOQ) 0,5 µg/ml -Có độ l? ??p l? ??i độ đạt yêu cầu Ứng dụng quy trình xây dựng để định l? ?ợng coixol S dulcis - Khảo sát hàm l? ?ợng coixol theo địa điểm... qui định giới hạn hàm l? ?ợng coixol S .dulcis đạt - Thẩm định quy trình định l? ?ợng mẫu cao S .dulcis để xây dựng cao định chuẩn - Xác định số chất marker khác alkaloid S .dulcis, từ tiến hành xây dựng. .. coixol Cam thảo nam? ?? thực với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định quy trình định l? ?ợng coixol Cam thảo nam phương pháp sắc ký l? ??ng hiệu cao với đầu dò đa sóng (UPLC-PDA) - Ứng dụng quy trình xây