Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Nghiên cứu định lượng clarithrommycin nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang
Trang 1BO Y TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
NGO THI DUYEN
NGHIEN CUU DINH LUONG CLARITHROMYCIN NGUYEN LIEU BANG PHUONG PHAP TAO CAP ION —
CHIET DO QUANG
(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC KHOA 2004-2009)
Người hướng dẫn : PGŒS.7S.7R.ẢN ĐÚC HẬU Nơi thực hiện đề tài : Bộ môn Hóa duoc
Thời gian thực hiện : ///2008 — 05/2009
Ề 15.6.2) THU EN |
\ ke 0609 /
Trang 2LOICAMON
Đề hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước hết với lòng kính trọng
và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.T.S.TRẢN ĐỨC HẬU, người thây đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện đề
tài
Tôi xin chân thành cảm ơn các thây cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên
ở bộ môn Hóa Dược đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời
gian làm thực nghiệm tại bộ môn
Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cần bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo trong suốt năm năm tôi
học tập tại đáy
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính yêu, người thân, bạn bè — những người đã luôn bên cạnh động viên, yêu quỷ và chăm lo cho tôi trong cuộc sông và sự nghiệp
Hà Nội, ngày 19 tháng Š năm 2009
Sinh viên
Trang 3
MỤC LỤC
DANH MUC CHU VIET TAT DANH MUC BANG
DANH MỤC HÌNH
KD dao ier sGaraaaeaadrecire-ởnnneẩadie=
PHAN I: TONG QUAN
1.1 Đại cương về CURT TEM TO MEY COIR Ga wátt4kccbcccoiiaccz06sebssbkiaiyx
1,11: CN ee nai kesievsadelaits40sezEei ý 1.1.2 Các phương pháp định lượng Clarithromycin - -‹-<-
1.2 Phương pháp phân tích quang phô U'V- VIS - 255555552 1,2,1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích quang phổ UV - VIS
1.2.2, Các phương pháp định lượng của phương pháp quang phê UV -
PHÀN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUÁ -
2.1 Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.1 Nội dung nghiên cửu
2.1.2, Đối tượng nghiên cứu -.-.s
2.1.3, Phương pháp nghiên cứu -
2.2 Thực nghiệm và kết qua
2.2.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện định lượng
2.2.2 Xây dựng phương pháp và ứng dụng - - sec
B'S; Dah gh phar pPHẨD,.¿:.z⁄2:2022242)6020022601 V000
1Á ĐÀN LUẬN ve encn co ccceeiaesaseessacasosssrsaen PHAN 3: KET LUAN VA BE XUẤT ¿c 7 6222026: 66 << GA MAE DR ites soscssccsonaxessixerasnnnieacescswoenusmsepuseanianeNceNesKiesios
OE ẶĂẶằẶẶằằẶẶ-Ặằ-ằ-ằằớ-Ặằ.ẮằẳằẰẰằẶẰ—_—-
TAI LIEU THAM KHAO
Trang
Trang 4
DANH MUC CHU VIET TAT
BP British Pharmacopoeia — Duge dién Anh Dd - Dungdich | '“g: DĐ Dược điền 'DĐVN | Dược điển Việt Nam poeơœ+nd, DOSS Dioctylsulfosuccinat HPLC High performance liquid chromatography - Sắc Ì ký lỏng hiệu năng Cao
JP Japanese Pharmacopoeia — Duge dién Nhat Titi
PL Phu luc whet
STT Số thứ tự ng rit
USP United States Pharmacopoeia — Dược điện Mỹ
'UV-VIS_ | Ultraviolet- Visible
VTYT Vật tư y tế c
Trang 5
DANH MUC BANG STT Tén hinh Trang
Bang1 _| Cac điều kiện sắc ký định lugng Clarithromycin 7
Bang 2.1 | Pha các bình mẫu chiết ee
Bang 2.2 | Các cực đại hấp thụ của cặp ion Clarithromycin— | 23
Bromocresol
Bảng 2.3 | Độ ổn định của độ hấp thụ theo thời gian a
Bang 2.4 | Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm tới mật độ quang 25
Bang 2.5 | Pha các bình mẫu chiết để khảo sátảnhhưởngcủapH | 25_
Bảng 26 | Anh huong cua pH toi mat độ quang | 3% "
Bảng 2.7 | Độ hấp thụ của dịch chiết với số lần chiết khác nhau _26
Bang 2.8 | Xác định tỷ lệ cầu tử trong phức chất — 2]
Bang 2.9 | Két qua dinh lượng Clarithromycin trong nguyên liệu 29
Bảng 2.10 | Chuẩn bị dãydungdịhchẩn | 30 `
Bang 2.11 Két qua xác định tính tuyến tính của phương pháp TW
Bảng 2.12 | Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp 32
Trang 6DANH MỤC HÌNH STT Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 - Hình 2.4 | "Hình 2.5 Hình 2.6 Tên hình
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ
quang theo phương pháp đường chuẩn
|Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào
với độ hấp thụ quang theo phương pháp thêm đường chuân
Trang 14 15
DO thi biéu dién méi quan hé giữa thề tích thuốc thử và độ hấp thụ quang theo phương pháp chuẩn độ đo quang
Phổ hap thụ ánh sáng của dung dịch cặp ion C larithromycin
- Bromocresol trong chloroform
Đồ thị biều diễn Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nông độ dung dịch
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban
Trang 7DAT VAN DE
Sức khoẻ là vốn quí của mỗi con người, con người là nguồn tài nguyên quan trọng của mỗi quốc gia Vì vậy, việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân là trách nhiệm của toàn xã hội và trực tiếp là của nghành y tế Đề góp phần chăm sóc, bảo vệ và nâng cao sức khoẻ con người thì vấn đề đảm bảo chất lượng thuốc là rất quan trọng, bởi vì chất lượng thuốc ảnh hưởng
lớn đến tính mạng, sức khoẻ người bệnh và hiệu quả điều trị
Trong công cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở
thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của Y học hiện đại
Clarithromycin là một kháng sinh thuộc họ Macrolid, đã và đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường và có vị trí tin cậy trong điều trị Sự thay đổi cầu trúc với nhóm thế methoxy ở vị trí C- 6 của vòng macrolid đã làm cho Clarithromycin gia tăng tính thân dầu, mở rộng phổ kháng khuẩn, gia tăng nòng độ trong mô cải thiện tính ôn định trong môi trường acid, gia tăng sinh khả dụng và giảm tác dụng phụ trên đường tiêu hoá [27] Thuốc có thời gian bán thải dài hơn Erythromycin và thải trừ một phần đáng kể qua nước tiêu nên có lợi cho nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục hơn các thuốc khác trong nhóm Clarithromycin tác động mạnh lên các vi khuẩn Streptococcus, Staphylococus, Helicobacter pyÌori và các vi khuẩn cơ hội mạnh hơn Erythromycin [1]
Nhưng Dược điển Việt Nam III chưa có chuyên luận kiêm nghiệm
Clariththromycin nguyên liệu cũng như các dạng bào chế chứa hoạt chất
này Các Dược điền nước ngoài như DĐ Mỹ (USP 31) DĐ Nhật (JP 2006)
DD Anh (BP 2008), DD Trung Quéc 2005 dinh lugng Clarithromycin bang
phuong phap HPLC [25], [24], [17], [22], DD Trung Quéc 2000 dinh lượng
Trang 8
yêu cầu cơ sở vật chất nghiềm ngặt, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, dung môi tốn
kém Với hi vọng có thể tìm ra phương pháp định lượng Clarithromycin phú
hợp với điều kiện cơ sở vật chất và điều kiện kinh tế của các trung tâm kiêm nghiệm dược phẩm ở các địa phương nhưng vẫn đam bảo độ chính xác, tin cậy phục vụ cho công tác kiếm tra chất lượng thuốc chúng tôi thực hiện dé tài: “Nghiên cứu định lượng Clarithromyein nguyên liệu bằng phương
pháp tạo cặp ion - chiết đo quang” với những mục tiêu sau:
- Khảo sát các điều kiệm và xây dựng phương pháp định lượng Clarithromycin nguyên liệu
Trang 9PHẢN 1: TÔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VE CLARITHROMYCIN 1.1.1, CLARITHROMYCIN [1], {2}, [8], [17], [1§), [24], [25] % Céu tric: Heterosid than lipid
Clarithromycin chia vong lacton 14 cau tir la khang sinh nhóm macrolid, được bán tông hop tir Erythromycin A bling cach thay -OH (6 vj
trí 6) bằng nhóm -OCH; (methoxy)
Phần genin là vòng lacton lớn gêm alkyn và nhóm -OH Phần đường (ose) gồm các đường trung tính vả đường amin, đường amin đưa lại tính base cho phân tử
+ Công thức phân tứ : C¿H„„NO¡; 4 Phân tử lượng — - 748 + Tên khoa học : (3R4S.5S6R,7R,9R,LIR.12R.135,14Ñ)-4{(2,6- Dideoxy-3-C-methyl-3-O0-methyl-a-L-ribo-hexopyranosyn)oxy }-14-ethyl- 12,13-dihydroxy-7-methoxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3- (dimethylamino)-f-D-xyfa-hexopyranosyl]oxy}]oxacyclotetrađecane-2, I0-
dione Hoặc 6-Ø-methylerythromycin A + Công thức câu tạo:
Trang 10
%* Tính chất hóa lý: [2], [15] [24] [25]
- Bột kết tỉnh màu trắng hoặc gần như không màu, vị rất đắng
- Gần như không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol tuyệt đối
dễ tan trong aceton, methylen clorid
- Bên ở pH acid
-_ Vòng lacton dễ bị phá vỡ ở môi trường pH quá kiềm hoặc quá acid - Cho phan tng mau voi acid hydrochloric, acid sulfuric dam đặc:
+ Tác dụng với acid sulfuric tao mau do nau
+ Tac dung véi acid hydrochloric xuat hién mau d6 cam rồi chuyên sang do tim -_ Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng - Định lượng (xem mục 1.1.2) s* Tác dụng dược lý: [l] [§] - Tác dụng:
+ Clarithromycin thường có tác dụng kìm khuẩn, ngoài ra có thê có tac dụng diệt khuẩn ở liều cao hoặc đối với những chủng nhạy cảm
+ Clarithromycin tác động lên các vi khuân Staphylococcus, Streptococus, Helicobacter pylori và các vì khuân cơ hội mạnh hơn Erythromycin Ngoài ra, Clarithromycin còn có tác dụng rất mạnh đối với
Chlamydia spp, Ureaplasma urealyticum va Mycobacterium avium
- Cơ chế: Clarithromycin ức chế sự tông hợp protein ở vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosom, làm cho các acid amin không gắn vào chuỗi peptid đang thành lập, do đó không tông hợp được các protein cân thiết
s* Chỉ định:
Trang 11quản mạn có đợt cấp viêm phổi, da và mô mềm Đặc biệt đề điều trị viêm
phdi do Mycoplasma pneumoniae va Legionella, bénh bach hau va giai doan đầu của ho gà và nhiễm khuan co héi do Mycobacterium
- Clarithromycin được dùng phối hợp đề diệt trir Helicobacter pylori trong loét da day- ta tràng đang tiền triên
s* Chống chỉ định:
- Người bị dị ứng với các macrolid
- Chống chỉ định tuyệt đối dùng chung với terfenadin
s* Liêu lượng:
- Người lớn: 250-500 mg, 2 lần/ngày
- Trẻ em: Liều thông thường: 7.5 mg/kg thé trong, 2 lan/ngay
- Clarithromycin dùng phối hợp với các chất ức chế bơm proton và các
thuốc khác với liều 500 mg 3 lần/ngày đề diệt tận gốc H pylori
1.1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLARITHROMYCIN
1.1.2.1 Phương pháp vi sinh vật * Nguyên tắc: [9]
Clarithromycin khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy vi
sinh vật chỉ thị, tạo ra các vùng ức chế vi sinh vật có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nòng độ tương ứng Hoạt lực của Clarithromycin được so sánh với Clarithromycin chuẩn theo phương pháp thống kê
* Phương pháp I: [23]
- Ching vi khuan: Bacillus Pumilus CMCC(B)63202
- Môi trường nuôi cay:
Pepton 5g
Cao thit 3g
Dikali hydro phosphat 3g
Trang 12Nước cất 1000 ml pH sau khi tiệt trùng 7,8 - 8,0
- Dung dịch đệm phosphat pH 7.8:
Dikali hydro phosphat 5,59 g
Kali dihydro phosphat 0,41 g
Nước cất 1000 ml
- Chuẩn bị dung dịch thử và chuân đề được các dung dịch có nồng độ khoảng 2-8 Unit/ml Sau đó tiến hành thử và tính kết quả
* Phương pháp 2: [7], [10], [11], [15]
Ap dung dé dinh luong vién nén Clarithromycin - Ching vi khuan: Bacillus pumilus ATCC 8241
- Môi trường nuôi cây: Dùng môi trường kháng sinh số 5 DĐVN III Pepton khô 6g Cao men bia 3g Glucose 10g Casein pancreatic 4g Thach lg Nước cất 1000 ml pH sau tiệt trùng 8,0 + 0,2
- Dung dich dém phosphat pH 8,0:
Dikali hydro phosphat 16,75 g
Kali dihydro phosphat 0,523 g
Nước cất 1000 ml
Trang 131.1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Các điều kiện sắc ký định lượng Clarithromycin theo DĐ Mỹ (USP 31)
DD Nhat (JP 2006), DDB Anh (BP 2008) va DD Trung Quốc 2005 được trình bay trong bang 1
Bang 1 : Các điều kiện sắc ký định lượng Clarithromycin Tài liệu [17], [18], [25] [22] [24]
Pha động Acetonitril- Acetonitril- Acetonitril-
Trang 141.1.2.3 Phương pháp đo UV — VIS:
Ap dụng đề định lượng viên nén Clarithromycin * Phương pháp I: [19]
Dựa trên cơ sở tạo ra sản phâm màu với eosin Y trong môi trường đệm có pH trung tính
- Pha dãy dung dịch chuân:
Cân chính xác khoảng 20 mg Clarithromycin chuẩn, hòa tan trong 60 ml HCI 0,1M, siêu âm trong 2 phút để hòa tan hoàn toàn, điều chỉnh pH đến
6- 7 bằng dung dịch NaOH 0,4M và thêm nước vừa đủ 100 ml Tiếp tục pha
loãng dung dịch này để được dung dịch có nồng độ trong khoảng 3-30
ug/ml Lay chính xác những thê tích của dung dịch vừa pha loãng cho vào l dãy các bình định mức 10 ml, thêm nước cất đến khoảng 7 ml Thêm vào mdi binh 1,2 ml eosin Y 0,004M, lắc đều, thêm 1 ml đệm acetat 0,4 M pH 3
Thêm nước vừa đủ 10 ml
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 542-544 nm Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ các dung dịch chuẩn
- Dung dịch thử:
Cân Š viên, nghiên thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 20 mg Clarithromycin Hòa tan bằng 80 ml HCI 0,1M, siêu
âm trong 20 phút, sau đó đề trong nước đá một thời gian đề phần không tan
lắng xuống, lọc vào bình định mức 100 ml, điều chỉnh pH đến 6-7 Thêm
nước vừa đủ 100 ml Tiếp tục pha loãng dung địch này để được dung dịch có nòng độ trong khoảng 3-30 ug/ml Phần còn lại tiến hành tương tự dung dịch
chuẩn, bắt đầu từ: “Lấy chính xác những thẻ tích ”
Tính nồng độ của Clarithromycin dựa vào đường chuẩn hoặc phương
Trang 15* Phương pháp 2: [21]
Dựa trên cơ sở tạo thành sản phẩm màu với 2.4- dinitrophenyl
hydrazin trong sự có mặt của xúc tác acid - Dung dịch thử:
Cân 20 viên nén, nghiền thành bột mịn Lấy một lượng bột tương đương với khoảng 50 mg Clarithromycin, thém 5 m] nước cất, hỗn dich tao thành được chiết 3 lần với 25 ml diethyl ether, mỗi lần lắc 5 phút Tập trung dịch chiết và lọc qua Na;SO¿ khan, hứng dịch lọc vào cốc Rửa NazSO¿ bằng I0 ml diethyl ether Dịch lọc và nước rửa được cô đến khô trong nôi cách thuỷ ở 40- 45°C Cắn thu được tiếp tục bốc hơi trong chân không trong 30
phút để bay hơi hết dung mdi Can cuối cùng được hoà tan trong 10 ml methanol, cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol đến vạch
- Dung dịch chuẩn:
Chuan bị dung dich Clarithromycin chuẩn nồng độ l mg/ml trong
methanol
- Tiến hành:
Lấy chính xác 1 thể tích dung dịch thử và chuẩn ở trên pha loãng tiếp
trong methanol để được dung dịch có nòng độ trong khoảng 50- 350 ug/ml
Lấy 1 ml cho vào ống nghiệm khô, thêm 2 ml 2,4- dinitrophenyl hydrazin 0,005M, nhỏ từ từ 0,05 ml HCI đặc Đặt ống nghiệm trong nồi cách thuỷ ở
100C đê bay hơi hết dung môi Cắn thu được đề nguội ở nhiệt độ phòng sau đó thêm 3 ml dung dich KOH 0,1786M trong methanol, tron ky va dé yên ở nhiệt độ phòng 30 phút, thỉnh thoảng lắc Chuyên hỗn hợp vào bình
định mức 10 ml, thêm dimethylformamid đến vạch, lắc đều và đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 523-526 nm, tiến hành song song với mẫu
Trang 161.1.2.4 Phương pháp quang phố huỳnh quang: [20]
Dựa trên sự oxy hoá bởi ceri VI trong sự có mặt cua acid sulfuric và sự
kiểm tra phat quang cua ceri III
Bước sóng kích thích 25Š nm, bước sóng huỳnh quang 348 nm
Khoảng nông độ tuyến tính 42,6- 1200 ng/ml
1.2 PHUONG PHAP PHAN TICH QUANG PHO HAP THU TU NGOAI KHA KIEN UV- VIS
1.2.1 CO SO LY THUYET [4], [5], [6], [9], [16]
1.2.1.1 Phố hấp thụ và việc lựa chọn bước sóng cho phân tích quang
pho UV- VIS
Các chất có tính chất hấp thụ bức xạ ánh sáng một cách có chọn lọc Miền bức xạ mà chất nghiên cứu hấp thụ mạnh nhất ứng với năng lượng của bước chuyền điện tử Đê tìm năng lượng của bước chuyền điện tử ta có thé nghiên cứu sự phụ thuộc mật độ quang của dung dịch A theo bước sóng i
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ A- 2 trong hệ toạ độ vuông góc gọi là phô hấp
thụ Đồ thị thường có dạng đường cong Cuc dai A,,,x Ung voi gia tri Ama, 1a cuc dai hap thy Khi tién hanh phan tich quang phé UV- VIS, ngudi ta thường chọn đo mật độ quang của dung dịch nghiên cứu tại À„„ vì đo A ở Àma„ sẽ cho kết quả phân tích có độ nhạy và độ chính xác tốt nhất
1.2.1.2 Định luật Lambert- Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng À và cường độ I„ qua dung dịch đồng nhất có nòng độ C, bề dày lớp dung dịch là l Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại I di qua dung dich
M6i quan hé gitra I va I, duge thé hiện bằng định luật Lambert- Beer:
I=I,x 10™
Trang 17¢ là hệ số hấp thụ mol của dung dịch, phụ thuộc vào bản chất dung
dịch, bước sóng của ánh sáng đơn sắc chiếu vào dung dịch
1.2.1.3 Điều kiện ứng dụng định luật Lambert- Beer
Chùm tia sáng phải đơn sắc
Dung dịch phải loãng (năm trong khoảng nông độ thích hợp) Dung dịch phải trong suốt (trừ chuân độ đo quang)
Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh sang (UV- VIS)
1.2.1.4 Sự sai lệch đối với định luật Lambert- Beer
- Sai lệch do máy: do bộ phận đơn sắc, bộ phận phát hiện kém - Sai lệch do hóa học:
+ Do sự phân ly (ion hóa): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử
chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và đạng ion phân ly là
không như nhau
+ Do sự tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng phân tử
- Do phản ứng các chất lạ:
+ Các chất lạ có thê phản ứng với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta có thể dùng mẫu trắng có thành phần như mẫu thử, chỉ thiếu chất cần định lượng
+ Sự hấp thụ của các chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết
quả định lượng Vì vậy trong quá trình làm phản ứng “tạo màu” phải chú ý
tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng 1.2.1.5 Một số đại lượng thông dụng
* D6 truyén qua (T- Transmittance):
Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho sự trong suốt về mặt quang học của dung dịch, được định nghĩa:
Trang 18Ẻ
cepa: See
T i 10
Thuong T tinh ra phan tram (%)
* D6 hap thu (A- Absorbance):
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa: l
ext ——
A a c.C.]
Đối với một chất xác định (có e xác định), thường đo trên một loại cóc
đo (có bè dày thông thường là l = Iem), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A=k.C (k = €.l) * Hệ số hấp thụ phần trăm (E“" ): Theo công thức A = e.C.l, nếu l = lem, C = 1% thì: A=e=EK
Vay E'"chinh 1a d6 hap thu ctia dung dich cé noéng dé 1%, ding céc đo bề dày lem Với một chất tan xác định, tại một 2 xác định, E!“ là một
hang so
* Hệ số hấp thụ phân tử tu):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol, là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1 mol/l, dùng cốc đo bề dày lcm
Cũng như E]"với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (bước sóng, dung môi, nhiệt độ, ), e„ là một hằng só
Gitta E's" và e„ có mối liên hệ: e„ = m xM
Ở đây M là phân tử gam của chất tan
Trang 19
1.2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG [3], [4], [9] [16] 1.2.2.1 Phương pháp đo phố trực tiếp
Đo độ hấp thu A cua dung dich, tinh nong độ C của dung dịch dựa vào giá trị E|Z' biết trước (tra cứu) A=E.C.l Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra may đo về bước sóng (2) và mật độ quang A bằng cách: - Dùng đèn thủy ngân, đèn D; (cho một vạch sáng có bước sóng xác định)
- Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh đề tìm sai só
- Dùng kính lọc Holmium (có giá trị 2.„„„ xác định cho trong tài liệu) dé kiểm tra lại máy
- Dùng dung dịch K;CrO¿, K;Cr;O; tinh khiết quang phô pha thành
dung dịch có nồng độ chính xác Đo phô tìm các giá trị Amax Va Amax-
1.2.2.2 Phương pháp so sánh
Đo độ hấp thu A,, A cua dung dich thir nông độ C, (chưa biết) và dung
dịch chuẩn có nông độ C, (đã biết) Ta có: fy E ch 4c € ỀÈ * a2" c
Chú ý: Nồng độ của các dung dịch thử C, và dung dịch chuẩn C, phải năm trong khoảng tuyến tính Nếu chưa xác định được khoảng tuyến tính thì nòng độ của các dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác hơn 1.2.2.3 Phương pháp thêm chuẩn so sánh
Đo độ hấp thụ A, của dung dịch cần tìm nồng độ C, Thêm một lượng
chat tan a (đã biết) vào dung dich dé tao néng dé C,, do d6 hấp thụ A,` của
dung dich tao thanh
Trang 20A (og A, rad tL — -„— _ NHÀ A,’ cC +€, A,'=A, Cc, +C, -€, se Cha == Á-A, 1.3.2.4 Phương pháp đường chuẩn
Chuẩn bị khoảng 5 đến 8 dung dịch chuẩn có nông độ cách nhau Ax, do A của chúng ở bước sóng đã chọn, lập đỗ thị của A theo C Đo A, của dung dịch thử và xác định C, dựa vào đường chuẩn (hình 1.1)
Hình 1.1 Đỗ thị biểu điển mỗi quan hệ giữa nẵng độ và độ hắp thụ
quang theo phương pháp đường chuẩn
Trong trưởng hợp không tuân theo định luật Lambert- Beer (đường chuẩn không thẳng) cằn pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nỗng độ gần nhau (khác nhau không quá 10%)
Khi xây dựng đường chuẩn người ta thường sử dụng đường chuẩn tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng
trong định lượng nêu đường cong (phỉ tuyến, không thẳng)
Đường chuẩn được dựa vào các điểm thực nghiệm bằng phương pháp
bình phương tối thiểu, tìm phương trình của đường hỏi quy tuyến tính
Trang 21(thăng) hay phi tuyến tính (cong) và tính hệ số tương quan Trong định lượng nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có hệ số tương quan r >
0.9995 là tốt
1.2.2.5 Phương pháp thêm đường chuẩn
Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm những lượng
khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng, đo mật độ quang của các dung dịch đó Vẽ đường chuẩn (đô thị của độ hấp thụ A theo lượng chất thêm vào) Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng độ của dung dịch cần định lượng
-002 -0.01 0 0.01 0.02 0.03 0.04 005 Nồng độ
Hình 1.2 Đồ thị biểu hiện mỗi quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào với độ hấp thụ quang theo phương pháp thêm đường chuẩn
Trang 22Tại điểm tương đương, xuất hiện điểm gay cua đồ thị biểu diễn sự biến
thiên của độ hấp thụ A của dung dịch Trên đô thị, trục tung chỉ độ hấp thụ
A của dung dịch, trục hoành chỉ lượng thuốc thử cho vào dung dịch cần định lượng (Hình 1.3.) 9 8 | z 7 + a 6“ ` ' & 5 + ' Q 4 | ' Diém a !— kếtthúc ^- 14 ff 0 : ` 0 1 2 3 4 Thể tích thuốc thử
Hình 1.3 Đ thị biểu diễn mỗi quan hệ giữa thể tích thuốc thử và độ hấp
thụ quang theo phương pháp chuẩn độ đo quang
Điều quan trọng của phương pháp này là tìm được bước sóng thích hợp để xác định điểm tương đương
- Ưu điểm của phương pháp: phương pháp này có ưu điểm nổi bật là vẫn định lượng được trong một số trường hợp mà các phương pháp khác không áp dụng được:
+ Dung dịch có màu không quá đậm + Dung dịch không quá đục
+ Dung dịch không tìm được chỉ thị màu
Trang 231.2.2.7 Phương pháp định lượng hỗn hợp
Dựa trên tính chất cộng tính của độ hap thu anh sang ta co:
A,=A;+A2+
Với hỗn hợp 2 chất 1 và 2 ta có: A,= A¡ + Az
Lựa chọn các bước sóng À; và À¿, đo độ hấp thụ Ay, A» cua hỗn hợp ở 2 bước song A; va A> do
Tai Ay: Ag = Ey; x Cy + En) x Cr Tal Ax: Ap = Ey2 x C; + Ex x C
Cac hé s6 E;), Ej2, E>), Ex 1a cdc hang s6 da biết Giải hệ phương trình
2 ân số trên, ta tinh duoc C; va Co
Chú ý: Trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất
không hấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kề thì ta có thê pha loãng dung địch rồi đo A như khi đo một chất
1.2.2.8 Phương pháp chiết cặp lon (hay phương phap acid mau) [5],
[12], [13], [14], [16]
* Nguyên tắc:
Khi cho một ion tác dụng với một ion trái dấu có thể hình thành một cặp ion giống như phân tử trung hòa điện và có thê chiết bằng dung môi hữu cơ
A +B=AB
[4] x[B"] [A B"]
* Các yếu tố ảnh hưởng đến chiết cặp ion: [12], [16]
Cặp ion này có hằng số phân ly: Kạ=
Trang 24Ví dụ:
xA™ + yB(H'} = Ax”B,(H}
(anion của acid) (cation của base) (cap ion)
* Nguyên tắc định lượng clarithromycin nguyén liéu bằng phương pháp chiết cặp ion - đo quang
(C;¡H¡:BrO¿S)-OH - (C>,H)3BrOyS)-O= + H†r
(xanh bromocresol) anion (1) (proton)
C3gsHgpNO}3 + HCl << = CygHyN'Oi3Cr
C3gH7N"O;3Cl- - C;sH;oN Ola + Cr
(clarithromycin hydroclorid) cation (II)
C3gH7pN Oj3 + (C2Hi3BrO4S)-O- <> C3gH79N"O}3.(C2;H)3BrO4S)-O-
Cation (II) anion (1) cap ion (IIT)
Xanh bromocresol la mot acid hitu co (pK, = 4,9) [31], trong môi trường nước có pH thích hợp phân ly tạo ra anion (1) Clarithromycin 1a mot
base hữu cơ (pK, = 8,99) [29], tạo ra cation (II) ở pH thích hợp, cation này
sẽ kết hợp với anion ở trên tạo thành cặp ion clarithromycin- bromocresol
(II) Chiết cặp ion bằng một dung môi hữu cơ thích hợp rồi đo mật độ
quang Song song tiến hanh voi clarithromycin chuan dé tinh kết quả
Trang 25PHAN 2: THUC NGHIEM VA KET QUÁ 2.1 NỘI DUNG, ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU
2.1.1 Nội dung nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu, khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng Clarithromycin bằng phương pháp tạo cặp ion — chiết đo quang
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu
2.1.2.1 Dụng cụ
- Cân phân tích AY 220 (Nhật) độ chính xác 0,1 mg
- Máy đo quang phô UV-VIS Lambda EZ 210 (Perkin Elmer- Đức)
- Binh gan dung tich 125 ml
- Binh dinh mirc 20m], 50ml, 100ml
- Pipet chính xác các loại, ống đong, cốc có mỏ, phêu loc
2.1.2.2 Hóa chất
- Clarithromycin nguyên liệu do công ty cô phân Dược VTYT Thanh
Hóa cung cấp
- Chất đối chiếu: Clarithromycin chuẩn làm việc (do công ty cô phần
Dược VTYT Thanh Hóa cung cấp), hàm lượng 97,25%
- Dung dịch đệm Britton — Robinson [30]: dung dịch đệm cho khoảng pH từ 2- 12 Gồm acid boric (H;BO;), acid phosphoric (HạPO¿) và acid
acetic (CH;COOH) cùng nông d6 0,04M với tỷ lệ 1:1:1 Điều chỉnh pH của
dung địch này bằng dung dịch NaOH 0,2M đến pH mong muốn - Dung môi CHC]; (PA)
- Xanh bromocresol (PA)
Trang 262.1.3 Phương pháp nghiên cứu
2.1.3.1 Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng clarithromycin
- Khảo sát phô hấp thụ ánh sáng của cặp ion clarithromycin- xanh bromocresol đê lựa chọn bước sóng phân tích
- Lựa chọn pH tạo cặp ion
Tại các pH khác nhau thì khả năng tạo cặp ion cũng khác nhau, vì vậy
cần chọn pH nao dé hap thụ của cặp ion là lớn nhất
- Xác định tỷ lệ cầu tử trong phức chất
2.1.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng và ứng dụng 2.1.3.3 Đánh giá phương pháp
- Đánh giá độ chính xác của phương pháp:
Khảo sát độ chính xác bằng cách tiến hành định lượng lặp lại nhiều
lần hoạt chất cần phân tích của mẫu rồi xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê
- Đánh giá độ đúng của phương pháp:
Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích
- Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp:
Xác định khoảng nồng độ Clarithromycin trong đó độ hấp thụ của cặp
ion clarithromycin- xanh bromocresol tăng tuyến tính với nồng độ Clarithromycin
2.1.3.4 Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê,
sử dụng phần mềm Microsoft Excel làm công cụ hỗ trợ Một số cơng thức tốn thơng kê được sử dụng:
Trang 27_ le - Giá trị trung bình: x=— Dox - D6 léch chuan: s= ` Ss - Độ lệch chuân tương đôi: RSD(%)= = x tọu x - Khoang tin cay: = Jn n 2.2 THUC NGHIEM VA KET QUA
2.2.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện định lượng
2.2.1.1 Lựa chọn bước sóng để định lượng
Cân chính xác một lượng Clarithromycin chuẩn (hàm lượng 97,25%) tương ứng với 0,045 g Clarithromycin, hoa tan vao 10 ml HCI 0,01M, cho vào bình định mức 20 ml, thêm nước vừa đủ đến vạch Lay 5 ml dung dich
này pha loãng với nước thành 50 ml (dd Clarithromycin nồng độ 3.10M) Dùng 2 bình gạn, lần lượt cho vào từng bình như sau:
Trang 28Chiết bằng CHC]; 3 lần (6"!, 6"! , 5" mỗi lần lắc 5 phút, để yên cho phân lớp hoàn toàn, gạn lấy lớp CHCl:, lọc qua giấy lọc khô vào bình định mức 20 ml, thêm CHC]; đến vạch, lắc đều
Đo và ghi phô hấp thụ của dung dịch sau khi chiết trong dải sóng từ
230- 760 nm, thu được phô ghi ở hình 2.4: Abs clarithromycin 0.5— /À 0.45 / \ 3 fy ay 033 3 \ / 023 | wy \ i1 0.1 | 3 | : 3 | ` 00-3 ¬——————— + / -,3' - “ ^~rrr7~+~ TTT†TTT†TTTTT†TTTT?TTTT T†TTTTTTTTTTTTTTT†TTTTTT1 300 400 500 600 700 am
Hình 2.4 Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch cặp ion Clarithromycin — |
bromocresol trong chloroform
Trang 29Khảo sát ảnh hưởng của xanh bromocresol dén d6 hap thu ctia cặp ion cần định lượng: Chiết riêng bromocresol bằng chloroform, đem quét phô thi thấy tai A = 326 thi xanh bromocresol khéng hap thụ, nhưng độ hấp thụ của cap ion lai rat thap (A = 0.094) Song ở À = 419 thi xanh bromocresol cé hap thụ nhưng không đáng ké (A = 0,044), con d6 hap thụ của cặp ion lai cao (A = 0,473) Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn đo quang ở bước sóng 419 nm 2.2.1.2 Khảo sát sự phụ thuộc mật độ quang theo thời gian sau khi chiết
Theo dõi biến thiên hấp thụ tại À = 419 nm theo thời gian sau khi
chiết Kết quả được trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3 Độ ôn định của độ hấp thụ theo thời gian Thời gian đo sau Độ hấp thụ (A) khi chiết (phút) 0 0,423 5 0,425 10 0,425 15 0,422 20 0,424 25 0,423 30 0,424
Nhận xét: kết quả thu được cho thấy độ hấp thụ của cặp ion là ôn định
sau khi chiết được 30 phút ở nhiệt độ phòng
2.2.1.3 Lựa chọn pH đo
* pH ở đó độ hấp thụ lớn nhất
Tiến hành như mục 2.2.1.1 song dùng dung dịch đệm có pH khác nhau và đo tại bước sóng 419 nm Kết quả thu được ở bảng 2.4
Trang 30Bảng 2.4 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm tới mật độ quang pH A 4 0,304 5 0,341 6 0,378 7 0,423 8 0,418
Vậy tại pH = 7 thì độ hấp thụ lớn nhất hay tạo được nhiều phức nhất * Ảnh hưởng của pH đến sự chiết xanh bromoeresol
Dùng 4 bình gạn, lần lượt cho vào từng bình như sau:
Bang 2.5 Pha các bình mẫu chiết để khảo sát ảnh hưởng của pH Thuốc thử pHó pH? Mẫu trăng | Mẫuthử | Mẫu trắng | Mẫu thử Dd đệm Britton- 5ml Sml 5ml 5ml Robinson Dd bromocresol 0 2,5ml 0 2 5ml Nước cất 2,5ml 0 2,5m] 0
Sau đó tiến hành tương tự như mục 2.2.1.1 Đo ở bước sóng 419 nm, kết quả thu được ở bảng 2.6
Trang 31Vậy tại pH 7,0 thì độ hấp thu trong CHCl; cua bromocresol thap hon
nhiều so với độ hấp thụ ở pH 6,0 (thấp hơn khoảng 4.5 lần), hay nói cách khác xanh bromocresol đi vào lớp CHC]: ở pH 7.0 thấp hơn nhiều so với ở
pH 6,0 Vì vậy, sự ảnh hưởng của bromocresol tới kết quả phân tích ở pH 7,0 cũng ít hơn tại pH 6,0 Mặt khác, qua quá trình thực nghiệm chúng tôi
nhận thấy ở pH 6,0 sự phân tách hai pha khó hơn, thời gian chiết lâu hơn ở
pH 7.0
Vậy tại pH 7,0 cặp ion có độ hấp thụ lớn nhất và sự ảnh hưởng của bromocresol cũng ít hơn nên chúng tôi chọn pH 7,0 làm pH đệm đê định
lượng
2.2.1.4 Khảo sát số lần chiết và lượng dung môi chiết bằng chloroform
Dùng dung dịch đệm Britton — Robinson pH 7,0, tiến hành tương tự
như mục 2.2.1.1, song chiết bằng chloroform với số lần chiết và thê tích dung môi khác nhau Kết quả ghi ở bảng 2.7 Bảng 2.7 Độ hấp thụ của dịch chiết với số lần chiết khác nhau Số lân chiết | 2(10"!, 7) 36" ah, nh 4(6".5",5", 3") Độ hap thu 0,353 0,423 0,422 (A)
Kết quả này cho thấy chiết 2 lần thì chưa chiết hết hoạt chất Chiết 3 lần
và 4 lần thì kết quả không khác nhau nhiều Vì vậy chúng tôi quyết định
chọn cách chiết 3 lần (6"!, 6"! „ 5" đề giảm thời gian chiết và lượng dung
môi chiết
Trang 322.2.1.5 Xác định tỷ lệ cấu tử trong phức chất
Dùng dung dịch đệm Britton - Robinson pH 7.0, tiến hành tương tự
như mục 2.2.1.1, song dùng dung dich clarithromycin 3.10°M và xanh
bromocresol 3.10°M với số lượng khác nhau Kết quả ghi ở bảng 2.8 Bảng 2.8 Xác định tỷ lệ cấu tử trong phức chất Số thứ tự Clarithromycin Bromocresol A 3.10°M (ml) 3.10M (ml) 2 0,5 0.146 2 2 1,0 0,267 3 2 1,5 0,388 4 2 2,0 0,421 5 2 2,5 0,423 6 2 3,0 | 0,421
Nhu vậy từ dòng 4 trở đi thì mật độ quang coi như không thay đổi,
nghĩa là tỷ lệ két hop clarithromycin — xanh bromocresol là 2:2 hay | clarithromycin : 1 xanh bromocresol
2.2.2 Xây dựng phương pháp và ứng dụng
2.2.2.1 Xây dựng phương pháp
* Tiến hành:
Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi xây dựng các bước tiến hành định lượng như sau:
Cân một lượng chế phẩm tương ứng với 0.0450 g clarithromycin va hoa tan trong 10 ml HCI 0,01M, lắc kỹ cho tan hoàn toàn và cho vào bình định
Trang 33
mức 20 ml Thêm nước đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch A Lay chinh xac 5 mÌl dung dịch A pha loãng với nước vừa đủ 50 ml (dd B)
Lấy 2 ml của dung dịch B cho vào bình gạn, thêm 10 ml dung địch đệm Britton — Robinson pH 7,0; 2,5 ml dung dich xanh bromocresol Lac déu,
chiết 3 lan (6 , 6™ , 5") bang chloroform bang cach lắc 5 phút, để yên cho phân lớp hoàn toàn rồi gan dịch chiết và lọc qua giấy lọc khô vào bình định
mức 20 ml, lắc đều, thêm chloroform vừa đủ đến vạch Đem đo mật độ quang tại bước sóng 419 nm, cuvet dày Ì cm
Song song tiến hành như trên, thay Clarithromycin chế phẩm bằng Clarithromycin chuân
Mẫu trắng tiền hành tương tự như mẫu thử nhưng thay 2 ml dung dịch
clarithromycin bang 2 ml nude cat * Cách tính kết quả: Theo phương pháp so sánh, hàm lượng % clarithromycin được tính theo công thức: A4 xm Trong đó:
C% : Hàm lượng % Clarithromycin có trong mẫu thử
C_ : Hàm lượng % Clarithromycin có trong mẫu chuẩn
A, : D6 hap thụ của dung dịch thử
A : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn
m, : Khối lượng tính bằng gam cua Clarithromycin trong bot nguyên liệu đã cân đê pha dung dịch thử
m, : Khối lượng tính bằng gam của Clarithromycin chuẩn đã
cân đề pha dung dịch chuẩn
Trang 342.2.2.2 Ứng dụng
Chúng tôi sử dụng phương pháp đã xây dựng ở trên để định lượng
mẫu nguyên liệu Clarithromycin do Công ty cổ phần Dược VTYT Thanh Hóa cung cấp và sử dụng chất đối chiếu hóa học Clarithromycin hàm lượng 97,25 % do công ty cô phân Dược VTYT Thanh Hóa cung cấp
Tiến hành định lượng 6 mẫu, kết quả ghi trong bang 2.9
Bảng 2.9 Kết quả định lượng Clarithromycin trong nguyên liệu STT Khôi lượng cân (g) Độ hấp thụ C%(%) | 0,0520 0,482 98,68 2 0,0461 0,424 97,92 3 0,0403 0,376 99,33 4 0,0498 0,465 100,26 5 0,0423 0,396 99,67 6 0.0502 0,467 99,04 Chuan 0,0439 0,401 97,25 Gia tri trung binh x 99,15 Độ lệch chuân S 0,81 Độ lệch chuân tương đôi RSD (%) 0,82 AX 0,85
Vậy theo phương pháp định lượng do chúng tôi xây dựng, hàm lượng Clarithromycin trong bột nguyên liệu do Công ty cô phần Dược VTYT
Thanh Hóa cung cấp là 99,15% + 0,85% 2.2.3 Đánh giá phương pháp
2.2.3.1 Xác định tính chính xác của phương pháp Theo kết quả ở bảng 2.9 ta có:
Trang 35- Giá trị tung bình: x =99,15%
- Độilệchchuân : S =0,81
- Khoang tin cay cua gia trị trung bình : X(%) = 99,15% + 0,85%
- P6 léch chuan tuong déi : RSD = 0,82% < 2%
Vậy phương pháp là chính xác
2.2.3.2 Xác định tính tuyến tính của phương pháp
Cân chính xác một lượng chế phẩm chuân tương đương với 0.2250 g
Clarithromycin, hoa tan trong 40 ml HC! 0,01M rồi cho vào bình định mức
100 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch A (dung dich này có nồng độ 2,25 mg/ml) Tiến hành pha dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau từ dung dich A theo bảng 2.10 Bảng 2.10 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Dd chuân | I 2 3 4 5 Sémidung | 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 dich A Thêm nước vừa đủ 50 ml, lặc đêu
Dùng 2 ml mỗi dung dịch trên, cho vào bình gạn, thêm 10 ml dung dịch
dém Britton — Robinson pH 7,0; 2,5 ml dung dich xanh bromocresol Dem
chiét bang chloroform 3 lan (6™ , 6" , 5", lắc 5 phút, để yên cho phân lớp
hoàn toàn, gạn lấy lớp chloroform, lọc qua giấy lọc khô vào bình định mức 20 ml, bỗ sung chloroform toi vach, đem đo độ hap thụ ở bước sóng 419 nm
Mau trang tién hanh song song, thay dung dich clarithromycin bang
nước cất
Kết quả được trinh bay 6 bang 2.11
Trang 36Bảng 2.11 Kết quả xác định tính tuyến tính của phương pháp Dung dịch l 2 3 4 5 Nong d6(ug/ml)| 18,00 | 20,25 | 22,50 | 24,75 | 27,00 Do hap thu 0,337 0,380 0,423 | 0,465 0,502 0.6 5 Tinh tuyén tinh = £ xử y = 0.0184x + 0.0064 a R* = 0.9991 = Oo Ø 04 0.3 0.2 0.1 0 TT t 1 0 10 20 30 Nồng độ (mcg/ml) Hình 2.5 Đà thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nông độ dung dich Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là: y = 0,0184x + 0.0064 Trong đó: y là độ hấp thụ, x là nồng độ (ug/m]) Hệ số tương quan: r= 0,9996,
Độ lệch chuẩn của y — intercept : S, = 0,0064 Khoảng tin cậy của y — intercept: A, = 0,0225
Trang 37— -0,0161 < y- intercept < 0,0289
Từ kết quả trên cho thấy, hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99 Tất cả các gía trị đo năm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả 2 phía của đường hồi quy Khoảng tin cậy của y — intercept chứa 0
Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nông độ từ 80% đến
120% nông độ làm việc
2.2.3.3 Đánh giá độ đúng của phương pháp
Cân 3 mẫu chất đối chiếu Clarithromycin (hàm lượng 97,25%) với
khối lượng từ 0,0360 g — 0,0540 ø (tại 3 nồng độ 80%, 100%, 120% so với
lượng cân dùng khi định lượng)
Tiến hành tương tự như mục 2.2.2.1 Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả
trung bình
Tính toán khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu chuẩn là
0,401 ứng với khối lượng cân là 0.0439 g
Kết quả thu được ở bảng 2.12
Bảng 2.12 Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp
STT Khối Lượng hoạt | Déhap | Lượng tìm | Phân trăm
lượng cân chất có thực | thụ trung | lại trung tìm lại
(g) a (g) binh (A) | binh b (g) | (b/a.100%)
l 0,0378 0,0368 0,337 0,0369 100,25%
2 0,0469 0,0456 0,422 0,0462 101,31%
3 0,0562 0,0547 0,502 0,0550 100,55%
Trang 380.08 3 | y* 1.0109x- 0.0002 = ‘ie | R?= 0.9993 § E 0.04 003 002 001 0- = š : \ Ko 9 0.01 0.02 0.03 0.04 005 006
Khối lượng ban đầu (g)
Hình 2.6 : Đồ thị biểu diễn mỗi trơng quan giữa lượng hoạt chất ban đầu
và lượng tìm lại
Từ kết quả của bảng 2.12 ta có:
- Phương trình hỏi quy về mỗi tương quan giữa lượng hoạt chat ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại được là : y = 1,0109x - 0,0002
~_ Hệ số tương quan : r= 0.9997
- Trung binh phan tram tim lai duge : 100,70% - Độ lệch chuẩn của y- intereept : S„ = 0,0012
Trang 39
Nhân xét:
- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y- intercept chứa 0 (gốc toa độ)
~ Không có sai số hệ thống tÿ lệ vì khoảng tin cậy của độ đốc chứa 1 + Gia tr trung bình của tỷ lệ thu được là 100,70 % nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% đến 102%
Như vậy phương pháp là đúng trong khoảng khảo sát,
1.3 BÀN LUẬN
Clarithromycin là một macrolid 14 cạnh thể hệ mới được bán tông hợp từ erythromycin với một nhóm thể methoxy ở vị trí C-6 của vỏng macrolid Nam 1991 Clarithromycin được tổng hợp vả đưa ra thị trường [2S], [29]
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, phương pháp định lượng clarithromycin đã và đang được nghiên cửu và ứng dụng Các Dược điển nước ngoái đã đề cập đến một số phương pháp định lượng clarithromycin như phương pháp vi sinh vật, phương pháp sắc ky lỏng hiệu
năng cao
Trên cơ sở khảo sắt bằng thực nghiệm vả phân tích kết quả thu được,
chúng tôi đã đưa ra được một quy trình định lượng clarithromycin trong
nguyên liệu bằng phương pháp tạo cặp ion - chiết đo quang
~ Trong quá trinh khảo sát xây dựng phương pháp, chúng tôi da chon pH
7 để tạo cập ion và kết quả, ở pH nảy độ hấp thy của sản phẩm cao nhất Điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết đo pKa cua Clarithromycin 1a §,99; pKa của xanh Bromocresol là 4,9, Như vậy ở pH7, nồng độ dang ion của mỗi chat gap khoáng 100 lằn nông độ dạng phản tứ, nghĩa là cá hai cùng ở dạng ion tôi đa (Nếu pH < 7, xanh bromoeresol chuyển dẳn sang dang
Trang 40phân tử, mặc dù Clarithromycin chuyên dần sang dạng ion và ngược lại nên số lượng cặp ion tạo thành sẽ nhỏ hơn ở pH 7)
- Cũng do cả 2 cùng tồn tại gần 100% ở dạng ion tại pH 7 nên chỉ cần
chiết 3 lần là chiết hết cặp ion
- Do ở pH này, dạng phân tử của xanh bromocresol chỉ còn dưới 1%% nên khi dư trong dung dịch, nếu nó chuyền sang lớp chloroform thì ở một tỷ
lệ rất tháp, độ hấp thụ không đáng kê Điều đó phù hợp với thực nghiệm đã
chứng minh
Phương pháp xây dựng đã được đánh giá và các kết quả cho thấy
phương pháp đáp ứng được những yêu câu về tính chính xác, tính đúng, tính
tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát, không yêu cầu máy móc phức tạp mà thường sẵn có ở các cơ sở kiêm nghiệm (bình gạn, máy đo quang phơ ),
hố chất thông dụng và có thê áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm
trong cả nước
Do thuốc thử xanh bromocresol chỉ tạo cặp ion với các ion đương nên
phương pháp này có thê áp dụng cho các dạng bào chế chứa các hợp chất khác mà không tạo cặp lon với xanh bromocresol