Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang

Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết đo quang

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG

ION CHIẾT-ĐO QUANG

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002-2007)

Người hướng dẫn : PGS.TS Thái Duy Thìn

TS Đoàn Cao Sơn Nơi thực hiện : Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế -

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Bộ môn Hoá Dược - ĐH Dược Hà Nội Thời gian thực hiện : 02/2007 đến 05/2007 .'

LÒI c ả m 0R

Đ ể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Thái Duy Thìn

TS Đoàn Cao Sơn

Những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, dành nhiều công sức giúp đỡ và truyền đạt kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Hóa

Dược và các anh chị ở Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chê - Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khóa luận.

Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại Học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo trong suốt năm năm tôi học tập tại đây.

Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, bạn bè - những người luôn giành cho tôi tình yêu thương, sự quan tâm, động viên giúp đỡ chân tình đ ể tôi hoàn thành tốt nhất khóa luận tốt nghiệp này.

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2007 Nguyễn Thị Thanh Hương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẨN 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ AZITHROMYCIN 3

1.1.1 Azithromycin 3

1.1.2 Các phương pháp định lượng Azithromycin 5

1.1.2.1 Phương pháp vi sinh v ậ t 5

1.1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector điện hóa 5

1.1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ƯV 6

1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHổ ƯV-VIS

1.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích quang phổ ƯV-VIS 7 1.2.1.1 Phổ hấp thụ và việc lựa chon bước sóng cho phân tích quang phổ UV-VIS 7

1.2.1.2 Định luật về sự hấp thụ ánh sáng 8

1.2.1.3 Điều kiện ứng dụng định luật Lambert-Beer 9

1.2.1.4 Chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng 9

1.2.2 Các phương pháp định lượng của phương pháp quang phổ UV-VIS 10

1.2.2.1 Đo phổ trực tiếp 10

1.2.2.2 Phương pháp so sánh 10

1.2.2.3 Phương pháp thêm 11

1.2.2.4 Phương pháp đường chuẩn 11

1.2.2.5 Phương pháp thêm đường chuẩn 12

1.2.2.6 Phương pháp chuẩn độ đo quang 13

1.2.2.7 Phương pháp định lượng hỗn hợp 14

1.2.2.8 Phương pháp tạo cặp ion chiết-đo quan 14

1.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ UV-VIS 17

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 19

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 19

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.1.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứ u 19

2.1.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 20

2.1.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 22

2.2.1 Thuốc thử, hóa chất, dụng cụ 22

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng Azithromycin 23

2.2.2.1 Lựa chọn điều kiện 23

2.2.2.2 Cách tiến hành 23

2.2.2.3 Khảo sát độ hấp thụ u v và lựa chọn bước sóng phân tíc h 24

2.2.2.4 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 25

2.2.2.5 Phân tích chế phẩm Azicine 27

2.2.2.6 Đánh giá độ lặp của phương pháp 28

2.2.2.7 Đánh giá độ đúng của phương pháp 29

2.2.3 So sánh phương pháp mới xây dựng với phương pháp HPLC 30

2.2.3.1 Phương pháp định lượng azithromycin bằng phương pháp HPLC 30 2.2.3.2 So sánh kết quả của hai phương pháp 30

2.2.3.3 Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp 32

2.2.4 Áp dụng phương pháp mói xây dựng để định lượng một sô chế phẩm thuốc viên chứa azithromycin đang lưu hành trên thị trường 32

2.3 BÀN LUẬN 34

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUÂT 3.1 KẾT LUẬN 36

3.2 ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN III : Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 3

HPLC : High Perfomance Liquid Chromatography - sắc ký lỏng

hiệu năng cao

ƯSP : United States Pharmacopoeia - Dược điển Mỹ

ĐẶT VÂN ĐỂ

Trong vài thập kỷ qua, cùng với sự phát triển của công nghệ, khoa học

kỹ thuật, rất nhiều loại dược phẩm đã được sản xuất và lưu hành trên thị trường Cùng với sự đa dạng của các loại thuốc chữa bệnh là yêu cầu đòi hỏi

sử dụng thuốc phải hợp lý - an toàn Kiểm nghiệm bán thành phẩm và thành phẩm thuốc trở thành một khâu quan trọng trong quy trình đảm bảo chất lượng thuốc và trong việc phục vụ, chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Bên cạnh đó, trong công cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của Y học hiện đại Kháng sinh azithromycin được phát hiện năm 1980 và đến nay azithromycin đã và đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường và có vị trí tin cậy trong điều trị Azithromycin hấp thu nhanh và phân bố rộng khắp cơ thể Đặc biệt thuốc đạt nồng độ trong tế bào cao hơn trong huyết tương (từ 10-100 lần), vì vậy dùng điều trị nhiễm vi khuẩn nội bào tốt Thuốc có tác dụng mạnh trên H influenzae, M catarhalis, Neisseria, vi khuẩn nội bào, vi khuẩn cơ hội

ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS.[2]

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, phương pháp định lượng

azithromycin đã và đang tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng Trên thị trường Việt Nam có rất nhiều chế phẩm chứa azithromycin nhưng chủ yếu định lượng bằng phương pháp vi sinh vật hoặc phương pháp HPLC Các phương pháp này yêu cầu cơ sở vật chất nghiêm ngặt, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, dung môi tốn kém Hơn thế nữa, Dược điển Việt Nam cũng chưa có chuyên luận nào về hoạt chất này Vì vậy, để làm phong phú thêm các phương pháp định lượng azithromycin trong thuốc viên - góp phần xây dựng tiêu chuẩn

azithromycin trong dược điển Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài: “Định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết -

đo quang” với những mục tiêu sau:

> Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp tạo cặp ion chiết - đo quang.

> So sánh độ lặp lại và độ đúng của kết quả định lượng azithromycin giữa phương pháp mới xây dựng với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

> Úng dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng một số chế phẩm thuốc viên chứa azithromycin đang lưu hành trên thị trường

Với mục tiêu như vậy, chúng tôi mong muốn giới thiệu một phương pháp định lượng mới đơn giản, dễ thực hiện, có thể áp dụng được cho những

cơ sở sản xuất, kiểm nghiệm không có đủ điều kiện cơ sở vật chất để định

lượng azithromycin bằng phương pháp vi sinh vật hay phương pháp HPLC

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ AZITHROMYCIN

1.1.1 AZITHROMYCIN.[3] [8] [ 10] [ 11 ] [ 12] [21 ] [22] [25]

> Nguồn gốc: Bán tổng hợp từ erythromycin A; mở rộng thành vòng 15 nguyên tử c, có 1 N

> Tên chung: azithromycin dihydrat

> Tên khoa học: Methyl-aza-l l-desoxo-10 homoerythromycin A

> Tên khoa học đầy đủ:

3-0-methyl-a-L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-2-ethyl-3,4,10-trihydroxy-

(2R,3S,4R,5R,8R,10R,llR,12S,13S,14R)-13-[(2,6-dideoxy-3-C-methyl-3,5,6,8,10,12,14-heptamethyl-11 - [[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)- Ị3-D- xylo-hexopyranosyl]oxy]-1 -oxa-6-azacyclopentadecan-15-on dihydrat

> Một số biệt dược: Zithromax, Opeazitro, Aziwok, Azolide, Zitromax, Azithral, Zitrocin, Azicine, Aziphar,

■ Tính base: do các osamin (đường amin) va mang lại, pKa = 8,74 [27]

■ Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ

■ Phản ứng màu: với các acid HC1, H2S04 đậm đặc cho màu

■ Hấp thụ UV: do có vòng lacton có nhiều dây nối A sẽ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại xa

> Tác dụng:

Azithromycin là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng thuộc nhóm azalid Thuốc có tác dụng diệt khuẩn mạnh, có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram dương như Streptococcus, Pneumococcus, Staphylococcus aureus

Có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram âm như: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, có tác dụng vừa phải trên E.coli, Salmonella enteritis, Salmonella typhi, Enterobacter

■ Trẻ em: ngày đầu tiên 10mg/kg thể trọng và tiếp theo 5mg/kg mỗi ngày, uống một lần mỗi ngày.

> Chống chỉ định: Không sử dụng cho người bệnh quá mẫn với azithromycin hoặc bất kỳ kháng sinh nào thuộc nhóm macrolid

> Micrococcus luteus ATCC 9341

1.1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vói detector điện hóa [26]

Định lượng theo chương trình sau:

PH 11,0 ±0,1 Lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 |im.

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở nồng độ 0,0033 mg/ml trong pha động Lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 ỊLim

I.I.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector u v

Định lượng azithromycin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với chương trình sau:

Pha động: Lọc và đuổi khí dung dịch gồm: Methanol-nước-amoni hydroxyd 13,5M (80:19,1:0,1) Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần.

Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được pha trong pha động ở nồng độ 6mg/ml Lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 I^m

Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng

Pha động: Đệm phosphat-acetonitril-methanol (35:45:20), điều chỉnh pH=8 bằng amoniac hay acid phosphoric.Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần

Dung dịch chuẩn và dung dich thử được pha ở nồng độ 2 mg/ml bằng pha động Lắc đều và lọc qua màng lọc 0,5 ỊLim.

1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ HÂP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ƯV-VIS.

1.2.1 Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHổ

UV-VIS [5][6][9][18]

1.2.1.1 Phổ hấp thụ và việc lựa chọn bước sóng cho phân tích quang

phổ UV-VIS

Các chất có tính chất hấp thụ bức xạ ánh sáng một cách có chọn lọc Miền bức xạ mà chất nghiên cứu hấp thụ mạnh nhất ứng với năng lượng của bước chuyển điện tử Để tìm năng lượng bước chuyển điện tử ta có thể nghiên

cứu sự phụ thuộc mật độ quang của dung dịch A theo bước sóng X Đồ thị

biểu diễn mối quan hệ A - A, trong hệ tọa độ vuông góc gọi là phổ hấp thụ Đồ thị này thường có dạng đường cong Gauss Cực đại Amax ứng với giá trị À,max là cực đại hấp thụ Khi tiến hành phân tích quang phổ UV-VIS, người ta thường

chọn đo mật độ quang A của dung dịch nghiên cứu tại Ằ.max vì việc đo A ở A,max

sẽ cho kết quả phân tích có độ nhạy và độ chính xác tốt nhất

I.2.I.2 Định luật về sự hấp thụ ánh sáng - định luật Lambert - Beer.

Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ Iq qua

dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1 Khi đi qua dungdịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) điqua dung dịch

Định luật được biểu hiện bằng biểu thức sau:

A = lg = s l c

I

Trong đó:

I/I0: độ truyền qua T của dung dịch

I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới

I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch

A = K c

Với K= 8.1 thay đổi theo cách biểu thị nồng độ:

> Khi c = 1 mol/1 và 1 = lcm thì K = s (hệ số hấp thụ mol)

> Khi c = 1% và 1 = lcm thì K = El%lcm (hệ số hấp thụ riêng)

Đây là điều kiện để có thể áp dụng định luật thụ ánh sáng vào phân tích, nghĩa là có thể dùng phương pháp đo mật độ quang A để xác định nồng độ c chất nghiên cứu trong dung dịch phân tích.

1.2.1.3 Điều kiện ứng dụng định luật Lambert - Beer

> Chùm tia sáng phải đơn sắc

> Dung dịch phải loãng

> Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang)

> Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của tia UV-VIS

1.2.1.4, Chọn điều kiện xây dựng qui trình định lượng

Để xây dựng qui trình định lượng, chúng ta cần khảo sát để chọn các điều kiện thích hợp:

Chọn pH và dung môi thích hợp

Thực hiện phản ứng màu: Sự hấp thụ các chất lạ, thuốc thử cùng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu phải chú ý tới điều kiện, các thành phần tham gia phản ứng và mẫu trắng

1.2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CỦA PHƯƠNG PHÁP QUANG

> Dùng đèn thủy ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác định)

> Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số

> Dùng kính lọc Holmium (có các giá trị ^ max xác định cho trong tài liệu)

để kiểm tra lại máy

> Dùng dung dịch K2Cr04, K2Cr207 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch có nồng độ chính xác Đo phổ tìm các giá trị Xmax và tìm Amax

I.2.2.3 Phương pháp thêm

Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai

số cho quá trình định lượng: xử lý mẫu (chiết xuất), sai lệch do thiết bị và hoá chất, thuốc thử người ta áp dụng phương pháp thêm

Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ c x Thêm một lượng chất tan a (đã biết) vào dung dịch để tạo nồng độ C0, đo độ hấp thụ A ’x của dung dịch tạo thành

I.2.2.4 Phương pháp đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy khoảng 5 đến 8 dung dịch chuẩn có nồng độ cách nhau

Ax, đo A của chúng ở bước sóng đã chọn, lập đồ thị của A theo c Đo Ax của dung dịch thử và xác định Cx dựa vào đường chuẩn (hình 1.1)

Hình 1.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ quang

theo phương pháp đường chuẩn

Trong trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert - Beer (đường chuẩn không thẳng) cần pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nồng độ gần nhau hơn (khác nhau không quá 10%)

Khi xây dựng đường chuẩn, người ta thường sử dụng đường chuẩn tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng trong định lượng nếu đường chuẩn cong (phi tuyến, không thẳng).

Vẽ một đường đi qua gần nhất với các điểm thực nghiệm hoặc lập đường chuẩn bằng cách dựa vào các điểm thực nghiệm, bằng phương pháp bình phương tối thiểu; tìm phương trình của đường hồi quy tuyến tính (thẳng) hay phi tuyến (cong) và tính hệ số tương quan

Trong định lượng, nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có hệ số tương quan r ^ 0.9995 là tốt

I.2.2.5 Phương pháp thêm đường chuẩn

Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng, đo mật

độ quang của các dung dịch đó Vẽ đường chuẩn (đồ thị của độ hấp thụ A theo lượng chất cho thêm vào) Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng

Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào với độ hấp

thụ quang theo phương pháp thêm đường chuẩn

I.2.2.6 Phương pháp chuẩn độ đo quang

> Nguyên tắc: Phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo quang

Điều quan trọng của phương pháp này là tìm được bước sóng thích hợp

để xác định điểm tương đương

> Ưu điểm: phương pháp này có ưu điểm nổi bật là vẫn định lượng được trong một số trường hợp mà các phương pháp khác không áp dụng được:

+ Dung dịch có màu không quá đậm

+ Dung dịch đục không quá đậm

+ Dung dịch không tìm được chỉ thị màu

+ Dung dịch không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo thế

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích thuốc thử và độ hấp thụ quang

theo phương pháp chuẩn độ đo quang

Chú ý: trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất khônghấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kể thì ta có thể pha loãng dungdịch rồi đo A như khi đo một chất.

1.2.2.8 Phương pháp tạo cặp ion - chiết đo quang (hay phương pháp acid màu) [4][9][13][14]

V Nguyên tắc của phương pháp chiết tạo cặp ỉon.

Các cation và anion hữu cơ có khả năng chiết được bằng dung môi hữu cơ sau khi được tạo thành cặp ion

Khi cho một ion tác dụng với một ion trái dấu có thể hình thành một cặp ion giống như phân tử trung hoà về điện và có thể chiết bằng một dung môi hữu cơ ít gây phân ly

A~+B+ <r*A~B+

V Điều kiện để có thể chiết cặp ion:[14]

■ ít nhất một trong hai ion tạo cặp phải có khối lượng lớn và kỵ nước

■ pH của pha nước:

Nếu acid HA có hằng số điện ly Ka, để ion hoá 1% tạo ra A thì:

pH > pKa - 2Base B có hằng số điện ly Kb, để ion hoá 1 % tạo ra BH+ thì:

pH < 16 - pKbKết hợp hai điều kiện đó thì để tạo ra cặp ion [BH+A ], pH pha nước phải nằm trong giới hạn:

Mỗi acid màu tạo cặp ion với base hữu cơ ở một pH nhất định

Ví dụ : Methyl da cam thường ở pH 4,4 - 4,6

Xanh bromothymol thường ở pH 6,6 - 6,8

pH của dung dịch ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo cặp ion Nếu pH của dung dịch làm cho một trong hai ion chuyển sang dạng phân tử thì không còn tạo cặp ion nữa, có hai trường hợp:

■ Nếu cả anion và cation là gốc của acid và base mạnh trong nước tức là các ion không có tính acid, base thì pH không ảnh hưởng

■ Nếu một trong hai ion hoặc cả hai ion tạo cặp có tính acid hay base trong nước thì pH có ảnh hưởng

> Dung môi: cần lựa chọn dung môi thích hợp để chiết triệt để cặp ion tạo

thành mà không cho chất acid màu sang Thông thường sử dụng các dung môi: dichloroethan, chloroform, dichloromethan

> Các tác nhân muối kết: Khi thêm một chất gây muối kết (chất điện ly)

vào dung dịch nước sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước, giảm hằng số điện môi của pha nước, làm cho sự kết hợp ion dễ dàng Vậy các chất gây muối kết làm tăng hiệu suất chiết cặp ion

Ngoài ra, nồng độ thuốc thử , số lần chiết, thời gian chiết, sự bền vững của màu cặp ion, cũng rất cần lưu ý

V ứng dụng của phương pháp chiết cặp ỉon trong phân tích: [4]

> Chiết và đo quang: cho ion cần định lượng tạo cặp với một ion đối có màu rồi chiết vào dung môi hữu cơ và đo quang

> Chiết và đo phổ hấp thụ tử ngoại: một số anion (alcaloid, phenothiazin)

có hấp thụ tử ngoại nên có thể chiết vào dung môi hữu cơ dưới dạng cặp ion và đem đo mật độ quang

> Chuẩn độ tạo cặp ion: có thể dùng phương pháp này để định lượng các anion là các chất diện hoạt dùng làm chất nhũ hóa trong dược phẩm và mỹ phẩm Nhưng phương pháp này được dùng phổ biến hơn nhiều trong các phòng kiểm nghiệm để định lượng các base hữu cơ quan trọng trong ngành dược (alcaloiđ, phenothiazin ) dưới dạng cation dựa trên phản ứng tạo cặp ion với laurylsunfat (LS) hoặc dioctylsunfosuccinat (DOSS)

VKỹ thuật chiết cặp ion - đo quang

Cho ion cần định lượng tạo cặp ion với một ion đối thu được sản phẩm (có màu hoặc không màu có đặc tính quang học) Sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp rồi đem so màu hoặc đo quang

xA"m + yB(H+)" = Ax"mBy(H+)n

V Nguyên tắc định lượng azithromycin trong thuốc viên bằng phương pháp chiết tạo cặp ion - đo quang.

Lục bromocresol là một acid hữu cơ (pKa=4,9)[28], trong môi trường nước phân ly tạo ra anion và proton H+ Azithromycin là một base hữu cơ (pKa=8,74)[27J, trong môi trường nước sẽ kết hợp với proton H+ ( được tạo ra bởi lục bromocresol) thành cation mới (É), cation này sẽ kết hợp với anion ở trên tạo thành một cặp ion azithromycin-lục bromocresol (m ) ở môi trường đệm pH 4,6; không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ, do vậy dùng chloroform

để chiết cặp ion này Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng cực đại tại 417nm

để xác định hàm lượng của azithromycin trong chế phẩm

1.2.3 UƯ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP QUANG PHổ ƯV-VIS [18]

V Ưu điểm :

■ Độ chính xác của phương pháp khá cao

■ Sai số của phương pháp nhỏ, thường vào khoảng 0,5-1 %

■ Độ nhạy của phương pháp giúp ta có thể phân tích được các dung dịch loãng cỡ 10 4ụg/l, rất thích hợp cho các phép phân tích vết (phân tích độc chất)

■ Thời gian phân tích nhanh chóng, chỉ cần 5-10 phút có thể cho biết ngay kết quả

C2 1H13Br O4S - OH C2 1

(Lục bromocresol)

C21H |3Br 0 4S - o + H+ (I) (Anion)

Cation(II)

(Anion)Cation (II)

C3gH73N2 0 12 C^H^Br O4S - o

Cặp ion (III)

■ Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy móc ngày càng hoàn thiện, gọn nhẹ, trình độ tự động hóa, tin học hóa cao.

■ Với một số trường hợp hỗn hợp 2 thành phần có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, có cực đại hấp thụ khác nhau và thành phần này không hấp thụ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại của thành phần kia, ta có thể dùng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS để định lượng đồng thời hai thành phần mà không cần chiết tách

V Nhược điểm’.

■ Với hỗn hợp nhiều thành phần không thể định lượng đồng thời, cần quá trình chiết tách phức tạp mới đo quang từng thành phần riêng rẽ, quá trình tốn kém dung môi, hóa chất, dễ xảy ra sai số, dung môi ít nhiều độc hại và yêu cầu người tiến hành có tay nghề

ổn định

■ Trong một số trường hợp, có thể có ảnh hưởng của tá dược đến kết quả phân tích

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NỘI DƯNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 NỘI DUNG NGHIÊN c ú u

Tiến hành nghiên cứu, khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng Azithromycin trong chế phẩm thuốc bằng phương pháp chiết tạo cặp ion - đo quang trên máy quang phổ thông thường và đánh giá thẩm định phương pháp

So sánh kết quả của phương pháp vừa xây dựng với phương pháp định lượng bằng H PLC

2.1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ú u

> Viên nang Azicine 250 mg của STADA-VN, SDK: VNB-0930-01

> Viên nang Azithromycin 250 mg của Traphaco - Việt Nam

SDK: VNB-2357-04

> Viên nang Aziphar 250 mg của Mekophar, SDK: VNB-4140-05

> Viên nang Azithromycin 250 mg của XL Laboratories Pvt.Ltd

SDK: VN-6204-02

> Viên nang Azithromycin 250 mg của Bipharco, SDK: V700-H12-05 Công thức chung:

Azithromycin dihydrat tương đương azithromycin : 250mg

2.1.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u

2.I.3.I Chỉ tiêu nghiên cứu.

> Khảo sát phổ hấp thụ u v và lựa chọn bước sóng phân tích

> Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng

> Phân tích mẫu thử

> Đánh giá độ đúng và độ lặp của phương pháp

'> So sánh phương pháp mới xây dựng với phương pháp HPLC.

2.I.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu.

> Khảo sát phổ hấp thụ ánh sáng và lựa chọn bước sóng phân tích.

Mỗi hoạt chất có bước sóng hấp thụ cực đại khác nhau, do vậy cần phải khảo sát phổ hấp thụ ánh sáng để xác định bước sóng hấp thụ cực đại và theo dõi biến thiên độ hấp thụ tại bước sóng cực đại theo thời gian Các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử dùng để thiết lập điều kiện xây dựng quy trình định lượng

sẽ được đo độ hấp thụ quang tại bước sóng này để giảm thiểu sai số

Pha dung dịch mẫu chuẩn, tạo cặp ion, chiết rồi quét phổ hấp thụ của dung dịch chất màu trên giải sóng 350-550nm, xác định bước sóng cực đại và theo dõi độ ổn định trong thời gian 30 phút

> Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng.

Nồng độ mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ quang tại bước sóng xác định trong một khoảng nồng độ nhất định, nghĩa

là trong khoảng nồng độ đó thì độ hấp thụ A phụ thuộc vào nồng độ c theo một hàm bậc nhất:

A — 3 C + bCần phải xác định khoảng tuyến tính này bằng thực nghiệm làm cơ sở pha các dung dịch phân tích có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đó

Tiến hành pha dung dịch chuẩn gốc, sau đó pha loãng dung dịch đó để thu được một dãy dung dịch chuẩn biết trước nồng độ, tạo cặp ion, chiết Đo

độ hấp thụ của các dung dịch tại bước sóng phân tích Lập phương trình hồi quy, đánh giá độ tuyến tính thông qua hệ số tương quan r

^ Phân tích mẫu.

Pha các dung dịch thử và dung dịch chuẩn, với nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, tiến hành phân tích các dung dịch đó tại bước sóng phân tích Xử lý kết quả bằng phương pháp toán học

r Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phương pháp.

Khảo sát độ lặp lại bằng cách tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần hoạt chất cần phân tích của mẫu rồi xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê

Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn đã biết trước hàm lượng sao cho dung dịch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và xác định phần trăm thu hồi

'> So sánh giá trị trung bình và độ lặp của phương pháp vừa xây dựng với phương pháp HPLC.

So sánh độ lặp lại (test F) và so sánh giá trị trung bình (test T) đối với kết quả định lượng azithromycin theo hai phương pháp trên

Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp

2.1.3.3 Phương pháp xử lý sô liệu.

Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Microsoft Excel làm công cụ hỗ trợ

Một số công thức thống kê được sử dụng:

2.2.1.THUỐC THỬ, HÓA CHAT, DỤNG c ụ

> Thuốc thử: dung dịch bromocresol CT2 (theo DĐVN III, PL 71

-“Thuốc thử’): Nghiền kỹ 0,2 g lục bromocresol với 2,8 ml dung dịch natrihydroxyd 0,1N (TT), sau đó chuyển vào bình định mức 200ml bằng nước Thêm nước vừa đủ đến vạch, lọc nếu cần

> Chất đối chiếu: azithromycin chuẩn Quốc gia (do Viện kiểm nghiệmthuốc Trung ương-Bộ Y tế cung cấp): hàm lượng 967 ụg/mg, hàm ẩm 4,87%

> Thiết bị: Máy quang phổ UV-VIS AGILENT 8453, cân phân tích, máy siêu âm, máy HPLC Merk-Hitachi D7000

> Dụng cụ: bình gạn dung tích 125ml, bình định mức 20ml, 50ml, 100ml; pipet lml, 2ml, 5ml, 10ml

> Hóa chất: chloroform, ethanol 96%, natrisulfat khan, natri acetat, lục

bromocresol đạt tinh khiết phân tích.

2.2.2 XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN

2.2.2.I Lựa chọn điều kiện

> Lựa chọn acid màu thích hợp: dung dịch bromocresol CT2

> Môi trường tạo cặp ion: dung dịch đệm acetat pH 4,6 (hòa tan 5,4g natriacetat (TT) trong 50ml nước; thêm 2,4g acid acetic băng (TT) và thêm nướcvừa đủ 100ml Điều chỉnh pH nếu cần - DĐVN III, PL 30)

> Dung môi chiết: chloroform

> Khoảng nồng độ chất màu: tương ứng với azithromycin trong khoảng từ 5-20ụg/ml

Bảng 2.1 Pha các bình mẫu chiết.

Thuốc thử Bình mẫu trắng Bình mẫu chuẩn Bình mẫu thử

(15ml; 10ml) với chloroform, gạn dịch chiết vào bình định mức, thêm chloroform vừa đủ, lắc đều, lọc qua phễu lọc có 1 gam natrisulfat khan Đo độ hấp thụ tại bước sóng phân tích trong cốc đo dày lcm.

2.22.3 Khảo sát độ hấp thụ u v và lựa chọn bước sóng phân tích

Tiến hành chiết như trên với dung dịch chuẩn, đo và ghi phổ hấp thụ của dung dịch sau khi chiết trong giải sóng 350-550nm, thu được phổ đồ ở hình2.4, dung dịch có cực đại hấp thụ tại 417nm

Theo dõi biến thiên độ hấp thụ tại bước sóng 417nm theo thời gian Kết

quả được trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2 Độ ổn định của độ hấp thụ theo thời gian

Thời gian đo kể từ

sau khi chiết

Độ hấp thụ % tính theo lần đo

đầu tiên

Biến thiên độ hấp thụ (%)