Xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4 Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy

LÊ VIỆT NGÂN

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG

PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

LÊ VIỆT NGÂN

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG

1 Bộ môn hóa phân tích – độc chất

2 Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia

HÀ NỘI – 2015

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Đình Chi

đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

và viết khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp em hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn TS Lê Thị Hồng Hảo, ThS Vũ Thị Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Em gửi lời cảm ơn tới các anh chị, những người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn bên em, chia

sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên

Hà Nội, Ngày 11 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Việt Ngân

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 3

1.1.Giới thiệu 3

1.2.Cấu trúc hóa học của Anthocyanin 3

1.3 Tính chất của Anthocyanin 4

1.4 Tác dụng của Anthocyanin 6

1.5 Sự phân bố của Anthocyanin 8

1.6 Một số phương pháp phân tích Anthocyanin 9

1.7 Tổng quan về HPLC 10

1.7.1 Khái niệm chung 10

1.7.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 10

1.7.3 Thiết bị sắc ký lỏng 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu - thiết bị 17

2.2.1 Nguyên vật liệu 17

2.2.2 Thiết bị 18

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.3.Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC 19

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20

2.3.3 Thẩm định quy trình 21

pháp HPLC 22

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện 22

3.1.2 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 23

3.2.Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28

3.2.1 Khảo sát thời gian thủy phân 28

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 30

3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 31

3.3 Thẩm định phương pháp 33

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 33

3.3.2 Khoảng tuyến tính 34

3.3.3 Độ lặp lại 37

3.3.4 Độ thu hồi 40

3.3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.4.Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực phẩm rau củ 44

3.5 Bàn luận 44

3.5.1 Lựa chọn phương pháp 44

3.5.2 Điều kiện xử lý mẫu 45

3.5.3 Xây dựng phương pháp định lượng 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1.Kết luận 47

4.2.Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AOAC Association of Official Analytical

Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

chromatography

sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4 Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực

Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau 30 Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau 32 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn cyanidin 36 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn

Bảng 3.16: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu rau 41

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin 4

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình

Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 3 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4 27 Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau

Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2N trong dung môi

Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm

cyanidin

Hình 3.16: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay với mức sống càng nâng cao, người dân ngày càng quan tâm hơn đến sức khỏe của bản thân Trong nhiều năm gần đây, xã hội và giới khoa học quan tâm nhiều đến tác hại của gốc tự do, chất chống oxy hoá và stress oxy hóa [5]

“Stress oxy hóa” là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxi hóa [10] Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó

có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm [17]

Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh [19], [18], [26]

Trên thế giới đã có rất nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng Anthocyanin hay hoạt chất nhóm Anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LC-MS [21], [15], [27] Tại Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm hay thực phẩm chức năng [3], [4], [6] Tuy nhiên thì việc xác định từng hoạt chất trong nhóm Anthocyanin trong thực phẩm rau củ thì rất ít Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:

“Xác định một số hợp chất nhóm Anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC”

Với các mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC

2 Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng để phân tích một số mẫu rau củ trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 1.1 Giới thiệu

Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật [24] Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa

Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh thẫm [24] Tuy nhiên, không

chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rưc rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [25]

1.2 Cấu trúc hóa học của Anthocyanin

Anthocyanin là những glycosid do gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin) Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylat bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1 Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít [3] Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycosid Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng Đến nay có những báo cáo của hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy nhiên trong đó chỉ có sáu chất phổ biến nhất Pelargonidin, Peonidin, Cyanidin, Malvidin, Petunidin và Delphinidin [25] Trong bài báo cáo này chúng tôi tiến hành xác định Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin trong thực phẩm rau củ

B

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin

Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R 3 ′ R 4 ′ R 5 ′ R 3 R 5 R 6 R 7

Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1

và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 [3]

1.3 Tính chất của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực [3]

Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH, …, trong đó khả năng tan trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [7] Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm [3]

Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [25]

Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [3]:

- Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ

- Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ

- Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base Chalcon không màu

- Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh

Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH

Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [3]

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [3]

Như vậy, trong môi trường acid, các anthocyanin là những base mạnh và có thể tạo muối bền vững với acid Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với base Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh [3]

1.4 Tác dụng của anthocyanin

Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán do hình thành nên màu sắc sặc sỡ trên cành hoa và quả Mặt khác, anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV cho phép bảo vệ bộ gen của thực vật trước nhóm tác nhân có thể gây đột biến gen này Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phospho, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm…[14], [32]

Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ) [13], các anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác dụng tốt

trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu, hạn chế nguy

cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng Các nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường Khả năng chữa bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [13], [31]

Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm [31] Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA [31] Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được

sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [31]

Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được sử dụng trong thực phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao, chống lão hóa, tăng cường sức đề kháng, làm bền thành mạch, chống

viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng

xạ [14], [16]

1.5 Sự phân bố của Anthocyanin

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ Trong những loại thực vật này, anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài

và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm [11] Các họ thực vật như

họ nho (Vitaceae) và họ hoa hồng (Rosaceae) là các nguồn anthocyanin chủ yếu Bên cạnh đó còn có một số loài thuộc các họ khác: Cà tím (Solanaceae), quả lý (Saxifragaceae), quả việt quất (Ericaceae) và bắp cải tím (Brassicaceae)… Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycosid của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin Số lượng các

3 – glycosid nhiều gấp 2,5 lần các 3,5 – glycosid Loại anthocyanin hay gặp nhất chính là Cyanidin – 3 – glycosid [29]

Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại

Việt Nam [8]

Hàm lượng anthocyanin toàn phần (%)

6 Củ của loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46

1.6 Một số phương pháp phân tích Anthocyanin

Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin

Điều kiện phân tích Điều kiện xử lý

mẫu

Tài liệu tham khảo

- Tốc độ dòng: 1.0 mL/min

- Nhiệt độ cột: 40 0 C

- Detector PDA tại 530 nm

Thủy phân bằng HCl ở nhiệt độ

90 0 C trong 2 giờ, lọc sau đó chạy sắc ký

[28]

Mẫu tía

tô đông khô

- Cột Satisfaction RP C 18 (250

× 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: A (H 2 O – CH 3 OH (9:1))

sơ ri và acai

- Cột: Shim – pack CLCODS

Chiết bằng

CH 3 OH có 0,5 % HCl để qua đêm

ở 5 0 C, lọc, làm giàu, lọc trước khi chạy sắc ký

[27]

- Cột: YMC – pack ODS –

AM C 18 (250 × 4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: CH 3 CN – H 2 O – HCOOH, gradient dung môi

YMC Pha động: A: H 2 O – HCOOH (90:10) B: CH 3 CN – CH 3 OH – H 2 O – HCOOH (22,5:22,5:40:10)

sắc ký

[33]

1.7 Tổng quan về HPLC

1.7.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp

lý [1]

1.7.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [1], [2]

Thời gian lưu:

Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian lưu tR

Thời gian chết: Thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động)

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR – tM

CS, CM: Nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

Hệ số dung lượng k’:

M S M

M

S S

V

V K V C

V C

.

.

M

M R t

t

t 

VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số VS/VM

B

t t

t t k

k K

KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước)

k’A, k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B

(t R ) A , (t R ) B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B

Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1 Trong phân tích sắc

ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 – 2 Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài

Số đĩa lý thuyết:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2

2 / 1

2

54,5

t H

L

L: Chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết;

H: Chiều cao của đĩa lý thuyết;

W: Chiều rộng của pic sắc ký;

W1/2: Chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic

Độ phân giải của cột:

Độ phân giải (RS) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

A R B R

B A

A R B

R

W W

t t

W W

t t

, 2 / 1 , 2 / 1

18 , 1

Ở đây: WA, WB tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B;

W1/2,A, W1/2,B tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với

một nửa chiều cao của pic

1.7.3 Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]

Hình 1.3 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

a Hệ thống cung cấp pha động:

- Nguốn cấp pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi

hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ

- Bộ phận loại khí (degasser): Trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45

µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ…

- Bộ phận trộn pha động (mixer): Trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc

áp suất cao

 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: Mỗi bình chứa dung môi có một van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu

 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao

- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm

làm đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo

Hệ thống cấp

Cột sắc ký Detector

Hệ thống thu

nhận và xửa lý

số liệu (máy ghi,

b Bộ phận tiêm mẫu

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau, thường dùng loại 0,50 – 20 µL Có vòng chứa mẫu lớn hơn

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm này có

độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm

- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa, cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào cột hằng định nên độ lặp lại cao

c Cột sắc ký

- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 – 10 µm Ưu điểm của cột nhồi có hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn

- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc

ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước hạt lớn hơn

- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:

- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:

- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như

C2H2(OC2H4OH)2, H2O Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan

- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C18 hoặc

C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như H2O, CH3CN

d Detector

Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và sử dụng các nguyên lý khác nhay tùy thuộc tính chất đối tượng cần nghiên cứu:

- Detector hấp thụ UV-Vis

- Detector huỳnh quang

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước [1], [2]

e Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Anthocyanin trong thực phẩm rau củ

Đối tượng mẫu phân tích là anthocyanin và đối tượng nghiên cứu là các thực phẩm rau củ như: bắp cải tím, khoai lang tím, rau dền đỏ, củ dền, tía tô… Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Hà Nội

2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị

Dung dịch chất chuẩn gốc Delphinidin 100 ppm : Hòa tan 1 mg chất chuẩn

Delphinidin trong lọ trên với khoảng 5 mL CH3OH chuyển toàn bộ vào bình định mức 10 mL rồi thêm CH3OH tới vạch định mức ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

Dung dịch chuẩn gốc Pelargonidin 100 ppm : Hòa tan 5 mg chất chuẩn trong

lọ trên với khoảng 20 mL CH3OH rồi chuyển vào bình định mức 50 mL, rồi

thêm CH3OH tới vạch định mức ở nhiệt độ phòng, lắc kĩ ta được dung dịch chuẩn nồng độ 100 ppm Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

Dung dịch chuẩn Cyanidin khoảng 190 ppm: Cân chính xác khoảng 0,2000 g

bột đông khô bilberry vào bình định mức 50 mL hòa tan trong 30 mL dung dịch CH3OH – HCl 2 N (80:20) ở nhiệt độ phòng, đem thủy phân ở 800C trong 2,5 giờ Định mức với dung môi trên tới chính xác 50 mL, lắc kỹ Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

- Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 1,0 mL từng dung dịch chuẩn gốc

ở trên vào bình định mức 10 mL, thêm CH3OH vừa đủ

- Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany)

- Máy ly tâm HermLe Z383K

- Máy lắc xoáy IKA

- Máy xay Philips 600W

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5 mL, 10 mL, 20 mL, 50 mL, cốc

có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5000 µL

- Ống ly tâm 50 mL, 25 mL, 100 mL, bình cầu có nút mài, lọ thủy tinh có nắp kín

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC, để phân tích Delphinidin, Cyanidin, Pelargonidin

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Delphinidin, Cyanidin, Pelargonidin trong thực phẩm rau củ

- Đánh giá (thẩm định) quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Dựa vào các bài báo tham khảo [4], [30], [23] chúng tôi cố định một số thông

số chạy sắc ký sau:

- Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

- Detector: Bước sóng lấy sắc ký đồ: 520 nm

Dải bước sóng quét phổ UV – Vis: 190 – 800 nm

- Nhiệt độ cột: 400C

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC

Thành phần pha động ảnh hướng rất nhiều tới quá trình tách sắc ký Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau Dựa vào các bài báo tham khảo [4], [30], [23] chúng tôi chọn pha động chạy với chế độ gradient với pha động A và

B như sau:

- Pha tĩnh: cột Xbridge® BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ứng

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:

Bảng 2.1: Danh mục các pha động HPLC khảo sát

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [4], [30], [23] nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, bằng hỗn hợp dung môi: CH3OH – HCl 2 N với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25

Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm rau củ dự kiến gồm các bước sau:

- Đồng nhất mẫu: Nghiền, xay mẫu

- Cân chính xác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 35 mL dung môi chiết hỗn hợp CH3OH – HCl 2 N vào ống ly tâm

- Lắc siêu âm 15 – 30 phút ở nhiệt độ phòng

- Thủy phân ở nhiệt độ 800C trong 150 phút

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Gạn lấy phần dịch trong, định mức 50 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số Anthocyanin bằng phương pháp HPLC

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện

Để lựa chọn bước sóng thích hợp ghi sắc ký dồ khi phân tích đồng thời delphinidin, cyanidin, pelargonidin, chúng tôi chọn detector PDA để phát hiện Quét phổ trong khoảng 190 – 800 nm, chọn cực đại hấp thụ cho mỗi chất và thu được kết quả như sau:

Pelargonidin có cực đại hấp thụ tại 513 nm và 2 đỉnh phụ tại 269 nm, 423 nm

Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo được độ nhạy của phương pháp khi phân tích đồng thời cả 3 anthocyanin trên chúng tôi quyết định chọn bước sóng phát hiện tại 520 nm

3.1.2 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

Để xây dựng quy trình phân tích Anthocyanin bằng HPLC, chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây cố định trong toàn bộ nghiên cứu:

- Cột Pha tĩnh: Cột Xbridge® BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ứng

- Để có được quy trình phân tích cho đáp ứng pic tốt với 3 chất chuẩn gốc và

có khả năng tách delphinidin, cyanidin, pelargonidin khỏi các thành phần khác trong rau củ, thành phần pha động được nghiên cứu khảo sát thông qua kết quả phân tích thu được khi tiêm dung dịch đánh giá độ phân giải vào hệ thống HPLC ở mỗi điều kiện pha động Những kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng không tách được pic 3 chất chuẩn khỏi các thành phần khác Vì vậy, việc sử dụng chế độ gradient dung môi là bắt buộc để có được độ phân giải như mong muốn, đồng thời cho thời gian phân tích vừa phải (khoảng 20 – 30 phút) Có tất cả 4 hệ dung môi được khảo sát:

- Chương trình gradient 1 – hệ pha động 1: Dung dịch HCOOH 0,05 % –

CH3CN với chương trình gradient như ở bảng 3.1 Kết quả là đỉnh pic delphinidin bị tù và chân pic bị dãn (Hình 3.4)

Bảng 3.1: Chương trình gradient 1

Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 1

- Chương trình gradient 2 – hệ pha động 1: Dung dịch HCOOH 0,05 % –

CH3CN với chương trình gradient như ở bảng 3.2 Kết quả là pic tách tốt và chân pic ít bị kéo đuôi Tuy nhiên khi chạy mẫu rau sắc ký đồ tách không tốt (Hình 3.5)

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình

gradient 2 (trên) và mẫu thực rau (dưới)

- Chương trình gradient 3 – hệ pha động 2: Dung dịch CF3COOH 0,05 % –

CH3CN với chương trình gradient như ở bảng 3.3 Kết quả là 2 pic cuối

- Chương trình gradient 4 – hệ pha động 2: Dung dịch CF3COOH 0,05 % –

CH3CN với chương trình gradient như ở bảng 3.4 Kết quả sắc ký đồ cho thấy pic tách tốt, pic gọn và tương đối cân xứng (Hình 3.7)

Bảng 3.4: Chương trình gradient 4

Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4

Như vậy, trong các hệ pha động được khảo sát có hệ pha động 2: Dung dịch

CF3COOH 0,05 % – CH3CN với chương trình gradient như ở bảng 3.4 cho thấy pic tách tốt, pic sắc ký gọn và cân xứng nhất Từ kết quả tối ưu hóa pha động, chúng tôi đi tới quy trình phân tích Anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC với điều kiện cụ thể như sau:

- Cột sắc ký: Cột XBridge® BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ứng

- Pha động: Dung dịch CF3COOH 0,05 % – CH3CN, chương trình gradient như bảng 3.4

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 800 nm

- Bước sóng phát hiện: 520 nm

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [4], [30] nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, bằng hỗn hợp dung môi sau đây: CH3OH - HCl 2 N với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25 [4]

Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm rau củ dự kiến gồm các bước sau:

- Đồng nhất mẫu: Nghiền, xay mẫu

- Cân chính xác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 35 mL dung môi chiết hỗn hợp CH3OH – HCl 2 N vào ống ly tâm

- Lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng

- Thủy phân ở nhiệt độ 800C trong 150 phút

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Gạn lấy phần dịch trong, định mức 50 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

3.2.1 Khảo sát thời gian thủy phân

Anthocyanin là chất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: oxi không khí, nhiệt độ, ánh sáng…do đó thời gian thủy phân trong quá trình xử lý mẫu là rất quan trọng đối với việc nghiên cứu này Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian thủy phân mẫu thực rau trong 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150

phút và tiến hành chạy máy trong điều kiện xử lý dự kiến ở trên, sử dụng chương trình gradient 2 – hệ pha động 1 (bảng 3.2)

Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90,

Thể tích định mức (mL)

Hệ

số pha loãng

Diện tích pic (mAU.s)

Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)

Hàm lượng Chất phân tích (mg/100 g)

120 10,9061 50 1 326313 2,69 1,23

Như vậy theo kết quả thu được thì thủy phân trong 120 phút cho hàm lượng các chất là lớn nhất Do đó chúng tôi sẽ chọn điều kiện thời gian thủy phân là

120 phút trong các khảo sát tiếp theo

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ thủy phân

Khảo sát nhiệt độ thủy phân theo quy trình dự kiến với thời gian thủy phân

120 phút tại các nhiệt độ: 500C, 600C, 700C, 800C; sử dụng chương trình gradient

2 – hệ pha động 1 (bảng 3.2)

Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau

Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau

Nhiệt

độ

(0C)

Lượng cân mẫu (g)

Thể tích định mức (mL)

Hệ

số pha loãng

Diện tích pic (mAU.s)

Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)

Hàm lượng Chất phân tích (mg/100 g)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2