Tách chiết, tinh chế ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (amphibia) và xác định một số tính chất của enzym

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC TOẢN TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC TOẢN TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 60720408 Người hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Văn Rư - Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội Người hướng dẫn 2: PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng - Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y Nơi thực hiện đề tài : Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện : Từ 02/2014 đến 08/2014 HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ và hỗ trợ cả về vật chất cũng như tinh thần của các thầy cô giáo, các quý đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Trước tiên, từ đáy lòng mình tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Rư - Trưởng bộ môn Hóa sinh - Trường đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng - Trưởng bộ môn Dược lý - Học viện Quân y, những người thầy luôn ở bên để hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình làm thí nghiệm và hoàn thành quyển luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ và bạn đồng nghiệp tại phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, song quyển luận văn này chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót về các thuật ngữ chuyên môn, nội dung, bố cục và hình thức trình bày. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ những nhà chuyên môn, các quý đồng nghiệp và bạn đọc xa gần. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình cũng như bạn bè đã hết sức ủng hộ, luôn bên cạnh động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014 Tác giả MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Khái quát chung về RNase 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu 3 1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất 4 1.1.3. Cấu trúc phân tử 4 1.1.4. Cơ chế xúc tác 6 1.2. Các chức năng sinh học của RNase 7 1.2.1. Chức năng tiêu hoá 7 1.2.2. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN 7 1.2.3. Tham gia vào quá trình hiệu chỉnh của ARN 8 1.3. Các chức năng sinh học mới của RNase 8 1.3.1. Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus 8 1.3.2. Hoạt tính cytotoxicity 9 1.3.3. Các chức năng sinh học khác 11 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đển hoạt tính RNase 13 1.4.1. Nhiệt độ 13 1.4.2. pH môi trường 13 1.4.3. Các chất kìm hãm (Inhibitor) 14 1.4.4. Các chất hoạt hoá 15 1.5. Các công trình nghiên cứu về RNase từ nội tạng động vật 15 1.6. Khả năng ứng dụng của RNase trong y học 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên liệu và hoá chất 20 2.1.1. Nguyên liệu 20 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 20 2.1.3. Hóa chất 21 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp chiết rút enzym 22 2.2.2. Phương pháp thử tính bền nhiệt của RNase 22 2.2.3. Phương pháp tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat 23 2.2.4. Định tính hoạt tính của RNase bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose 25 2.2.5. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 25 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính RNase 26 2.2.7. Xác định sơ bộ băng RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose 28 2.2.8. Phương pháp loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 30 2.2.9. Tinh chế RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 31 2.2.10. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên hoạt tính của RNase 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1. Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE và DCTC 35 3.1.1. Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE 35 3.2.2 Kết quả thủ tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTC 38 3.3. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat. 47 3.3.1. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được từ DCTE 47 3.3.2. Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase từ các phân đoạn protein thu được từ DCTC 51 3.4. Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel Agarose 54 3.4.1. Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn protein thu được từ DCTE 54 3.4.2. Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn protein thu được từ DCTC 55 3.5. Loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 57 3.6. Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 58 3.7. Kết quả nghiên cứu một số tính chất của RNase từ DCTE và DCTC 59 3.7.1. Xác định giá trị t 0 opt 59 3.7.2. Xác định giá trị pH opt 61 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63 4.1. Về việc lựa chọn môi trường để chiết rút RNase từ trứng cóc nhà và trứng ếch đồng 63 4.2. Về kết quả nghiên cứu tính bền nhiệt của các RNase chiết rút từ trứng cóc nhà và trứng ếch đồng 63 4.3. Về sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat 64 4.4. Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase từ các loại dịch chiết bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose 65 4.5. Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT A Hoạt tính enzym A 0 Hoạt tính riêng của enzym ADN Acid Deoxyribonucleic Amph Amphinase ARN Acid Ribonucleic BS - RNase Ribonuclease từ tinh dịch bò (Bovine seminal ribonuclease) CV Thể tích cột Hitrap SP XL 1ml DC Dịch chiết DCTC a Dịch chiết trứng cóc nhà trong môi trường H 2 SO 4 0,25N DCTC b Dịch chiết trứng cóc nhà trong môi trường đệm PBS DCTE a Dịch chiết trứng ếch đồng trong môi trường H 2 SO 4 0,25N DCTE b Dịch chiết trứng ếch đồng trong môi trường đệm PBS dH 2 O Nước khử ion đv E Đơn vị enzym Gly Glycin Mr Khối lượng phân tử OD Mật độ quang học ONC Onconase Phđ Phân đoạn pH opt pH tối ưu Pr Protein RNase Ribonuclease TC Trứng cóc nhà TE Trứng ếch đồng t opt Nhiệt độ tối ưu TTHĐ Trung tâm hoạt động DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33] 24 Bảng 3.1. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE a sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 35 Bảng 3.2. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 37 Bảng 3.4. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC a sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100 0 C trong các khoảng thời gian khác nhau 41 Bảng 3.5. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 43 Bảng 3.6. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100 0 C trong các khoảng thời gian khác nhau 45 Bảng 3.7. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein nhận được từ DCTE a 48 Bảng 3.8. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong các phân đoạn protein nhận được từ DCTE b 50 Bảng 3.9. Kết quả xác lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong các phân đoạn protein nhận được từ DCTC a 51 Bảng 3.10. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein nhận được từ DCTC b 53 Bảng 3.11. Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi ủ hỗn hợp phản ứng trong 1 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 59 Bảng 3.12. Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi cho hỗn hợp phản ứng 1 phút trong môi trường đệm Natri phosphat ở các giá trị pH khác nhau 61 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc không gian của RNase A 5 Hình 1.2. Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase (màu xanh là nhóm amino, màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng trung tâm hoạt động) . 6 Hình 2.1. Thứ tự các lỗ đục trên gel Agarose 25 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE a ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 36 Hình 3.3. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 37 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTE b ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 38 Hình 3.5. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC a sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 39 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC a ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. 40 Hình 3.7. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC a sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100 0 C trong các khoảng thời gian khác nhau 41 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC a sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100 0 C trong các khoảng thời gian khác nhau. 42 Hình 3.9. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các nhiệt độ khác nhau 43 Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các nhiệt độ khác nhau. 44 Hình 3.11. Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTC b sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 100 0 C trong các khoảng thời gian khác nhau 45 [...]... trò của nhiều loại RNase trong hệ thống phòng thủ và tự vệ của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn và virus Tuy nhiên RNase từ nội tạng của động vật còn ít được nghiên cứu Để góp phần tìm hiểu 1 thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nước ta chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Tách chiết, tinh chế Ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (Amphibia) và xác định một số tính chất của enzym ,... của enzym , cụ thể ở đây là trứng ếch đồng (Ranna rugulosa) và trứng cóc nhà (Duttaphrynus melanostictus) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với các mục tiêu sau: 1 Xác định được hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein từ dịch chiết trứng ếch đồng và trứng cóc nhà 2 Tách chiết, tinh chế và xác định được một số tính chất của RNase phân lập từ trứng ếch đồng và trứng cóc nhà 2 CHƯƠNG 1: TỔNG... RNase tinh khiết tách từ nọc rắn hổ mang Naja naja vùng Guntur Ấn Độ hoạt động tốt ở 37-600C với nhiệt độ tối ưu là 370C [38]; một số enzym rất bền với nhiệt nhưng hoạt tính không tăng tuyến tính với nhiệt độ như RNase nọc rắn hổ mang đen của Việt Nam: ở 25-490C hoạt tính enzym được tăng cư ng, từ 59-900C thì hoạt tính enzym giảm đáng kể và tới 1000C thì hoạt tính lại cao nhất [3, 4, 7, 8, 10] Một số enzym. .. Amph là một phân tử sinh học hoạt động rất mạnh mẽ Amph khi tiêm trực tiếp vào vùng có khối u không gây hại cho các tế bào lành xung quanh [28] - BS-RNase được tách chiết từ tinh dịch bò, chúng là một dạng đồng đẳng dimer của RNase A từ tụy bò, có độc tính với các tế bào của động vật có vú Trái ngược với BS-RNase dimer, dạng monomer của BS-RNase lại không có độc tính và bám chặt với chất ức chế của RNase... khả năng ức chế RNase 1.4.4 Các chất hoạt hoá RNase muốn hoạt động tốt thì sự có mặt của các chất hoạt hoá (activator) là rất cần thiết Các chất hoạt hoá giúp tăng cư ng hoạt tính thuỷ phân của RNase trong giới hạn nồng độ xác định và thường có bản chất hoá học khác nhau: - Các ion kim loại, ví dụ Mg2+ cần cho hoạt động của RNase P, Mg2+ hoặc Mn2+ cần cho hoạt động của RNase 1 - Các hợp chất hữu cơ... virus, điều hòa miễn dịch và có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư rất mạnh mẽ Tất cả các hoạt tính của ONC đều phụ thuộc vào trung tâm hoạt động của enzym ONC không bị bất hoạt bởi RI Hiện nay, ONC đang được thử nghiệm trên lâm sàng giai đoạn pha 3 với tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung trung biểu mô ác tính Mặc dù ONC là một protein từ động vật lưỡng cư nhưng có thể dùng làm... bước khởi đầu cho sự thể hiện độc tính của nó Hoạt tính này có thể bị ức chế bởi NaN3 và 2-deoxyglucose Hoạt tính gây độc tế bào của nó gấp 10 lần Monensin Hoạt tính RNase rất cần thiết cho sự thể hiện độc tính vì khi ONC được alkyl hoá hoạt tính ribonucleolytic của nó chỉ còn lại 2% so với hoạt tính này của enzym ban đầu và khả năng ức chế sự tổng hợp protein tế bào của ONC đã được alkyl hoá cũng bị... trường phản ứng [39] 1.5 Một số công trình nghiên cứu về RNase từ nội tạng động vật Trên thế giới, những năm vừa qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về RNase có nguồn gốc từ nội tạng động vật, đặc biệt là từ trứng của các loài ếch Đáng chú ý trong đó có công trình nghiên cứu của K.Saxena và cộng sự đã phân lập được một loại RNase mới từ trứng loài ếch báo phương bắc (Rana pipiens) và được đặt tên thương... bị ức chế bởi protein ức chế RNase có trong tế bào chất (RI), chất ức chế RNase từ nhau thai (PRI) [13, 32] ONC bám trên bề mặt các tế bào nhờ các thụ thể, chúng xâm nhập vào trong tế bào và thực hiện quá trình phân huỷ ARN của tế bào đó, nhờ đó ức chế quá trình tổng hợp protein và làm cho tế bào bị chết [32] - Amphinase (Amph) được phát hiện có trong trứng loài ếch Rana pipiens Ở động vật lưỡng cư, ... phân tử protein bị cắt ngắn, đa số 14 các gốc của phân tử RNase A tiếp xúc với RI được thay thế bởi các gốc không đồng dạng ở ONC, Amph Do vậy, các enzym này có cơ hội biểu hiện hoạt tính cytotoxicity Một số chất kìm hãm khác cũng có mặt trong tế bào như các polimer mang điện âm, một số chất ức chế lấy từ tế bào gan chuột, nhân tế bào sao biển, trứng của loài Chaetopterusp, từ lá cây tử đinh hương…các . hiện đề tài “ Tách chiết, tinh chế Ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (Amphibia) và xác định một số tính chất của enzym , cụ thể ở đây là trứng ếch đồng (Ranna rugulosa) và trứng cóc nhà. TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 60720408. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC TOẢN TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA