Nghiên cứu tách chiết và xác định một số đặc tính của dịch chiết từ tảo Spirulina

Bài viết nghiên cứu nhằm đưa ra một phương pháp tách chiết đơn giản để thu dịch chứa các thành phần hòa tan có hoạt tính sinh học cao từ tảo Spirulina; kiểm tra xác định một số đặc tính chức năng của dịch chiết từ đó làm cơ sở cho quá trình ứng dụng dịch chiết Spirulina trong sản xuất nước uống chức năng.

33(4): 60-65 Tạp chí Sinh học 12-2011 NGHIÊN CứU TáCH CHIếT Và XáC ĐịNH MộT Số ĐặC TíNH CủA DịCH CHIếT Từ TảO SPIRULINA HOàNG VĂN TUấN, PHạM HƯƠNG SƠN Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Viện ứng dụng công nghệ PHạM THU THủY Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội Tảo Spirulina (Arthrospira) thuéc chi Spirulina, hä Oscillatoriaceae, bé Oscillaloriales (Nostocales), líp Cyanophyceae (Cyanobacteria: vi khuẩn lam), ngành Cyanophyta (Cyanochloronta), có dạng hình xoắn lò xo với 5-7 vòng xoắn nhau, sợi không phân nhánh Spirulina có giá trị dinh dỡng rÊt cao nhê nguån cung cÊp protein dåi dµo vµ hàm lợng cân nhiều thành phần có hoạt tÝnh sinh häc cao nh− phycocyanin, chlorophyll, beta-caroten, axit gama-linolenic, axit alpha-linolenic Dịch chiết tảo Spirulina chứa nhiều thành phần chức hòa tan, đ đợc chứng minh có khả kìm h m phát triển tế bào MCF-7, dạng tế bào gây ung th vú ngời [6] Nghiên cứu tác giả Kumari nnk (2010) [5] đ cho thấy, dịch chiết Spirulina có khả ổn định hàm lợng đờng máu chuột bị tiểu đờng, số cholesterol HDL giảm đáng kể Hoạt tính chống oxy hóa kháng vi sinh vật dịch chiết Spirulina đ đợc nhiều nghiên cứu đề cập đến, đặc biệt có khả kháng đợc nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh nh Salmonella, Escherichia coli [7] Trong thành phần dịch chiết tảo Spirulina, chiếm số lợng nhiều phải kể đến phycocyanin, dạng chất màu chủ yếu có tảo Spirulina Phycocyanin đợc biết đến với khả bắt giữ gốc tự do, đặc tính quan trọng điều trị số bệnh nh viêm nhiễm, ung th, chống oxy hóa Vì vậy, phycocyanin đ trở thành đối tợng nghiên cứu ứng dụng phổ biến lĩnh vực nh y học, dợc phẩm sản xuất thực phẩm [10] 60 Mục đích nghiên cứu nhằm đa phơng pháp tách chiết đơn giản để thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan có hoạt tính sinh học cao từ tảo Spirulina, kiểm tra xác định số đặc tính chức dịch chiết từ làm sở cho trình ứng dụng dịch chiết Spirulina sản xuất nớc uống chức I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Nguyên liệu Bột tảo Spirulina platensis Trung tâm Sinh häc Thùc nghiƯm, ViƯn øng dơng C«ng nghƯ cung cấp Các hóa chất tinh khiết sử dụng cho nghiên cøu cã nguån gèc tõ Anh, Mü, §øc, Trung Quèc Phơng pháp a Phơng pháp tách chiết Sinh khối tảo Spirulina đợc phá vỡ tế bào dung môi khác gồm: Nớc, ethanol, methanol, hexane Quá trình phá vỡ tế bào đợc thực qua phơng pháp: Ngâm, lạnh đông nhả lạnh đông Phơng pháp ngâm đợc thực thời gian từ - 18 nhiệt độ phòng Phơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông đợc tiến hành -20oC thời gian lạnh đông (giờ) 1, 2, 3, chu kỳ nhả lạnh đông (lần) 1, 2, 3, 4, Hỗn hợp sau phá vỡ tế bào đợc ly tâm, lọc hút chân không thu dịch chiết chứa thành phần chức hòa tan tảo Spirulina b Phơng pháp xác định hiệu tách chiết Hiệu tách chiết đợc đánh giá dựa khả chống oxy hóa (%SC) qua phản ứng bao vây gốc tự (DPPH) hàm lợng phycocyanin (PC) có dịch chiết PC đợc tính theo công thức sau [9]: [A620 - 0,474(A652)] 5,34 Trong đó: PC hàm lợng phycocyanin có dịch chiết (mg/ml); A620 ®é hÊp thơ mµu cđa mÉu ë b−íc sãng 620 nm; A625 độ hấp thụ màu mẫu bớc sóng 625 nm c Phơng pháp xác định hoạt tính PC = Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đợc thực phiến vi lợng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phơng pháp Vander Bergher Vlietlinck (1991) [12] Các chủng vi sinh vật kiểm ®Þnh sư dơng gåm: Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC 12222), Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Xác định hoạt tính chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa mẫu đợc xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự (DPPH) Phản ứng đợc tiến hành theo phơng pháp Shela cộng (2003) [11] Dựa nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả tạo gốc tự bền dung dịch EtOH b o hoà Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hoà bao vây gốc tự làm giảm cờng độ hÊp thơ ¸nh s¸ng cđa c¸c gèc tù DPPH Hoạt tính chống ôxy hoá đợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc máy Elisa bớc sóng 515 nm Các mẫu có biểu hoạt tính (SC 50%) đợc thử nghiệm để tìm giá trị SC50 Giá trị SC50 đợc xác định thông qua nồng độ chất thử % hoạt động chất thử mà 50% gốc tự tạo DPPH đợc trung hòa chất thử d Phơng pháp xử lý số liệu Các số liệu phân tích đợc xử lý thống kê phần mềm OriginPro 8.5, giá trị đợc biểu diễn dới dạng giá trị trung bình độ lệch chuẩn (mean StDev) II KếT QUả Và THảO LUậN ảnh hởng dung môi khác đến tính chất dịch chiết ảnh hởng dung môi khác đến hiệu tách thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan tảo Spirulina đ đợc nghiên cứu Kết phân tích hàm lợng phycocyanin thuộc tính chức dịch chiết thông qua khả bắt gốc tự dịch chiết đợc trình bày bảng hình Bảng ảnh hởng loại dung môi tỷ lệ sinh khối đến thuộc tính dịch chiết Loại dung môi Tỷ lệ sinh khèi (g/100 ml) PC (mg/ml) SC (%) StDev N−íc 1,40 32 0,10 Etanol 2,33 44 0,15 Hexan 1,93 35 0,05 Metanol 2,03 43 0,11 KÕt qu¶ phân tích rằng, sử dụng dung môi etanol cho hiệu tách chiết cao nhất, hàm lợng PC đạt 2,33 mg/ml Tiếp theo metanol (2,03 mg/ml), hexan (1,93 mg/ml), thấp nớc (1,4 mg/ml) (hình 1) Tuy nhiên, số liệu bảng cho thấy, sử dụng dung môi metanol, hàm lợng sinh khối cho hiệu chống oxy hóa dịch chiết tơng đơng với etanol, lần lợt SC 43%, 44% Trong nghiên cứu tác giả Cho nnk (1999) [4] cho thấy, khả chống oxy hóa dịch chiết sử dụng dung môi metanol cao so với dung môi nớc Điều đợc nghiên cứu Mala nnk.(2009) [7], acetone dung môi đợc tác giả lựa chọn Tuy nhiên, mục đích sử dụng dịch chiết Spirulina cho sản xuất đồ uống khai thác giá 61 trị phycocyanin có dịch chiết, nghiên cứu ethanol (5 g Spirulina/100 ml etanol) đợc lựa chọn dung môi tách chiết thu dịch chiết chứa thành phần chức từ tảo Spirulina tÝnh an toµn thùc phÈm Sư dơng etanol dung môi tách chiết đợc lựa chọn nghiên cứu Herrero nnk (2005) [8] Metanol Phycocyanin (mg/ml) Etanol N−íc Hexan 0 Tû lƯ sinh khèi/dung m«i (g/100 ml) 10 Hình Hàm lợng phycocyanin có dịch chiết từ tảo Spirulina dung môi tỷ lệ sinh khối khác Spirulina Kết cho thấy, sử dụng dung môi etanol 55% cho hiệu phá vỡ tế bào cao nhất, biểu thị hàm lợng PC đạt 2,42 mg/ml, khả bắt gốc tự dịch chiết đạt SC 52% nồng độ etanol 60%, hàm lợng PC đợc giải phóng nhiều (2,45 mg/ml) (hình 2) ảnh hởng nồng độ dung môi đến tính chất dịch chiết Sử dụng etanol dải nồng độ khác từ 30 - 75% nhằm nghiên cứu ảnh hởng nồng độ etanol đến khả phá vỡ tế bào tảo PC (mg/ml) SC (%) PC SC 50 2.4 2.2 40 2.0 30 1.8 1.6 20 1.4 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tỷlệetanol/nướ (%etanol/n−íc etanol) TûclƯ 70 75 80 (% etanol) Hình ảnh hởng tỷ lệ etanol/nớc đến tính chất dịch chiết từ tảo Spirulina ảnh hởng phơng pháp phá vỡ tế bào đến tính chất dịch chiết Sinh khối tảo Spirulina đợc phá vỡ tế bào dung môi etanol 55% sử dụng phơng pháp khác ngâm, lạnh đông nhả lạnh đông Do đặc trng phycocyanin bền nhiệt độ phòng [3] nên ảnh hởng nhiệt độ 62 trình ngâm không đợc xem xét nghiên cứu Dịch sau phá vỡ tế bào đợc ly tâm tốc độ 6000 vòng/10 phút, lọc hút chân không cô chân không để loại dung môi thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan tảo Spirulina Kết từ bảng hình cho thấy, phá vỡ tế bào theo phơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông với thời gian lạnh đông (Ft) giờ, chu kỳ nhả lạnh đông (Tc) lần cho hiệu tách chiết cao rút ngắn đợc thời gian so với phơng pháp ngâm thông thờng Hàm lợng phycocyanin khả bắt gốc tự dịch chiết Spirulina đợc xác định lần lợt 2,67 mg/ml, 65% Chu kỳ nhả lạnh đông đợc đa nghiên cứu Li nnk (2005) [2] lần Trong nghiên cứu tác giả Rachen nnk (2009) [9] nhằm nghiên cứu khả ổn định phycocyanin khoảng nhiệt độ pH khác nhau, phơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông đợc đề cập đến Khả chống oxy hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự dịch chiết Spirulina đợc đa nghiên cứu Herrero nnk (2004) [8] 66,8% Bảng ảnh hởng phơng pháp phá vỡ tế bào đến tính chất dịch chiết Phơng pháp phá vỡ tế bào Ngâm Lạnh đông nhả lạnh đông Thời gian (giờ) 14 PC (mg/ml) 2,46 2,67 SC (%) 51 65 StDev 0,12 0,09 Hình ảnh hởng thời gian lạnh đông chu kỳ nhả lạnh đông đến hàm lợng PC có dịch chiết (Ft Thời gian lạnh đông; Tc Chu kỳ nhả lạnh đông) Xác định số hoạt tính dịch chiết từ tảo Spirulina Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ tảo Spirulina Ký hiệu mẫu Sp-ex Chủng vi sinh vật kiểm định E coli P aeruginosa B subtillis S aureus A niger F oxysporum S cerevisiae C albicans Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: àg/ml) 50 200 50 100 200 200 63 Bảng Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tảo Spirulina Kí hiƯu mÉu §èi chøng (+) §èi chøng (-) Sp-ex Nång ®é mÉu (µg/ml) 50 100 SC% 78,5 ± 0,3 0,0 ± 0,0 65,68 ± 0,1 SC50 (µg/ml) 28,19 20,18 KÕt Dơng tính Âm tính Dơng tính Ghi chú: Sp-ex Dịch chiết Spirulina; Đối chứng (+) Vitamin C; Đối chứng (-) DPPH Đ tiến hành kiểm tra xác định số hoạt tính sinh học dịch chiết từ tảo Spirulina, từ làm sở cho nghiên cứu ứng dụng dịch chiết sản xuất nớc uống chức Kết kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tảo Spirulina đợc trình bày bảng KÕt qu¶ cho thÊy, chđng vi sinh vËt kiểm định sử dụng có F oxysporum C albicans không biểu thị hoạt tính kháng, khả kháng mạnh E coli B subtillis Khả chống oxy hóa dịch chiết đạt 65,68%, giá trị SC50 20,18 àg/ml Nghiên cứu tác giả Mala nnk (2009) [7] rằng, dịch chiết từ tảo Spirulina có khả kháng vi sinh vật cao, chủng vi sinh vật đợc sử dụng nghiên cứu thể kết kháng ®ã lµ Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, E coli Staphylococcus aureus III KếT LUậN Nghiên cứu đ xác định đợc phơng pháp tách chiết đơn giản nhằm thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan từ tảo Spirulina với điều kiện nh sau: Tách chiết theo phơng pháp lạnh đông nhả lạnh đông với thời gian lạnh đông giờ, chu kỳ nhả lạnh đông lần, sử dụng dung môi etanol 55%, tỷ lƯ sinh khèi sư dơng lµ g/100 ml dung môi Dịch chiết đợc tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa kháng vi sinh vật kiểm định với kết quả: khả bắt giữ gốc tự dịch chiết đạt SC 65,68%, SC50 20,18 àg/ml; kháng đợc chủng vi sinh vật kiểm định gồm E coli, P aeruginosa, B subtillis, S aureus, A niger vµ S cerevisiae Dịch chiết từ tảo Spirulina có hoạt tính sinh học cao, thích hợp cho nghiên cứu sử dụng sản xuất nớc uống chức bảo vệ sức khỏe ngời Năm 2005, tác giả Trần Bích Lam 64 nnk [1] đ tiến hành nghiên cứu tách chiết thành phần chức từ tảo Spirulina Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung vào thu nhận phycocyanin, thành phần khác không đợc đề cập tới TàI LIệU THAM KHảO Trần Bích Lam, Nguyễn Thị Mỹ Phúc, Phạm Quang Sơn, 2005: Nghiên cứu thu nhận phycocyanin tõ t¶o Spirulina Science & Technology Development, 8(7): 70-74 Li B., Zhang X., Gao M., Chu X., 2005: Effects of CD59 on antitumoral activities of phycocyanin from Spirulina platensis Biomedicine & Pharmacotherapy, 59: 551560 Francine S Antelo, Jorge A V Costa, Kalil S J., 2008: Thermal degradation kinetics of the phycocyanin from Spirulina platensis Biochemical Engigeering Journal, 41: 43-47 Cho J Y, Jin H J, Lim H J, John N C Whyte, Hong Y K., 1999: Growth activation of the microalga Isochrysis galbana by the aqueous extract of the seaweed Monotroma nitidum Journal of Applied Phycology, 10: 561-567 Jalaja K D., Praveen J D., 2010: Ameliorative potential of aqueous cell extract of Spirulina platensis on diabetes associated metabolic alterations The Bioscan, 5(3): 487-489 Ravi M., Lata De S., Azharuddin S., Paul S F D., 2010: The beneficial effects of Spirulina focusing on its immunomodulatory and antioxidant properties Nutrition and Dietary Supplements, 2: 73-83 Mala R., Sarojini M., Saravanababu S., Umadevi G., 2009: Screening for antimicrobial activity of crude extracts of Spirulina platensis Journal of Cell and Tissue Research, 9(3): 1951-1955 Herrero M., Ib¸nez E., Senorans J., Cifuentes A., 2004: Pressurezed liquid extracts from Spirulina platensis microalga determination of their antioxidant acitvity and preliminary analysis by micelar electrokinetic chromatography Journal of Chromatography A, 1047: 195-203 Rachen D., Natapas Ph, Suwayd N., 2009: Phycocyanin extraction from Spirulina platensis and extract stability under various pH and temperature As J Food Ag-Ind., 2(04): 819-826 10 Romay Ch., Gonz¸lez R., Ledãn N., Remirez D., Rimbau V., 2003: C- Phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects Current Protein and Peptide Science, 4: 207-216 11 Shela G., Olga M B., Elena K., Antonin L., Nuria G M, Ratiporn H., Yong-Seo P., Soon-Teck J., Simon T., 2003: Comparison of the contents of the main biochemical compounds and antioxidant activity of some Spanish olive oils as determined by four different radical scavenging tests The Journal of Nutritional Biochemistry, 14(3): 154-159 12 Vanden Berghe D A., Vlietinck A J., 1991: Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants Academic Press, London In: Dey, P Mp Harbone, J B (Eds) pp 47-69 A STUDY ON EXTRACTION AND DETERMINATION OF SOME PROPERTIES OF SPIRULINA EXTRACTS HOANG VAN TUAN, PHAM HUONG SON, PHAM THU THUY SUMMARY The purpose of this study is establish a simple method for obtaining extracts containing soluble bioactive from Sprulina algae Determination of functional properties of extracts to give the basis to apply for the production of functional beverage The cyanobacterium Spirulina platensis has been considered to be an important subject for biotechnological research due to its nutritional importance S platensis is a blue-green microalgae which can produce large quantities of high value products such as beta carotene, phycoyanin, chlorophyll, gama linolenic acid… In this study, various solvents for included methanol, ethanol, hexane and water were used to select extracted solvent obtaining aqueous extracts from Spirulina algae The process of extraction was done by two methods: Soaking, freezing and thawing The extracts were tested antioxidant activity by free radicals scavenging capacity and antimicrobial activity The data indicated that using ethanol 55%, the rate of biomass/solvent is g/100 ml The freezing and thawing extraction method with freezing time (Ft) in hours, thawing cycle in times gave the highest result Phycocyanin level in the extract reached 2.67 mg/ml, scavenging capacity (SC) reached 65,68%; SC50 20.18 µg/ml The extract can against six tested microorganism including E coli, P aeruginosa, B subtillis, S aureus, A niger and S cerevisiae Keywords: Spirulina, extracts, phycocyanin, Freezing, Thawing Ngµy nhËn bµi: 17-5-2011 65 ... lợng PC có dịch chiết (Ft Thời gian lạnh đông; Tc Chu kỳ nhả lạnh đông) Xác định số hoạt tính dịch chiết từ tảo Spirulina Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ tảo Spirulina. .. Sp-ex Dịch chiết Spirulina; Đối chứng (+) Vitamin C; Đối chứng (-) DPPH Đ tiến hành kiểm tra xác định số hoạt tính sinh học dịch chiết từ tảo Spirulina, từ làm sở cho nghiên cứu ứng dụng dịch chiết. .. đến tính chất dịch chiết ảnh hởng dung môi khác đến hiệu tách thu dịch chiết chứa thành phần hòa tan tảo Spirulina đ đợc nghiên cứu Kết phân tích hàm lợng phycocyanin thuộc tính chức dịch chiết