Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid từ lá chè xanh, trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

“Nghiên cứu tách chiết Flavonoid từ lá chè xanh, trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn” được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp chiết tách Flavonoid phù hợp điều kiện Việt Nam và đánh giá tác dụng của nguyên liệu.

Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ LÁ CHÈ XANH, TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Đồn Thanh Huyền1*, Lê Minh Trí2, Ngơ Thị Thúy Phương1 Tóm tắt: Các hợp chất flavonoid tiến hành tách chiết từ chè xanh, trầu khơng đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dòng vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans Staphycoccus aureus Sau tối ưu quy trình tách chiết chè xanh trầu không để sản xuất hợp chất flavonoid từ nguồn nguyên liệu với thông số kỹ thuật như: dung môi chiết ethanol ethylacetate dung môi n-hexan giờ, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 3:1, nhiệt độ 50C Kết rằng, hoạt chất flavonoid tách từ chè xanh, trầu khơng thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chủng E coli S aureus với đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm Hoạt chất flavonoid tách chiết từ trầu khơng có khả kháng khuẩn tốt so với hoạt chất từ trà xanh Hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều sau chuyển dịch chiết sang dạng nano với đường kính kháng khuẩn từ 3,1 cm Từ khố: Bacillus subtilis; Candida albicans; Escherichia coli; Staphycoccus aureus; Hoạt tính kháng khuẩn; Hợp chất flavonoid MỞ ĐẦU Cây chè sản phẩm nông nghiệp chủ yếu đất nước ta Theo thống kê Tổng cục Hải quan, khoảng năm gần đây, kim ngạch xuất chè bình quân Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD Tuy nhiên, phát triển chè sản phẩm từ chè Việt Nam chưa tương xứng với tiềm [2] Do vậy, cần đẩy mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đồng thời cần nghiên cứu chiết tách chất có hoạt tính sinh học cao (Flavonoid) nhằm ổn định, phát triển sản xuất nâng cao giá trị chè Một số nghiên cứu chứng minh hàm lượng polyphenol chè biến động mạnh theo mùa theo tuổi Bước đầu nghiên cứu thăm dò số hoạt tính sinh học chế phẩm flavonoid chiết xuất từ chè nhận thấy: chế phẩm có khả chống oxy hóa cao, tác dụng bảo vệ gan chuột bị nhiễm độc CCl 4, có tác dụng kháng khuẩn tốt nhiều chủng vi khuẩn gram dương gram âm, có tác dụng vết loét [4] Nhiều nghiên cứu chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trầu khơng, giải thích trầu không dân gian sử dụng trị vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, sâu kiến đốt, bỏng, viêm quanh răng, dùng điều trị bệnh viêm họng [7], Mặt khác, kết nghiên cứu phát khả trị mầm bệnh thủy sản trầu không, tương lai bào chế thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho gia súc động vật thủy sinh từ trầu không [8] Để khai thác lợi ích chúng cách tối ưu, thành phần hóa học có hoạt tính sinh học chè xanh trầu không phục vụ lợi ích người cần phải nghiên cứu sâu hướng tới thương mại hóa sản phẩm thị trường Vì vậy, “Nghiên cứu tách chiết Flavonoid từ chè xanh, trầu không đánh giá hoạt tính kháng khuẩn” thực nhằm tìm phương pháp chiết tách Flavonoid phù hợp điều kiện Việt Nam đánh giá tác dụng nguyên liệu ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 285 Hóa học Kỹ thuật mơi trường 2.1.1 Chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật chuẩn gồm chủng B subtilis, E coli, S aureus, C albicans Phòng vi sinh vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học khoa học tự nhiên cung cấp 2.1.2 Nguyên liệu thực vật Lá chè xanh trầu không rửa sạch, phơi khô, nghiền thành bột mịn Cao chiết flavonoid tách từ chè xanh trầu không 2.1.3 hương pháp nghiên cứu - Chiết tách flavonoid chè xanh, trầu không dung môi áp dụng Trung Quốc giới - Sắc ký lớp mỏng thực lớp mỏng Silica gel với hệ dung môi toluen: ethylacetat: acetone: acid formic có tỷ lệ 5:2:2:1; Chỉ thị UV/Vis 360nm; Thuốc Von’s (Ce/NH4/MoO4)[5] - Định lượng phương pháp Folin-Denis Sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp nối khối phổ (HPLC - MS) hệ thiết bị LC/MSD - Trap - SL - Xác định hoạt tính kháng khuẩn dựa vào phương pháp khuếch tán đĩa thạch Đầu tiên, chủng vi sinh vật thử nghiệm hoạt hóa mơi trường đĩa thạch LB YPG, ủ nhiệt độ 30C ngày Các khuẩn lạc khiết cấy sang bình tam giác chứa 20 ml môi trường LB YPG, ni lắc 200 vịng/phút nhiệt độ 30C qua đêm Sau đó, 100 µl dịch ni cấy chủng vi sinh vật trải sang đĩa thạch mơi trường tương ứng, đĩa sau đục lỗ bổ sung mẫu: dịch chiết từ chè xanh, dịch chiết từ trầu không, ethanol, nước cất khử trùng kháng sinh zeocine (1%) với thể tích 80µl Mẫu ủ qua đêm 30C, sau lấy quan sát vịng kháng khuẩn mẫu so sánh T U VÀ TH U N Tách chiết hợp chất flavonoid từ chè xanh trầu không Sau tối ưu quy trình tách chiết chè xanh trầu không để sản xuất hợp chất flavonoid từ nguồn nguyên liệu với thông số kỹ thuật như: dung môi chiết ethanol ethylacetate dung môi n-hexan, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 3:1, nhiệt độ 50C, giờ, tiến hành tách chiết để thu hoạt chất flavonoid từ chè trầu không Hợp chất flavonoid sắc ký lớp mỏng sắc ký silica gel 60 F254 (Merck) với hệ dung môi toluen: ethylacetat: acetone: acid formic có tỷ lệ 5:2:2:1 A B Hình Sắc ký đồ hợp chất flavonoid tách từ chè xanh, trầu không (A) 1-3: Hợp chất flavonoid tách từ trầu không mẻ khác nhau; (B) 4-6: Hợp chất flavonoid tách từ chè mẻ khác 286 Đ T Huyền, L M Trí, N T T Phương, “Nghiên cứu tách … hoạt tính kháng khuẩn.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Trên hình sắc kí đồ dịch chiết chè xanh cho vết có băng đậm có Rf = 0,28 - 0,96 cm Các vết thu có màu sắc: màu xanh, màu vàng, màu nâu, màu nâu đậm Các vết phân tách tốt, hàm lượng vết tách biệt rõ ràng, riêng biệt, có màu nâu đậm cao, thể băng rõ nét Kết định lượng hợp chất flavonoid cho thấy, chè có chứa tới 10,34 % trầu không đạt 9,2 % hợp chất flavonoid (so với nguyên liệu khô ban đầu) 3.2 Định tính hợp chất flavonoid có dịch chiết chè xanh trầu không thuốc thử Bảng Các phản ứng định tính hợp chất flavonoid thu HC flavonoid NaOH 10% FeCl3 5% Shinoda Diazo Vanillin vàng nâu xanh đen đỏ vàng cam vàng son Lá chè xanh 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ vàng nâu xanh đen đỏ vàng cam vàng son Lá trầu không 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Ghi chú: Dấu +: Chỉ phản ứng dương tính; Các số: Chỉ mức độ đậm nhạt màu phản ứng Phản ứng định tính đặc trưng nhóm chất flavonoid thể bảng cho thấy, phản ứng định tính đặc trưng nhóm chất flavonoid điển hình: Phản ứng FeCl3 cho màu xanh đen đặc trưng cho thấy có mặt flavonoid có cấu tạo orthodiphenol Phản ứng shinoda có màu đỏ đậm đặc phản ứng diazo có màu vàng cam điển hình có mặt chất flavonoid mang nhóm cacbonyl (>C = 0) vị trí C 4; đặc điểm cấu tạo hoá học yếu tố cần có bioflavonoid (các chất flavonoid có hoạt tính sinh học) Phản ứng vanillin 1% có màu đỏ son đặc trưng cho thấy mẫu chè có chứa catechin dẫn xuất catechin [1] Qua kết thu cho thấy, tất mẫu nghiên cứu giàu hợp chất flavonoid Dựa kết định tính phân tích sắc ký TLC hợp chất flavonoid từ chè xanh trầu không, sử dụng cao chiết flavonoid để làm nguyên liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn hợp chất flavonoid Đánh giá khả kháng khuẩn chất có hoạt tính sinh học tách từ chè xanh, trầu không 3.3.1 Đối với chủng vi sinh vật B subtilis, E Coli Candida albicans Cao chè xanh trầu không pha dung dịch DMSO 5% vô trùng với nồng độ 800, 400 200 mg/ml Khả kháng khuẩn xác định dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thể qua đường kính kháng khuẩn tạo đĩa Petri, đường kính lớn hoạt tính kháng khẩn cao, vi khuẩn hoạt động Kháng sinh sử dụng để đối chứng Zeocine (1mg/ml pha DMSO 5%), đối chứng âm dung dịch nước cất vơ trùng B A Hình Hoạt tính kháng khuẩn flavonoid tách chiết với với chủng vi sinh vật B: Subtilis (A); E coli (B) (1: Dịch chiết từ trà xanh, 2: Dịch chiết từ trầu không, 3: Ethanol, 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%) Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 287 Hóa học Kỹ thuật môi trường Kết sau ủ 24 giờ, nhiệt độ 37ºC, mẫu đối chứng khơng có hoạt tính kháng khuẩn, giếng cịn lại xuất vòng kháng khuẩn Đối với chủng vi sinh vật: B subtilis; E coli, C albicans với đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm Hợp chất flavonoid tách chiết từ trầu khơng có vịng kháng khuẩn với tất chủng vi sinh vật nghiên cứu, cịn hoạt chất flavonoid từ trà xanh khơng có khả ức chế chủng nấm men C albicans Kết cho thấy, có khả ức chế với chủng vi khuẩn lại vòng kháng khuẩn hoạt chất flavonoid từ trầu khơng lớn vịng kháng khuẩn từ chè xanh 3.3.2 Đối với chủng S aureus Đối với chủng S aureus (chủng vi sinh vật gram dương - chủng quan tâm đặc biệt nhóm tụ cầu khuẩn nguy hiểm có khả gây nên trình viêm sinh mủ người khả ức chế mẫu chè xanh trầu khơng thể hoạt tính mạnh (hình 4) Hình Hoạt tính kháng khuẩn Hình Hoạt tính kháng khuẩn flavonoid tách chiết chủng flavonoid tách chiết chủng C albicans (1: Dịch chiết từ trà xanh, S aureus (1: Flavonoid từ chè xanh, 2: Dịch chiết từ trầu không, 3: Ethanol, 2: Flavonoid từ trầu không, 3: Ethanol, 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%) 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%) Từ kết cho thấy, hoạt chất flavonoid tách từ chè xanh trầu khơng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chủng E coli S aureus Hoạt chất flavonoid tách chiết từ trầu khơng có khả kháng khuẩn tốt so với hoạt chất tách từ trà xanh Như vậy, hoạt chất flavonoid từ chè xanh trầu khơng có khả ức chế chủng sinh vi vật C albicans, B subtilis, E coli S aureus, đặc biệt flavonoid từ trầu khơng với vịng kháng khuẩn lớn so với flavonoid từ chè xanh dòng vi khuẩn kiểm định Từ mở hướng tạo sản phẩm từ kết hợp hai loại nguyên liệu tự nhiên có hàm lượng hợp chất flavonoid cao kết hợp với công nghệ nano tạo sản phẩm dung dịch khử mùi hôi chân phục vụ cho nhu cầu người Tuy nhiên, vấn đề đặt cần phải nghiên cứu cơng nghệ ngồi việc sử dụng hoạt chất tự nhiên cần phải gắn hoạt chất sinh học vào hạt nano để tạo sản phẩm có chất lượng cao cơng nghệ sinh học Hướng công nghệ nano hướng đề xuất nghiên cứu .4 Đánh giá khả kháng khuẩn chất có hoạt tính sinh học tách từ chè xanh, trầu không chế tạo sang dạng nano Hoạt chất Flavonoid tách từ trầu không chè xanh chuyển sang dạng kích thước nano theo phương pháp chế tạo nano [3] Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chất dạng nano Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Trong hình 5, hoạt tính tăng lên nhiều sau chuyển dịch chiết sang dạng nano 288 Đ T Huyền, L M Trí, N T T Phương, “Nghiên cứu tách … hoạt tính kháng khuẩn.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ với đường kính kháng khuẩn 3.1 cm Kích thước nano xâm nhập thành tế bào, khả làm thông tin di truyền làm sai lệch thông tin lớn Đặc biệt khả thay đổi cấu trúc thành tế bào ngun nhân gây chết vi khuẩn Hình Hoạt tính kháng khuẩn hỗn hợp dịch chiết trước sau trình chế tạo nano chủng C Albicans (1: Dịch chiết trước trình chế tạo nano, 2: Dịch chiết dạng nano, 3: Kháng sinh zeocine 1%.) Hình Hoạt tính kháng khuẩn hỗn hợp dịch chiết trước sau trình chế tạo nano (1: Hỗn hợp dịch chiết trước chế tạo nano, 2, 3: Dịch chiết loại, 4: Hỗn hợp dịch chiết dạng nano, đối chứng: Na-F) Sử dụng Na-F chất sát khuẩn thường có kem đánh làm chất đối chứng Trên hình 3.6 ta thấy, hoạt tính dịch chiết chuyển sang dạng nano vịng kháng khuẩn rộng Sau hỗn hợp dịch chiết chuyển sang dạng nano hoạt tính tăng lên mạnh Qua thí nghiệm chủng vi sinh vật đặc trưng thấy rằng, hợp chất tách chiết từ chè xanh trầu khơng chuyển sang dạng nano có hoạt tính tăng lên rõ rệt, làm cho nghiên cứu T U N Đã tách chiết hợp chất flavonoid từ chè xanh trầu không với thông số kỹ thuật như: dung môi chiết ethanol, ethylacetate dung môi n-hexan, thời gian chiết giờ, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 3:1, nhiệt độ 50C Hoạt chất flavonoid tách từ chè xanh, trầu hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chủng E coli S aureus với đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm Hoạt chất flavonoid tách chiết từ trầu khơng có khả kháng khuẩn tốt so với hoạt chất tách từ chè xanh Hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều sau chuyển dịch chiết sang dạng nano với đường kính kháng khuẩn từ 3,1 cm TÀI I U TH M H [1] Đỗ Thị Gấm, “Nghiên cứu số đặc điểm hóa học tác dụng sinh học chất thực vật thứ sinh chè Camellia sinensis” Luận án tốt nghiệp thạc sĩ khoa sinh học, Trường Đại học KHTN, 2002 [2] Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang, Đỗ Thị Gấm, “Đánh giá biến động thành phần polyphenol chè Tân cương (Thái nguyên) hoạt tính chống oxy hóa chúng” Hội nghị Hóa sinh y dược 2014, tr 37-46 [3] Công nghệ nano Vi.wikipedia.org [4] Trần Chí Hải, Nguyễn Tấn Dân, Nguyễn Đình Nam, Lê Thị Hồng Ánh, Phan Văn Mẫn, “Ảnh hưởng sóng siêu âm đến q trình trích ly polyphenol từ trà già” Tạp chí KHCN ĐHĐN, 2016, 9(106), tr 69-72 [5] Bashir S et al "Assessment of bioautography and spot screening of TLC of green tea (Camellia) plant extracts as antibacterial and antioxidant agents" Indian J Pharm Sci Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 289 Hóa học Kỹ thuật môi trường 2014, 76(4):364-370 [6] Betts JW, Wareham DW, Haswell SJ, Kelly SM "Antifungal synergy of theaflavin and epicatechin combinations against Candida albicans" J Microbiol Biotechnol 2013, 23(9):1322-1326 [7] Datta A, Ghoshdastidar S, Singh M "Antimicrobial property of Piper Betel leaf against clinical isolates of bacteria" International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR) 2011, 2(3):104-109 [8] Barhe´, T.A., Tchouya, G.R.F "Comparative study of the anti-oxidant activity of the total polyphenols extracted from Hibiscus Sabdariffa L., Glycine max L.Merr., yellow tea and red wine through reaction with DPPH free radicals" ArabianJournal of Chemistry, 2016, 9, pp 1-8 ABSTRACT EXTRACTION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM CAMELLIA SINENSIS AND PIPER BETEL LEAFS, WITH AN ASSESSMENT OF THEIR ANTIBACTERIAL EFFECTS In this article, flavonoid compounds from Camellia sinensis and Piper betel leaves were extracted and tested antibacterial activity on Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans and Staphycoccus aureus The extraction process was performed under the following parameters: solvent solutions used are ethanol, ethyl acetate and n-Hexane, extraction time hours, the ratio of solvent to material 3:1, the temperature 50 degrees Celcius The results showed strong antibacterial effects of flavonoid, in particular on the two strains E coli and S aureus, with antibacterial diameters ranging from 0.5 cm to 1.5 cm Flavonoid extracted from Piper betel leaves showed higher antibacterial effects than flavonoid from Camellia sinensis leaves The antibacterial effect is greatly enhanced after transferring the extract into nano form exhibiting antibacterial diameters from 3.1 cm Kewords: Bacillus subtilis; Candida albicans; Escherichia coli; Staphycoccus aureus; Antibacterial; Flavonoid Nhận ngày 14 tháng năm 2020 Hoàn thiện ngày 14 tháng năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 24 tháng năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Hóa học - Vật liệu/Viện KH-CN quân sự; Phịng Quản lý Khoa học Cơng nghệ/Viện KH-CN quân *Email: doanhuyenhhvl@gmail.com 290 Đ T Huyền, L M Trí, N T T Phương, “Nghiên cứu tách … hoạt tính kháng khuẩn.” ... nano hướng đề xuất nghiên cứu .4 Đánh giá khả kháng khuẩn chất có hoạt tính sinh học tách từ chè xanh, trầu không chế tạo sang dạng nano Hoạt chất Flavonoid tách từ trầu không chè xanh chuyển sang... hoạt chất flavonoid tách từ chè xanh trầu khơng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chủng E coli S aureus Hoạt chất flavonoid tách chiết từ trầu khơng có khả kháng khuẩn tốt so với hoạt chất. .. 5:2:2:1 A B Hình Sắc ký đồ hợp chất flavonoid tách từ chè xanh, trầu không (A) 1-3: Hợp chất flavonoid tách từ trầu không mẻ khác nhau; (B) 4-6: Hợp chất flavonoid tách từ chè mẻ khác 286 Đ T Huyền,