Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzym protease từ vi khuẩn bacillus subtilis natto

DANH M ỤC CÁC BẢNG B ảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase 6 B ảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 11 Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT

ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN

Bacillus subtilis natto

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT

ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN

Bacillus subtilis natto

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm

ơn chân thành nhất tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công

nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh và DS Đinh Thị Thanh Thảo cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn

Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Học viên

Đinh Thu Hương

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ……… 2

1.1.1 Phân loại khoa học……… 2

1.1.2 Nguồn gốc……… ……… 2

1.1.3 Đặc điểm hình thái……… 2

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng……… 3

1.1.5 Đặc điểm sinh lý……… 3

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto……… 3

1.2 Nattokinase ……… 4

1.2.1 Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase 4 1.2.2 Nattokinase……… 5

1.3 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật ……… 11

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh vật………

11 1.3.2 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn………

13 1.3.3 Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật………

14 1.3.3.1 Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus………

14

1.3.3.2 Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B 17

subtilis natto………

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ……… 20

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng……… 20

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất và thuốc thử……… 20

2.1.3 Môi trường ……… 20

2.1.4 Máy móc và dụng cụ……… 21

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… 21

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto………

21 2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được………

21 2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 22

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy B subtilis natto……… 22

2.3.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme………

23 2.3.3 Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease……… 23

2.3.3.1 Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat……… 24

2.3.3.2 Phương pháp chiết enzyme bằng dung môi hữu cơ (aceton hay ethanol 96%)………

25 2.3.3.3 Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc kí lọc gel Sephadex G – 75………

26 2.3.4 Phương pháp sơ bộ định tính các nhóm enzyme trong dịch lên men………

26 2.3.5 Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease………

27 2.3.6 Phương pháp điện di SDS – PAGE……… 29

2.3.7 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin……… 30

2.3.8 Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm……… 31

Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ ……… 33

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả

năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto………

năng tạo enzyme của vi khuẩn B subtilis natto………

3.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt

tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được ………

41

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme

protease ngoại bào của B subtilis natto………

41

3.2.2 Lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của B

subtilis natto………

43

3.2.2.1 So sánh khả năng chiết enzyme protease bằng dung môi hữu

cơ (aceton, ethanol 96%) và amoni sulfat 60%

43

3.2.2.2 Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào

của B subtilis natto………

4.1 Về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo

enzyme protease của Bacillus subtilis natto………

54

4.2 Về lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu

fibrin của enzyme protease thu được ………

57

4.2.1 Về ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme

protease ngoại bào của B subtilis natto………

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

B subtilis natto Bacillus subtilis natto

giải fibrin của chất nghiên cứu)

Điện di SDS – PAGE Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của

sodium dodecyl sulfat

t – PA Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa

plasminogen ở mô)

DANH M ỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase 6

B ảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 11

Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus 15

Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B

Bảng 2.3: Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm 31

Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy B

Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi

nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có

bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau

34

Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch

lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2

có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau

35

B ảng 3.4: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi

nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon

khác nhau

36

B ảng 3.5: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi

nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung maltose ở các

nồng độ khác nhau

37

Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch

lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở

các nồng độ khác nhau

37

B ảng 3.7: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men

khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ

sung đậu tương và casein

38

Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men

khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung muối vô

cơ

39

B ảng 3.9: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men

khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp 40 Bảng 3.10: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi

nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp 41 Bảng 3.11: Đường kính vòng phân giải casein của dịch trong ở

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính phân giải cơ chất và thời gian

tiêu fibrin của enzyme protease ngoại bào thu được khi kết tủa

bằng các tác nhân khác nhau

44

Bảng 3.13: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết

Bảng 3.14: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột,

CMC của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni

sulfat bão hòa khác nhau

46

Bảng 3.15: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ

protease của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni

sulfat bão hòa khác nhau

47

Bảng 3.16: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ

protease của các dịch enzyme thu được theo quy trình kết tủa phân

đoạn

48

Bảng 3.17: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân

Bảng 3.18: Đánh giá sự có mặt của amylase và cellulase trong các

Bảng 3.19: Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease 51

Bảng 3.20: Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin của mẫu

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2

Hình 1.2: Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase 6

Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase 8

Hình 1.4: Hiệu suất và mức tinh sạch của protease chiết tách từ

Hình 1.5: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới

Hình 2.1: Sơ đồ các giai đoạn chiết tách enzyme protease 24

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn

Biểu đồ 3.2: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải

Hình 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ protein C – mật độ

quang D của mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret 45

Hình 3.2: Biến thiên khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC

của các dịch enzyme theo nồng độ amoni sulfat bão hòa sử dụng

để chiết

46

Hình 3.3: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzyme protease và các

Hình 3.4: Điện di đồ SDS-PAGE một số phân đoạn tinh sạch sau

Hình 3.5: Hình ảnh thủy phân fibrin trên đĩa thạch của enzyme

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các chế phẩm enzyme được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người Trong số đó, protease – enzyme phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzyme có nhiều ứng dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả tốt

Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin, trypsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn

thuộc chi Bacillus [24] Vi khuẩn B subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật

đã phát hiện ra trong Natto có chứa Nattokinase – một enzyme thuộc nhóm các enzyme protease có khả năng phân giải fibrin [28] Từ đó đến nay, nhiều nghiên

cứu về B subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này

có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như Nattokinase [21], elastase [27], bacillopeptidase F [57]…

Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn B subtilis natto có khả năng sinh

nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase Việc thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzyme của vi khuẩn Vì thế, lựa

chọn môi trường tốt nhất cho B subtilis natto sinh lượng lớn protease và giảm bớt

các enzyme khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, trong đó có Nattokinase Vì vậy, luận văn “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme

protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu được ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto.

2 Chọn được phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis var natto) là một

chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh

lần đầu tiên vào năm 1905 [24]

1.1.1 Phân loại khoa học

Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Họ

(Family): Bacillaceae, chi (Genus): Bacillus, loài (Species): Bacillus subtilis, phân

loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [18],[24]

Khi mới được phát hiện ra, B subtilis natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B subtilis của

Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [52],[56], các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác

là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [24] Trong dòng B subtilis natto còn có nhiều loại như B subtilis natto B – 12 [58], B subtilis natto OK2 [15], B subtilis natto NRRL 3666 [38]…

1.1.2 Nguồn gốc

B subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn

truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật B subtilis natto có nhiều

trong rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [24],[33]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto (độ phòng đại 100 lần) [64]

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

B subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào

tử hình que có kích thước dưới 1μm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với

nhau thành chuỗi (hình 1.1) Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có

kích thước lớn và hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [49],[55]

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng

B subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose, saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển

của vi khuẩn là protein và amino acid B subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid

glutamic, arginin, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [55]

1.1.5 Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là sinh vật hiếu khí, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn

3% B subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 500C), tối thích là

370C Nhiệt độ tối thích cho sự nảy mầm của bào tử là 400C Ở 550

C, vi khuẩn

ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra B subtilis natto phát triển ở

pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6 Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [55]

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh

tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ–transpeptidase theo Noda năm 1989 [44] và Ogawa năm 1991 [45]; amylase theo Yamane K năm 1974 [61]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [34], Shimizu M năm

1992 [53]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [62]; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[22],[57],[58],[60]

Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B subtilis natto như sau:

 Nattokinase: là m ột enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay

subtilisin BSP Kí hiệu: EC 3.4.21.62 Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có

275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử TLPT: 27,7 kDa đến

29 kDa [21],[58] Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học

 Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [27] Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định

hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500

C; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [43]

 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [57]

 Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho

hoạt động của enzyme là 550

C, pI = 3,9 Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [32],[60]

1.2 Nattokinase

1.2.1 Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase

Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzyme đã được ứng dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase Cơ chế chung của các enzyme này là hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng phân giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII, XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu Vì thế plasmin

có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [2] Căn cứ vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành hai nhóm:

a Enzyme tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác

động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không mong muốn là chảy máu toàn thân Một số enzyme điển hình của nhóm này như:

- Streptokinase: chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus haemolyticus tan huyết β nhóm C Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ

kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng [2]

- Urokinase: chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào thận bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen [2]

- Anistreplase: là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh học [2]

b Enzyme tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzyme hoạt hóa

plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng Tuy nhiên, do sản xuất bằng công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt Một số enzyme điển hình của nhóm

này như:

- Alteplase: có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết ra trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt, nước mắt Alteplase được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc gọi là rt- PA [2]

- Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu Pro-urokinase

được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E coli [2]

Mặc dù một số enzyme đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị huyết khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời gian bán thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản ứng dị ứng [19] Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối

b Đặc điểm cấu tạo

Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin

và không có cầu nối disulfua trong phân tử Trọng lượng phân tử là 27 kDa và pI= 8,6 ± 0,3 [9] Là enzyme thuộc họ subtilisin của protease serin, Nattokinase cũng có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và

nhóm carboxyl của Asp-32 Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- Phe-pNA [9],[63]

Pro-Hình 1.2.Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [23]

c Tính chất

Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn

hơn 11, hoạt tính tối ưu ở pH = 8 – 9 Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 400

C,

bị giảm hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 500

C và bị phân hủy ở 700

C [19] Hoạt tính của Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl2, H2O2 và bị ức chế hoàn toàn bởi phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA), các ion Fe3+ và Al3+cũng ức chế enzyme này [19],[23] Hoạt tính của Nattokinase tăng lên khi có mặt MgSO4, CaCl2, MnCl2 [19],[63]

d Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase

Theo hiệp hội Nattokinase Nhật Bản, Nattokinase có thể được xác định dựa vào các phương pháp sau: [66]

Bảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase

là sản phẩm tự nhiên

tốt nhất với các enzyme khác, đặc

tốt

- Mất thời gian đánh giá

- Có sự khác nhau

giữa các lần thí nghiệm do chất thử

hóa fibrin đã biết

e Cơ chế tiêu fibrin

Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác nhau:

Hình 1.3: Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [42]

- Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin

- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase thành Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể

- Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng hợp t- PA trong huyết tương Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin

Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu bình thường [42]

f Công dụng

Trong các protease ngoại bào của B subtilis natto, Nattokinase có nhiều tiềm

năng được ứng dụng làm dược phẩm Rất nhiều các nghiên cứu về hiệu quả của enzyme này trong điều trị bệnh huyết khối và bệnh tim mạch liên quan như nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [21], Maruyama năm 1998 [39], Haritha M năm 2011 [25] đã chứng minh Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu đông và phòng chống huyết khối thông qua các cơ chế: trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông; hoạt hóa quá trình tổng hợp t – PA trong huyết tương; thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin; tăng cường plasmin nội sinh [21]

[25],[39] Năm 2009, kết quả của Kim J đã chỉ ra Nattokinase có vai trò trong việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [35] Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng công trình vẫn còn hạn chế Năm 2008, bác sĩ Nguyễn Chí Tuệ - Bệnh viện Quân Y 103

đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Nattospes (Nattokinase) trên

73 bệnh nhân đột quỵ não: trong đó 21,62% cải thiện ý thức sau điều trị; 67,67% cải thiện di chứng; hầu hết bệnh nhân có hiệu quả về lâm sàng, xu hướng giảm đông máu, không có trường hợp nào bị tai biến chảy máu [65]… Nghiên cứu về tác dụng của Nattospes trên bệnh nhân đột quỵ não tại Bệnh viện 108 do GS.TS Nguyễn Văn Thông (2008) cũng cho thấy Nattospes có hiệu quả tương đương aspirin (thuốc đầu

tay trong điều trị đột quỵ não) [65]

Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể

khi hấp thụ qua đường uống Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi uống

100mg/ngày và tác dụng của nó kéo dài 8 - 12 giờ Do ưu điểm an toàn, hiệu lực cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường, Nattokinase

có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [22] Ngoài ra, Nattokinase còn có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch như làm giảm huyết áp, giảm lipid máu, ngăn xơ vữa động mạch [26],[28]

g Nattokinase dùng trong thực phẩm chức năng và thuốc

Nattokinase lần đầu tiên được phân lập và bán trên thị trường dưới tên

NSK-SD vào năm 1998 bởi Phòng thí nghiệm sinh học Nhật Bản Nattokinase đôi khi được sử dụng trong y học như là một tác nhân làm giảm cục máu đông, thay thế cho điều trị bằng aspirin hàng ngày Tuy nhiên, sự thay thế này không được khuyến cáo [66]

Hiện nay, các nguyên liệu Nattokinase trong sản phẩm trên thị trường chủ yếu được sản xuất bởi Nhật Bản và Hàn Quốc nhưng nguồn nguyên liệu này khá hạn chế và giá thành cao Theo dự đoán, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng Riêng tại thị trường Nhật Bản: doanh số khởi đầu đạt 500 triệu yên (2002), đã tăng đến 1,5 tỉ yên (2006), và đạt 3 tỉ yên năm 2010 Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc, Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng Hiện sản

phẩm viên nén từ enzyme này giá khoảng 10.000 đồng/viên (hoạt tính 1000 FU), và

được khuyến cáo sử dụng hàng ngày Các sản phẩm bán trong nước hiện tại giá dao

động trong khoảng 4.000 - 5.000 đồng/viên (hoạt tính 300 FU) dưới dạng thực

phẩm chức năng Từ đó cho thấy nguồn nguyên liệu enzyme này có thị trường rất

Bảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase

Sản phẩm Nattokinase Hàm lượng

(FU)

Dạng bào

S-Nattokinase 5.000 Viên nang United Biomedical, Mỹ

Nattokinase 1.000 Viên nang CNS Pharm Korea Co., Ltd, Hàn

Quốc Nattokinase

plus

3.000 Viên nang Food Science of Vermont dba Da

Vinci Laboratories, Mỹ Nattokinase

plus FUcoidan

2.000 Viên nang Umeken, Nhật Bản

1.3 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật

Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzyme bằng phương pháp hóa học (synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzyme hiện nay vẫn được chiết

tách từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật [4]

Vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất phong phú trong đó có những enzyme

mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme với một lượng lớn, trong thời gian ngắn Con người có thể tác động vào vi sinh vật để thu được enzyme theo ý muốn Mặt khác enzyme vi sinh

vật thường có hoạt tính mạnh [11],[29]

Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ

yếu:

 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme

 Chiết tách và thu nhận enzyme

 Tinh sạch thu chế phẩm enzyme

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh vật

a Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzyme và thành phần enzyme được tạo thành cũng khác nhau Hiện tượng này chỉ thấy ở vi sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật Khi trong môi trường có những chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường những enzyme tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được Vì vậy khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật có thể tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường.Trong công nghệ sản xuất enzyme cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của

nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [4],[5],[8]

b Ảnh hưởng của pH của môi trường

pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp enzyme Do đó người ta thường điều chỉnh pH để thu được enzyme với hiệu suất cao nhất Mỗi loại enzyme thường được tổng hợp mạnh trong một vùng pH xác định đối với từng loại vi sinh vật Ví dụ: amylase và pectinase của nấm mốc được tổng hợp mạnh trong môi trường có pH = 4,5 - 5,0 còn protease thì

pH = 6 - 6,5 [4],[8]

c Ảnh hưởng của nhiệt độ

Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme đều thuộc loại ưa nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22 - 320

C, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt

độ cao hơn (35 - 550

C) và chúng có khả năng tổng hợp các enzyme có độ bền nhiệt cao Khi nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng hợp enzyme bị giảm rõ rệt [4],[8]

d Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzyme tối đa Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi sinh vật và ít phụ thuộc vào enzyme chúng tổng hợp

Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm cho phù hợp [4],[8]

1.3.2 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn

Từ trước tới nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên

men bán rắn chủng B subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hoặc lên men

dịch thể Một số hướng nghiên cứu Nattokinase tái tổ hợp cũng đang được tiến hành đem lại kết quả bước đầu khả quan Mới đây, Weng và cộng sự đã nghiên cứu cải

thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E coli bằng đột

biến điểm: thay thế Methionin tại vị trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này [59] Trong nước, Nguyễn Thị Thảo và cộng sự (2008) đã nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện

gen mã hóa Subtilisin từ các chủng B subtilis G1 và RD23 trong E coli

BL21/pESUb [11]… Tuy nhiên công nghệ lên men tạo enzyme Nattokinase vẫn là một hướng nghiên cứu lâu đời và có nhiều triển vọng trong sản xuất enzyme nhằm sản xuất với số lượng lớn và giảm giá thành sản xuất cho sản phẩm

Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho sản lượng Nattokinase cao nhất

a Ngoài nước

Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh

dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B subtilis natto NLSSE Khảo

sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat, casein, pepton từ đậu nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20 g/l Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO4.7H2O, KH2PO4.3H2O, cao nấm men và CaCl2 Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300 U/ml với thành phần môi trường tối ưu (g/l): pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [37] Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối

ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Các

nhân tố được chọn để khảo sát: glucose, pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ Hoạt tính đạt 3.194 U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [17] LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu

cho sản xuất Nattokinase từ vi khuẩn B subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%,

K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3% [50]

b Trong nước

Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase 470 FU/g trên môi trường đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay

từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Sinh học nhiệt đới và

phân lập từ thực phẩm Natto [9]

1.3.3 Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật 1.3.3.1 Protease và chi ết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi

Bacillus

Hiện nay, các enzyme vi sinh vật được sử dụng ngày càng phổ biến trong

nhiều lĩnh vực; trong số đó có các enzyme nhóm protease

a Khái ni ệm về protease

Nhóm enzyme protease là các enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid (– CO – NH –) giữa các L – acid amin trong phân tử protein, polypeptid đến

sản phẩm cuối cùng là các L – acid amin (hình 1.4) Ngoài ra, nhiều protease cũng

có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển acid amin [10]

H2N – CH – CO – NH – CH – CO – … – NH – CH – COOH

R1 R2 Rx

H2N – CH – COOH + H2N – CH – CO … NH – CH – COOH

R1 R2 Rx

Hình 1.4: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme [3] Có nhiều cách phân loại protease:

+ Phân loại theo pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme, protease được chia thành 3 nhóm: protease acid (pH hoạt động từ 2 – 4); protease trung tính (pH hoạt

H2O

Protease

động từ 7 – 8); protease kiềm (pH hoạt động từ 9 – 11) [10]

+ Phân loại theo vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease được chia thành hai

loại: endopeptidase (protease thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid) và exopeptidase (protease phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid) [10] Các endoprotease có nhóm OH của Ser đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác được gọi là protease serin Trong protease serin có hai họ được nghiên cứu nhiều là: chymotrypsin và subtilisin Đa số protease họ subtilisin

có nguồn gốc từ vi khuẩn như: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN [10],[24]

b Protease ngo ại bào của chi Bacillus và các phương pháp chiết tách

Chi Bacillus là chi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp; sản lượng protease trên 100 tấn/năm Các sản

phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus và một số ứng dụng của chúng được đưa

ra trong b ảng 1.3

Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus [24]

Nhà sản xuất Tên thương mại Nguồn vi sinh vật Ứng dụng

Rohm, Đức Corolase 7089 Bacillus subtilis Công nghiệp thực

Mỹ phẩm, dược phẩm

Cryst Protease B subtilis (K2) Nghiên cứu khoa học Cryst Protease B subtilis (bioteus) Nghiên cứu khoa học

Bioprase SP – 10 B subtilis Công nghiệp thực

phẩm

Novo Nordisk,

Đan Mạch

Alcalase B licheniformis Chất tẩy rửa

da

Hiện nay, quy trình chiết tách protease ngoại bào của chi Bacillus vẫn được

nghiên cứu cả trên quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp

 Quy mô phòng thí nghiệm: Quy trình chiết tách protease ngoại bào của loài

Bacillus subtilis thu ộc chi Bacillus được nghiên cứu nhiều (bảng 1.4) Phương pháp

chiết tách hay được sử dụng là kết tủa bằng amoni sulfat 40 – 80% bão hòa; tinh chế

bằng phương pháp thẩm tích và sắc kí

B ảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B subtilis

Trích dẫn Phương pháp chiết tách Tinh chế và xác định TLPT

3 Ahmed I (2011)

[13]

Kết tủa loại protein tạp:

AS 40% bão hòa Tủa enzyme: AS 70%

bão hòa

Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100 Điện di SDS – PAGE

Điện di SDS – PAGE 5.Mazar F.M

(2012) [41]

Hệ 2 pha: PEG 10.000 22%; citrat 18%

Hiệu suất và mức tinh sạch của chế phẩm enzyme so với dịch chiết enzyme

thô ban đầu của một số quy trình chiết tách protease theo thứ tự trong bảng 1.4 (từ quy trình 1 đến 5) được thể hiện trên đồ thị hình 1.5

Nhìn chung, hiệu suất của quy trình chiết tách trên quy mô phòng thí nghiệm

sử dụng phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat (thứ tự từ 1 đến 4) thường nhỏ hơn 10% [13],[14],[18],[20],[41],[51]

Hình 1.5: Hi ệu suất và mức tinh sạch của protease chiết tách từ môi trường nuôi

c ấy Bacillus subtilis

 Quy mô công nghiệp: Quy trình chiết tách một enzyme ngoại bào họ subtilisin của Bacillus sp theo phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat trên quy mô

công nghiệp được thể hiện trên hình 1.6 Trong quy trình này, mầm kết tinh được

thêm vào để tủa tạo thành dưới dạng tinh thể Sản phẩm là subtilisin dưới dạng

muối halogen [24],[29]

Hình 1.6: Quy trình k ết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen

1.3.3.2 Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto

Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B subtilis natto trên quy mô phòng thí nghiệm được nêu ra trong bảng 1.5 Phương pháp chiết

tách hay dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa Tinh chế bằng

Siêu lọc, cô đặc Tách tế bào, thu dịch trong

Lên men

Dung môi Nước rửa

Mầm kết tinh

Muối

Chất thải

cách kết hợp nhiều phương pháp khác nhau Nhìn chung hiệu suất và mức tinh sạch enzyme sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau Tuy nhiên, các nghiên cứu

chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto đã cho thấy vi khuẩn này có nhiều

tiềm năng ứng dụng sản xuất protease phục vụ cho công nghiệp dược phẩm [55]

B ảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto

Trích d ẫn Phương pháp chiết tách Phương pháp tinh chế

Kato T

(1992) [32]

Tủa enzyme: (NH4)2SO465% bão hòa

Sắc kí trao đổi ion

Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl, Butyl – toyopearl HW – 50F

Sắc kí lỏng hiệu năng cao Fujita M

(1993) [21]

Tách lấy enzyme thô: NaCl 0,9%

Kết tủa loại tạp: (NH4)2SO425% bão hòa

Tủa enzyme: (NH4)2SO460% bão hòa

Thẩm tích

Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl

Sắc kí trao đổi ion CM – toyopearl

Muramatsu

K (2000)

[43]

Tủa enzyme: (NH4)2SO460% bão hòa

Thẩm tích; Sắc kí trao đổi ion

Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Sắc kí trao đổi ion

Hiệu suất: 77% Mức tinh sạch: 6,27 Tokudome S

Siêu lọc qua màng UF-1, UF-5 OPS Đông khô thu chế phẩm enzyme Hiệu suất: 0,18%

Hiệu suất: 42,1% Mức tinh sạch: 19

Ở Việt Nam những năm gần đây, đã có một số nghiên cứu về Nattokinase và enzyme họ subtilisin của B subtilis được thực hiện như:

Năm 2008, Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương đã tách chiết enzyme

Nattokinase (fibrinase) từ dịch nuôi cấy B subtilis NT5, enzyme có TLPT khoảng

27 kDa, pI = 7,04; nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính enzyme là 600

C và 7,5; các điều kiện ổn định enzyme là Ca2+

và Mg2+ với nồng độ 5 – 10 mM, pH = 7 – 7,8 Enzyme đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan [1]

Năm 2008, Nguyễn Thị Thảo và cộng sự đã nhân dòng, phân tích trình tự và

biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B subtilis G1 và RD23 trong E coli

BL21/pESUb [11]

Tuy vậy, số lượng công trình nghiên cứu về việc chiết xuất và tinh chế Nattokinase từ môi trường lên men B subtilis natto còn rất hạn chế

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng

B subtilis natto (Chủng Nhật Bản được lưu giữ tại phòng Vi Sinh – Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội)

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất và thuốc thử

a Nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất

Nattospes (300

FU/viên)

Công ty IMC (Việt Nam) Nattokinase 20.000 FU/g Trung Quốc

2.1.4 Máy móc và dụng cụ

Danh sách thiết bị sử dụng được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng

Tên Nguồn gốc (Hãng) Tên Nguồn gốc (Hãng)

Tủ cấy vô trùng Italia (UV Bioair) Máy lắc Đức (Bioshaker)

Tủ ấm, tủ sấy Đức (Me mmert) Cân phân tích Đức (Satorius) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP) Cân kỹ thuật Đức (Satorius)

Lò vi sóng Hàn Quốc (Daewoo) Máy đo pH Đức (Presica)

Máy li tâm Đức (Universal) Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) Máy li tâm Đức (Rotofix) Máy đông khô Đức (Alpha Christ)

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa Petri nhựa (đường kính 8,8 cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto

 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon: glucose, saccharose, maltose, lactose

 Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương (dạng bột và dạng hạt) và chất cảm ứng

(casein)

 Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ: MgSO4, MnCl2, CaCl2

2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được

 Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis

 Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế

 Sơ bộ thử khả năng phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy B subtilis natto

a Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch thường (có thành phần ở mục 2.1.3), đun cho đồng

nhất Chia đều môi trường vào trong các ống nghiệm (5 – 6 ml/ống), nút kín Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 1 atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội cho thạch đông lại Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới theo hình ziczac Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ủ ở

370C/24 giờ Bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở 4 – 50C Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tháng/lần [5]

b Phương pháp nhân giống trong bình nón

Pha 20 ml môi trường canh thang (có thành phần ở mục 2.1.3) cho vào bình

nón 50 ml, nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1 atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống giống vào môi trường Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [5]

c Phương pháp lên men

Pha 150 ml môi trường canh thang (có thành phần ở mục 2.1.3) cho vào bình

nón 250 ml, nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1 atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường mới với tỷ lệ cấy truyền là 10% Nuôi trên máy lắc ở

370C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [5]

2.3.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme

Nguyên tắc: So sánh khả năng sinh enzyme của B subtilis natto khi thay đổi

thành phần môi trường dinh dưỡng và giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy khác

a Kh ảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon

Pha 50 ml môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung riêng 2% từng

loại đường khác nhau: glucose, saccharose, maltose, lactose, hấp tiệt trùng Tiến

hành nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp ở mục 2.3.1 Sau đó, đem thử và so sánh

hoạt tính enzyme của dịch lên men từ các môi trường theo phương pháp mô tả ở

mục 2.3.4 Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau và lấy kết qủa trung bình

b Kh ảo sát ảnh hưởng của đậu tương và của chất cảm ứng tạo protease (casein)

Pha 50 ml các môi trường: môi trường MT2 và MT2 bổ sung riêng từng thành phần: 2% đậu tương hạt, 2% bột đậu tương, 0,5% casein vào các bình nón

100 ml, hấp tiệt trùng Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn như phương pháp mô tả ở mục

2.3.1 Sau đó, đem thử và so sánh hoạt tính enzyme của dịch lên men từ các môi trườngtheo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4 Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau và

lấy kết qủa trung bình

c Kh ảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ

Pha 50 ml môi trường MT2 và MT2 bổ sung riêng 0,05% từng loại muối vô

cơ CaCl2,MnCl2, MgSO4, hấp tiệt trùng Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn như phương

pháp đã mô tả ở mục 2.3.1 Sau đó, đem thử và so sánh hoạt tính enzyme của dịch lên men từ các môi trường theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4 Làm 3 lô ở 3 thời

điểm khác nhau và lấy kết qủa trung bình

2.3.3 Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease

Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme protease được thể hiện ở hình 2.1

2.3.3 1 Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat

Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzyme, tính tan của

protein enzyme tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out) ở nồng độ muối cao Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzyme dẫn đến sự tủa [16]

Dịch nuôi cấy

B subtilis natto

Dịch nổi 1

Dịch chiết chứa enzyme thô

Tủa enzyme thô

Phân đoạn enzyme

Sơ bộ xác định enzyme thu

được bằng điện di phương

pháp SDS - PAGE

Hình 2.1: Sơ đồ các giai đoạn chiết tách enzyme protease

Tiến hành:

a Kh ảo sát nồng độ amoni sulfat sử dụng để kết tủa enzyme

Dịch chiết enzyme thô được giữ ở nhiệt độ 40

C/1 giờ Thêm dần dần amoni sulfat vào 100 ml dịch chiết enzyme thô đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa theo yêu cầu Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ Li tâm dịch chiết với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để thu riêng tủa enzyme Hòa tan tủa enzyme vào 1 ml dung dịch đệm thu được dịch enzyme [14],[51]

b K ết tủa phân đoạn protein enzyme

Ở nồng độ amoni sulfat bão hòa đầu tiên, tiến hành tương tự như trên Sau khi li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng tủa enzyme; phần dịch còn lại được thêm dần dần amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ hai Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng phần tủa và dịch Phần tủa được hòa tan vào 1 ml dung dịch đệm Phần dịch lại được thêm amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ ba Lặp lại các bước cho đến nồng độ amoni sulfat bão hòa cuối cùng [51]

Cách pha nồng độ amoni sulfat bão hòa theo phụ lục 2

2.3.3.2 Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (aceton hay ethanol 96%)

Nguyên tắc: Khi cho dung môi hữu cơ vào trong môi trường có chứa protein

enzyme thì hằng số điện môi của môi trường giảm, các phân tử nước xung quanh bề mặt enzyme được thay thế bằng các phân tử của dung môi hữu cơ, khả năng hòa tan của protein enzyme giảm nên dẫn đến sự kết tủa [5],[10]

+ Trộn dung môi hữu cơ với dung dịch enzyme với tỉ lệ 3:1 Để yên 1 ngày ở 4 –

50C Gạn bớt dung môi hữu cơ

+ Li tâm, thu được dịch li tâm và kết tủa Để kết tủa ở nhiệt độ phòng 30 phút cho bay hơi bớt dung môi hữu cơ Tủa được hòa tan vào 1 ml dung dịch đệm thu được

dung dịch enzyme [6],[49]

2.3.3 3 Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc kí lọc gel Sephadex G -75

Nguyên tắc: Khi nạp mẫu vào cột sắc kí có pha tĩnh là các hạt gel xốp; các

phân tử mẫu có kích thước lớn hơn kích thước của lỗ gel sẽ đi vào khoảng trống giữa các hạt gel và ra khỏi cột trước Các phân tử có kích thước nhỏ khuếch tán tối

đa vào trong các hạt gel và ra khỏi cột sau [10],[16],[40]

Tiến hành:

Ngâm 1g gel Sephadex G –75 trong dung dịch đệm trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn Nhồi cột gel Cho dung dịch đệm chảy qua cột có đường kính

1 cm với tốc độ khoảng 7 ml/giờ trong vài giờ để ổn định cột

Mẫu cần tinh chế loại muối được hòa tan hoàn toàn trong 1ml dung dịch đệm

và đưa vào cột Chờ 30 phút để mẫu ngấm hết xuống Thêm dung dịch đệm vào cột

và thu mỗi phân đoạn 1 ml Đánh giá sơ bộ quá trình lọc gel kết thúc: Cho dung

dịch chảy ra từ cột phản ứng với dung dịch BaCl2, nếu tạo thành tủa trắng không tan trong dung dịch HCl loãng thì quá trình lọc gel kết thúc Rửa cột bằng dung dịch đệm trong khoảng 3 giờ [10],[16]

2.3.4 Phương pháp sơ bộ định tính các nhóm enzyme trong dịch lên men

Protease tổng bao gồm Nattokinase và các protease khác, nếu hoạt tính protease tổng cao thì hoạt tính Nattokinase cũng có khả năng cao Do hóa chất phân tích Nattokinase rất đắt tiền, nên ở đây chúng tôi gián tiếp định tính và định lượng Nattokinase thông qua định tính, định lượng protease và khả năng tiêu fibrin của protease

a Phương pháp sơ bộ định tính protease

Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein

của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch [5]

Tiến hành:

Pha 100 ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có mỏ 200 ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ và đọc kết quả

b Phương pháp sơ bộ định tính amylase

Nguyên tắc: Amylase có khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid

và đường đơn không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2) Dùng tinh bột làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính amylase có trong dịch chiết enzyme [5]

Tiến hành:

Pha 100 ml dung dịch chứa 1% tinh bột và 2% thạch trong cốc có mỏ 200

ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ Dùng Lugol láng lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải tinh bột

c Phương pháp sơ bộ định tính cellulase

Nguyên tắc: Cellulase có khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid

không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2) Dùng CMC làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính cellulase có trong dịch chiết enzyme [5]

Tiến hành:

Pha 100 ml dung dịch chứa 0,5% CMC và 2% thạch trong cốc có mỏ 200

ml, đun cho đồng nhất Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri có đường kính 90

mm Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ Dùng Lugol láng lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải CMC

2.3.5 Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease

a Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein

Nguyên t ắc:

Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++

trong môi trường

kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độ đậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong

mẫu thử [10]

Tiến hành:

Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm

có pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau:

Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 Dung dịch đệm

Nồng độ protein

(mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0 Thuốc thử Gornall

Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng Tiến hành đo quang phổ hấp

thụ của các dung dịch ở bước sóng thích hợp Từ kết quả đo quang dựng biểu đồ thể

hiện mối quan hệ giữa nồng độ protein C (mg/ml) – mật độ quang D

Đo quang phổ hấp thụ của dung dịch thử, dựa vào biểu đồ mẫu (phương trình, hệ số Ktb) để xác định nồng độ protein

Nguyên t ắc: Dưới tác dụng của enzyme, một phần protein bị thủy phân, giải

phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic Phần protein còn lại sau phản ứng

bị tủa trong acid tricloroacetic Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret

như mục a phần 2.3.5 [10]

Ti ến hành: Pha loãng dịch chiết enzyme đến khi đạt nồng độ thích hợp bằng

dung dịch đệm Thực hiện phản ứng với cơ chất là casein (dung dịch 1%) Chuẩn bị

3 ống nghiệm và sử dụng hóa chất như sau:

Ống cơ chất Ống chứng Ống thử