• Phân tích Anova trên phần mềm Excel 2007 để xác định sự khác nhau về kết quả giữa các phương pháp.
32
• Cách tính % tăng giảm về đường kính phân giải cơ chất của môi trường thử so với môi trường canh thang MT2.
(∆p%: % tăng giảm của môi trường thử so với môi trường canh thang MT2) ∆p% =
b b a−
x 100%
a = đường kính phân giải của môi trường thử có bổ sung các yếu tố dinh dưỡng.
b = đường kính phân giải của môi trường canh thang MT2.
Bảng 2.3: Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm
Giá trị Công thức Giá trị trung bình 𝑥̅ 𝑥̅ = 1 𝑛∑ 𝑥𝑛𝑖=1 𝑖 Độ lệch chuẩn SD SD =�𝑛−11 ∑𝑛 (𝑥𝑖− 𝑥���)2 𝑖=1
33
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto
Theo các nghiên cứu đã được công bố, trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có nhiều loại enzyme khác nhau [51],[60],[61],[62]. Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzyme, đặc biệt là các protease ngoại bào của B. subtilis natto.
Mục đích: Bước đầu khảo sát sự tồn tại của các enzyme trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
Tiến hành: Nuôi cấy B. subtilis natto trong 150 ml môi trường MT2 theo phương pháp được nêu ra trong mục c phần 2.3.1. Li tâm dịch lên men (4.000 vòng/20 phút) để thu riêng 100 ml phần dịch nổi hay dịch trong. Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của dịch trong theo các phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.4. Mẫu trắng là môi trường canh thang không cấy B. subtilis natto và được điều chỉnh pH tương đương với pH dịch trong. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto
Đường kính vòng phân giải casein
(mm)
Đường kính vòng phân giải tinh bột
(mm)
Đường kính vòng phân giải CMC
(mm)
Dịch trong trắng Mẫu Dịch trong trắng Mẫu Dịch trong trắng Mẫu
Trung bình 18,6 ± 0,3 (-) 16,1 ± 0,1 (-) 18,7 ± 0,3 (-)
Chú thích:
(+): Xuất hiện vòng phân giải cơ chất
(-): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.1 cho thấy dịch trong thu được từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có khả năng phân giải cơ chất casein, tinh bột và CMC. Mẫu trắng không cho vòng phân giải cơ chất do đó đã loại trừ được ảnh
34
hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon:
Mục đích: Tìm nguồn hydratcarbon thích hợp cho vi khuẩn B. subtilis natto
sinh ra nhiều enzyme protease nhất.
Tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn trong 150 ml môi trường canh thang MT2 và môi trường MT2 có bổ sung hydratcarbon glucose, saccharose, maltose, lactose với nồng độ 2%. Thử hoạt tính các enzyme của các dịch li tâm thu được từ các môi trường nuôi cấy trên như phương pháp mô tả ở phần 2.3.4. Thử hoạt tính tiêu fibrin của các dịch li tâm thu được từ các môi trường nuôi cấy trên như phương pháp mô tả ở mục a phần 2.3.7. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2, 3.3, 3.4.
Kết quả cho thấy rằng có sự khác nhau về đường kính phân giải casein của dịch lên men giữa các môi trường thử, điều này có nghĩa là khi tiến hành lên men với các môi trường bổ sung nguồn hydratcarbon khác nhau thì lượng enzyme protease tạo ra là khác nhau. Kết luận có ý nghĩa thống kê với pvalue < 0.05.
Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn
hydratcarbon khác nhau Mẫu thử Dp(mm) ∆p% MT2 17,5 ± 0,10 0% MT2 + 2% glucose 18,5 ± 0,06 5,7% MT2 + 2% saccharose 17,6 ± 0,10 0,6% MT2 + 2% maltose 19,2 ± 0,06 9,7% MT2 + 2% lactose 17,7 ± 0,1 1,1% Ghi chú:
Dp: đường kính vòng phân giải casein trung bình;
35
Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn
hydratcarbon khác nhau
Mẫu thử Amylase Cellulase
Da (mm) ∆a% Dc (mm) ∆c% MT2 16,1 0% 18,7 0% MT2 + 2% glucose 19,3 19,9% 18,8 0,5% MT2 + 2% saccharose 19,1 18,6% 19,5 4,3% MT2 + 2% maltose 17,9 11,2% 17,1 – 8,5% MT2 + 2% lactose 16,8 4,3% 19,0 1,6% Ghi chú:
Da,Dc: đường kính vòng phân giải tinh bột, CMC trung bình;
∆a%, ∆c%: % tăng giảm Da,Dc so với MT2
Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon đến hoạt tính
enzyme của vi khuẩn
(Ghi chú: C: môi trường canh thang, G, S, M, L: môi trường canh thang theo thứ tự bổ sung
glucose, saccharose, maltose, lactose)
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.2, bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 cho thấy: khi bổ sung hydratcarbon vào môi trường MT2 đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC đều tăng, nghĩa là hoạt tính các enzyme protease, amylase, cellulase đều tăng. Tuy nhiên khi so sánh mức độ tăng giữa các nguồn hydratcarbon khác nhau thì thấy
0 5 10 15 20 25
Protease Amylase Cellulase
% C S L G M
36
bổ sung maltose cho kích thước vòng phân giải casein lớn nhất (19,2 mm), cao hơn 9,7% so với môi trường MT2 nghĩa là làm tăng khả năng tiết enzyme protease; đồng thời bổ sung maltose lại có tác dụng làm giảm enzyme cellulase, thể hiện ở kích thước vòng phân giải CMC nhỏ nhất, nhỏ hơn 8,5% so với môi trường MT2 và kích thước vòng phân giải tinh bột tăng nhưng không nhiều (11,2%) nên khả năng tiết amylase tăng ít.
Như vậy, việc bổ sung maltose vào môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có tác dụng làm tăng khả năng tiết protease so với môi trường MT2. Tuy nhiên, chưa khẳng định được lượng protease tăng lên này có làm khả năng tiêu fibrin hay không. Vì thế, thí nghiệm tiếp theo nhằm khảo sát khả năng tiêu fibrin giữa dịch lên men B. subtilis natto của môi trường MT2 so với các môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau. Tiến hành theo phương pháp nêu ở mục a phần 2.3.7. Kết quả thời gian tiêu fibrin của các môi trường như sau:
Bảng 3.4: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường Thời gian tiêu fibrin (phút)
MT2 > 300
MT2 + 2% lactose >300
MT2 + 2% saccharose 250
MT2 + 2% glucose 230
MT2 + 2% maltose 210
Nhận xét:Kết quả ở bảng 3.4cho thấy thời gian tiêu fibrin tăng dần theo thứ tự: MT2 + 2% maltose < MT2 + 2% glucose < MT2+ 2% saccharose < MT2 + 2% lactose, MT2. Như vậy, bổ sung maltose vào môi trường canh thang giúp vi khuẩn sinh nhiều enzyme tiêu fibrin (có thể là Nattokinase) hơn.
3.1.3. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất
Mục đích: Khảo sát để tìm ra nồng độ maltose cho vi khuẩn sinh nhiều protease và sinh ít các enzyme khác.
Tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis natto trên 150 ml môi trường MT2 có bổ sung các nồng độ maltose khác nhau: 2%, 4%, 6%, 8% theo phương pháp mô
37
tả ở mục c phần 2.3.1. Thử hoạt tính enzyme trên cơ chất casein như mô tả ở phần
2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5, 3.6.
Kết quả cho thấy đường kính phân giải casein của dịch lên men khi nuôi cấy trong MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau là khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi nuôi cấy
trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau
Môi trường Dp(mm) ∆p1% MT2 + 2% maltose 18,0 ± 0,06 0% MT2 + 4% maltose 16,7 ± 0,06 - 7,2% MT2 + 6% maltose 17,1 ± 0,12 - 5% MT2 + 8% maltose 18.2 ± 0,12 1,1% Ghi chú:
Dp: đường kính vòng phân giải casein trung bình;
∆p1%: % tăng giảm Dpso với MT2 bổ sung 2% maltose
Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau
Môi trường Amylase (mm) Cellulase (mm)
Da (mm) ∆a1 Dc (mm) ∆a2 MT2 + 2% maltose 13,3 0% 12,0 0% MT2 + 4% maltose 12,3 7,5% 12,0 0% MT2 + 6% maltose 11,2 - 15,8% 11,2 – 6,7% MT2 + 8% maltose 13,3 0% 12,5 + 4,2% Ghi chú:
Da,Dc: đường kính vòng phân giải tinh bột, CMC trung bình;
∆a1%, ∆c1%: % tăng giảm Da,Dc so với MT2 bổ sung 2% maltose
Nhận xét:
+ Các kết quả trong bảng 3.5, 3.6 cho thấy kích thước vòng phân giải casein của môi trường MT2 có bổ sung nồng độ maltose 2% và 8% lớn nhất (lần lượt 18,0 mm và 18,2 mm). Tuy nhiên, nồng độ maltose 8% cho đường kính vòng phân giải casein chỉ lớn hơn 1,1% so với nồng độ maltose 2%.
38
+ Về kích thước vòng phân giải tinh bột và CMC ta thấy với nồng độ maltose bổ sung vào MT2 là 6% thì vòng phân giải tinh bột và CMC có đường kính nhỏ nhất. Nồng độ maltose 6% cho đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC nhỏ hơn lần lượt là 15,8% và 6,7% so với nồng độ maltose 2%. Nồng độ maltose 8% cho đường kính vòng phân giải CMC và tinh bột lớn hơn hoặc bằng nồng độ 2%.
Vì thế, kết hợp giữa mục đích làm tăng lượng protease và hạn chế sinh enzyme khác, nồng độ maltose 2% được lựa chọn bổ sung vào môi trường canh thang.
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng lên khả năng tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
enzyme của vi khuẩn B. subtilis natto
Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis natto trong các môi trường: 150 ml MT2, 150 ml môi trường MT2 bổ sung 2% đậu tương lần lượt ở dạng hạt và dạng bột, 150 ml MT2 bổ sung casein với nồng độ 0,5%. Điều kiện nuôi cấy như phương pháp mô tả ở mục c phần 2.3.1. Thử hoạt tính các enzyme như mô tả ở phần 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Các kết quả trong bảng 3.7 cho thấy có sự khác nhau về đường kính phân giải cơ chất của dịch lên men trong MT2 và MT2 có bổ sung đậu tương và casein với p <0,05.
Bảng 3.7: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy
trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và casein
Mẫu thử
Đường kính vòng phân giải cơ chất (mm)
Protease Amylase Cellulase
Dp (mm) ∆p2% Da (mm) ∆a2% Dc (mm) ∆c2% MT2 18,0 ± 0,1 0% 17,9 0% 18,1 0% MT2 + 2% đậu hạt 21,1 ± 0,06 17,2% 20,3 13,4% 22,3 23,2% MT2 + 2% bột đậu 22,5 ± 0,12 25,0% 20,8 16,2% 22,5 24,3% MT2 + 0,5% casein 22,8 ± 0,12 26,7% 18,9 5,6% 18,4 1,6% Ghi chú:
39
Dp,Da,Dc: lần lượt là đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC trung bình;
∆p2%, ∆a2%, ∆c2%: % tăng Dp,Da,Dcso với MT2
Nhận xét:
+ Khi bổ sung đậu tương ở dạng hạt và dạng bột vào môi trường canh thang thì đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC đều tăng, nghĩa là hoạt tính tất cả các enzyme đều tăng so với môi trường MT2 (13,4% - 25%), trong đó bổ sung bột đậu sẽ cho đường kính vòng phân giải casein lớn hơn bổ sung đậu tương dạng hạt (25% so với 17,2%). Đặc biệt, việc bổ sung casein cho đường kính vòng phân giải casein lớn hơn cả hai dạng đậu (tăng 26,7% so với MT2).
+ Bên cạnh đó, bổ sung đậu tương lại làm cho đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC tăng lên khá nhiều (13,4% - 24,3%) còn bổ sung casein thì đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC tăng không đáng kể (lần lượt là 5,6% và 1,6%).
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ
Tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis natto trên 150 ml MT2, MT2 bổ sung một số muối vô cơ theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1. Thử hoạt tính các enzyme protease, amylase, cellulase theo phương pháp mô tả ở phần 2.3.4. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 bổ sung một số muối vô cơ
Mẫu thử Protease Đường kính vòng phân giải cơ chất (mm) Amylase Cellulase
Dp ∆p3% Da ∆a3% Dc ∆c3% MT2 18,5 ± 0,21 0% 17,6 0% 18,1 0% MT2 + 0,05%CaCl2 21,3 ± 0,25 15,1% 18,7 6,2% 18,4 1,6% MT2 + 0,05%MgSO4 20,7 ± 0,15 11,9% 19,5 10,8% 19,1 5,5% MT2 + 0,05% MnCl2 19,8 ± 0,25 7,0% 20,5 16,5% 18,9 4,4%% Ghi chú:
∆p3%,∆a3%, ∆c3%: % tăng Dp,Da,Dcso với MT2
Nhận xét: Số liệu ở bảng 3.8 cho thấy khi bổ sung CaCl2, MgSO4, MnCl2 với lượng 0,05% vào môi trường canh thang thì dịch nuôi cấy có đường kính vòng phân
40
giải casein, tinh bột, CMC đều tăng nghĩa là hoạt tính tất cả các enzyme đều tăng, trong đó bổ sung CaCl2 thì đường kính vòng phân giải casein lớn nhất (tăng 15,1% so với MT2) và đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC tăng thấp nhất so với MT2 (tăng lần lượt là 6,2% và 1,6%). Vì thế CaCl2 được lựa chọn làm muối vô cơ bổ sung vào môi trường.
3.1.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn B.
subtilis natto trên môi trường kết hợp
Qua các khảo sát đã tiến hành, lựa chọn các thành phần bổ sung vào môi trường MT2 giúp vi khuẩn B. subtilis natto sinh ra nhiều protease và giảm các enzyme amylase, cellulase gồm những thành phần như sau:
- Cao thịt: 0,5% - Pepton: 1% - NaCl: 0,5% - Maltose: 2% - Casein: 0,5% - CaCl2: 0,05%
- Nước máy vừa đủ: 100 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis natto trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp theo như phương pháp lên men chìm mô tả ở mục 2.3.1. Thử hoạt tính các enzyme của dịch li tâm thu được từ các môi trường nuôi cấy trên theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.4. Thử hoạt tính tiêu fibrin của các dịch li tâm thu được theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.7. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9, 3.10
Bảng 3.9: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
Mẫu thử Protease Đường kính vòng phân giải cơ chất (mm) Amylase Cellulase
Dp ∆p4% Da ∆a4% Dc ∆c4%
MT2 17,5 0% 17,6 0% 18,1 0%
Môi trường kết hợp 21,3 21,7% 18,7 6,25% 18,4 1,66%
Ghi chú:
∆p4%, ∆a4%, ∆c4%: lần lượt là% tăng giảm Dp,Da,Dc của môi trường kết hợp so với MT2
Nhận xét: Số liệu ở bảng 3.9 cho thấy môi trường kết hợp có đường kính vòng phân giải casein lớn hơn 21,7% so với môi trường MT2, trong khi đường kính
41
vòng phân giải tinh bột và CMC lớn hơn môi trường MT2 lần lượt là 6,25% và 1,66%. Như vậy, môi trường kết hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease đồng thời lượng amylase và cellulase tăng không đáng kể.
Bảng 3.10: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp
Môi trường Thời gian (phút)
MT2 >300
Môi trường kết hợp 180
Nhận xét: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men B. subtilis natto trong môi trường kết hợp là 180 phút, nhỏ hơn môi trường MT2 (trên 300 phút).
Như vậy, môi trường kết hợp có thể giúp tăng lượng enzyme đích protease so với môi trường canh thang, song khi so sánh với việc bổ sung từng thành phần dinh dưỡng riêng biệt thì kết quả vẫn chưa tương ứng.
3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được
Với mục đích lựa chọn phương pháp tách chiết enzyme đích là protease, để đơn giản hóa quy trình, môi trường nuôi cấy được chọn là môi trường canh thang do môi trường này hay được sử dụng trong nuôi cấy B. subtilis và B. subtilis natto