a. Phương pháp trong ống nghiệm
Nguyên tắc: Nattokinase phân hủy fibrin ở dạng polyme không hòa tan tạo ra các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp, hòa tan.
Tiến hành:
+ Li tâm máu lợn khỏe mạnh đã được chống đông ở 1.500 vòng/phút trong 5 phút thu được huyết tương nghèo tiểu cầu, dùng ngay. Trong cốc có mỏ chuẩn bị: 50 ml dung dịch NaCl 0,9%, 1 ml dung dịch huyết tương nghèo tiểu cầu, 0,8 ml dung dịch CaCl2 0,1M. Khuấy kỹ cốc bằng đũa thủy tinh một đầu đã mài ráp. Để cốc có đũa thủy tinh cắm ở trong vào tủ ấm 2 - 3 giờ ở 370
C. Sau đó đổ thêm vào cốc khoảng 20 ml dung dịch NaCl 0,9% cho cục fibrin tách ra, ấn nhẹ đũa thủy tinh vào thành cốc, vừa ấn vừa cuộn cho fibrin bám vào thành đũa thành một màng mỏng. Rửa màng fibrin dính ở đầu đũa bằng dung dịch NaCl 0,9% và bằng nước cất.
+ Thử khả năng tiêu fibrin: Cắm đũa thủy tinh có fibrin bám vào ống nghiệm chứa 10 ml dung dịch thử rồi đặt vào tủ ấm ở 370
C. Xác định thời gian để màng fibrin ở đũa thủy tinh tan hoàn toàn.
+ Áp dụng cho trường hợp dịch enzyme đem thử có thể tích > 10 ml.
b. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Nguyên tắc: Nattokinase có khả năng phân giải fibrin. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, tiến hành thử khả năng phân giải fibrin bằngcách tạo ra môi trường thử: thạch – fibrin; với mục đích sơ bộ xác định
31
sự có mặt của Nattokinase trong mẫu nghiên cứu sau khi đã có kết quả trọng lượng phân tử của protein enzyme. Thời điểm phối hợp fibrin với môi trường thạch là khi môi trường thạch đạt nhiệt độ 450C để tránh làm phân hủy fibrin. [46]
Tiến hành:
+ Đông khô màng fibrin trong mục a ở nhiệt độ – 550
C, áp suất 0,055 mBar. Cân khoảng 1,5 g fibrin đông khô. Nghiền fibrin trong chày cối sứ, thêm nước vừa đủ 20 ml theo nguyên tắc đồng lượng thu được hỗn dịch fibrin trong nước
+ Cân 2,0 g thạch, phân tán thạch vào trong 80 ml nước. Đun cho thạch tan hết. Để nguội đến nhiệt độ 450C thu được dung dịch thạch.
+ Thêm dần dần dung dịch thạch vào 20 ml hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng. Cốc đựng hỗn dịch fibrin được đặt trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút để đảm bảo phân tán đồng nhất thạch và fibrin. Sau khi tạo thành, hỗn dịch thạch – fibrin được đổ vào các đĩa petri đã chuẩn bị từ trước. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/18 giờ. Tiến hành với các mẫu sau:
• Hai mẫu đối chứng: Nattospes; Nattokinase
+ Chuẩn bị mẫu chứng Nattospes: Lấy hết phần bột trong nang Nattospes, bỏ vỏ nang. Phần bột được hòa vào 5 ml dung dịch đệm phosphat pH = 7,6. Lọc bỏ phần cắn không tan, thu phần dịch trong. Phần dịch trong là mẫu chứng Nattospes có hàm lượng 300 FU/5 ml.
+ Chuẩn bị mẫu chứng Nattokinase: Hòa tan 1g Nattokinase trong 5 ml dung dịch đệm thu được mẫu chứng Nattokinase có hàm lượng 20.000 FU/5 ml.
• Ba mẫu thử: dịch trong (từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto); dịch enzyme 60% (kết tủa với amoni sulfat 60% bão hòa); phân đoạn 10 (tinh chế dịch enzyme 60% bằng sắc kí lọc gel Sephadex G – 75).
• Ba mẫu trắng: nước cất; đệm phosphat pH = 7,6; NaCl 0,9%.
• Quan sát vòng phân giải fibrin trên đĩa thạch [46]