Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzyme, tính tan của protein enzyme tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out) ở nồng độ muối cao. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzyme dẫn đến sự tủa. [16]
Dịch nuôi cấy
B. subtilis natto
Dịch nổi 1
Dịch chiết chứa enzyme thô
Tủa enzyme thô
Phân đoạn enzyme Enzyme protease Li tâm 4000 vòng/phút x 20 phút Sinh khối Kết tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 các nồng độ hoặc dung môi hữu cơ
Dịch nổi 2 Li tâm 15.000 vòng/phút
x 20 phút ở 40 C
Sơ bộ tinh chế enzyme bằng sắc kí lọc gel Sephadex G - 75
Sơ bộ xác định enzyme thu được bằng điện di phương pháp SDS - PAGE
25
Tiến hành:
a. Khảo sát nồng độ amoni sulfat sử dụng để kết tủa enzyme
Dịch chiết enzyme thô được giữ ở nhiệt độ 40
C/1 giờ. Thêm dần dần amoni sulfat vào 100 ml dịch chiết enzyme thô đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa theo yêu cầu. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm dịch chiết với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để thu riêng tủa enzyme. Hòa tan tủa enzyme vào 1 ml dung dịch đệm thu được dịch enzyme. [14],[51]
b. Kết tủa phân đoạn protein enzyme
Ở nồng độ amoni sulfat bão hòa đầu tiên, tiến hành tương tự như trên. Sau khi li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng tủa enzyme; phần dịch còn lại được thêm dần dần amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ hai. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng phần tủa và dịch. Phần tủa được hòa tan vào 1 ml dung dịch đệm. Phần dịch lại được thêm amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ ba. Lặp lại các bước cho đến nồng độ amoni sulfat bão hòa cuối cùng. [51]
Cách pha nồng độ amoni sulfat bão hòa theo phụ lục 2.
2.3.3.2. Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (aceton hay ethanol
96%)
Nguyên tắc: Khi cho dung môi hữu cơ vào trong môi trường có chứa protein enzyme thì hằng số điện môi của môi trường giảm, các phân tử nước xung quanh bề mặt enzyme được thay thế bằng các phân tử của dung môi hữu cơ, khả năng hòa tan của protein enzyme giảm nên dẫn đến sự kết tủa [5],[10]
Tiến hành:
+ Làm lạnh dung dịch enzyme đến 4 – 50
C và dung môi (aceton hoặc ethanol 96%) tới – 40
C.
+ Trộn dung môi hữu cơ với dung dịch enzyme với tỉ lệ 3:1. Để yên 1 ngày ở 4 – 50C. Gạn bớt dung môi hữu cơ.
+ Li tâm, thu được dịch li tâm và kết tủa. Để kết tủa ở nhiệt độ phòng 30 phút cho bay hơi bớt dung môi hữu cơ. Tủa được hòa tan vào 1 ml dung dịch đệm thu được
26
dung dịch enzyme. [6],[49].
2.3.3.3. Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc kí lọc gel Sephadex G -75
Nguyên tắc: Khi nạp mẫu vào cột sắc kí có pha tĩnh là các hạt gel xốp; các phân tử mẫu có kích thước lớn hơn kích thước của lỗ gel sẽ đi vào khoảng trống giữa các hạt gel và ra khỏi cột trước. Các phân tử có kích thước nhỏ khuếch tán tối đa vào trong các hạt gel và ra khỏi cột sau. [10],[16],[40]
Tiến hành:
Ngâm 1g gel Sephadex G –75 trong dung dịch đệm trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Nhồi cột gel. Cho dung dịch đệm chảy qua cột có đường kính 1 cm với tốc độ khoảng 7 ml/giờ trong vài giờ để ổn định cột.
Mẫu cần tinh chế loại muối được hòa tan hoàn toàn trong 1ml dung dịch đệm và đưa vào cột. Chờ 30 phút để mẫu ngấm hết xuống. Thêm dung dịch đệm vào cột và thu mỗi phân đoạn 1 ml. Đánh giá sơ bộ quá trình lọc gel kết thúc: Cho dung dịch chảy ra từ cột phản ứng với dung dịch BaCl2, nếu tạo thành tủa trắng không tan trong dung dịch HCl loãng thì quá trình lọc gel kết thúc. Rửa cột bằng dung dịch đệm trong khoảng 3 giờ. [10],[16]
2.3.4. Phương pháp sơ bộ định tính các nhóm enzyme trong dịch lên men
Protease tổng bao gồm Nattokinase và các protease khác, nếu hoạt tính protease tổng cao thì hoạt tính Nattokinase cũng có khả năng cao. Do hóa chất phân tích Nattokinase rất đắt tiền, nên ở đây chúng tôi gián tiếp định tính và định lượng Nattokinase thông qua định tính, định lượng protease và khả năng tiêu fibrin của protease.
a. Phương pháp sơ bộ định tính protease
Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch. [5]
Tiến hành:
Pha 100 ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có mỏ 200 ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ và đọc kết quả.
27
b. Phương pháp sơ bộ định tính amylase
Nguyên tắc: Amylase có khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid và đường đơn không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2). Dùng tinh bột làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính amylase có trong dịch chiết enzyme. [5]
Tiến hành:
Pha 100 ml dung dịch chứa 1% tinh bột và 2% thạch trong cốc có mỏ 200 ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ. Dùng Lugol láng lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải tinh bột.
c. Phương pháp sơ bộ định tính cellulase
Nguyên tắc: Cellulase có khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I2). Dùng CMC làm cơ chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính cellulase có trong dịch chiết enzyme. [5]
Tiến hành:
Pha 100 ml dung dịch chứa 0,5% CMC và 2% thạch trong cốc có mỏ 200 ml, đun cho đồng nhất. Đổ 16 ml dung dịch trên vào các đĩa petri có đường kính 90 mm. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ. Dùng Lugol láng lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải CMC.
2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease
a. Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein
Nguyên tắc:
Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++
trong môi trường kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độ đậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử. [10]
28
Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm có pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau:
Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 Dung dịch đệm (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1,0 Nồng độ protein (mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch ở bước sóng thích hợp. Từ kết quả đo quang dựng biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ protein C (mg/ml) – mật độ quang D.
Đo quang phổ hấp thụ của dung dịch thử, dựa vào biểu đồ mẫu (phương trình, hệ số Ktb) để xác định nồng độ protein.
Cách tính kết quả:
Hệ số protein Ki: Ki = Nồng độ protein/Mật độ quang. Hệ số trung bình Ktb:Ktb =∑ Ki/n
(n: tổng số mẫu chuẩn; với thí nghiệm trên n = 10)
Nồng độ protein C: C = Ktb x D
b. Xác định hoạt độ protease
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của enzyme, một phần protein bị thủy phân, giải phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic. Phần protein còn lại sau phản ứng bị tủa trong acid tricloroacetic. Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret như mục a phần 2.3.5.[10]
Tiến hành: Pha loãng dịch chiết enzyme đến khi đạt nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm. Thực hiện phản ứng với cơ chất là casein (dung dịch 1%). Chuẩn bị 3 ống nghiệm và sử dụng hóa chất như sau:
29
Casein 1% (ml) 1 0 1
Đệm pH = 7,6 (ml) 1 1 1
Dung dịch thử (ml) 0 1 1
Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370
C/1 giờ cho phản ứng xảy ra. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 3 ml dung dịch tricloroacetic 10% để ngừng phản ứng. Lắc đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 4.000 vòng/10 phút để thu tủa. Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và tiến hành phản ứng Biuret. [10]
Cách tính kết quả:
+ Dựa trên biểu đồ mẫu, tính ra lượng casein bị thủy phân P = P1 + P2 – P3
Trong đó: P1 là lượng protein trong ống cơ chất (mg) P2 là lượng protein trong ống chứng (mg) P3 là lượng protein trong ống thử (mg)
Hoạt độ enzyme hay đơn vị đo mức độ phân giải protein của chế phẩm enzyme được dùng là nanoKatal (nKat): 1 nKat = 10-9
Kat. [29]
+ Mức độ phân giải protein (MDP) được tính theo công thức:
MDP =P. B. L. 10M. m. T6(nKat)
Trong đó: P là lượng protein (mg) bị thủy phân (tính theo biểu đồ mẫu) B là độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzyme
M là trọng lượng phân tử gam của protein (của casein là 23.600) L là số liên kết peptid của phân tử protein (của casein là 209) T là thời gian thủy phân (3.600 giây)
m là lượng chế phẩm enzyme dùng thử nghiệm (ml hay mg)
2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE
Nguyên tắc: Trong môi trường pH khác pI của protein, protein sẽ tích điện trên bề mặt và chuyển dịch về phía điện cực trái dấu khi có dòng điện chạy qua, protein tích điện càng lớn sẽ di chuyển càng nhanh trong điện trường và ngược lại.
30
Nhờ đó có thể phân tách riêng biệt các protein có trọng lượng phân tử khác nhau bằng phương pháp điện di. [16]
Tiến hành: Các mẫu (dịch enzyme chiết ở nồng độ (NH4)2SO4 60% bão hòa và phân đoạn 10 sau tinh chế) được tải vào các giếng trên bản gel polyacrylamid, đặt trong đệm thích hợp. Đặt dòng điện một chiều với hiệu điện thế phù hợp vào, các protein tích điện âm sẽ dịch chuyển qua gel với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của chúng. Sau điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm Comasii. Các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel.
2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin
a. Phương pháp trong ống nghiệm
Nguyên tắc: Nattokinase phân hủy fibrin ở dạng polyme không hòa tan tạo ra các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp, hòa tan.
Tiến hành:
+ Li tâm máu lợn khỏe mạnh đã được chống đông ở 1.500 vòng/phút trong 5 phút thu được huyết tương nghèo tiểu cầu, dùng ngay. Trong cốc có mỏ chuẩn bị: 50 ml dung dịch NaCl 0,9%, 1 ml dung dịch huyết tương nghèo tiểu cầu, 0,8 ml dung dịch CaCl2 0,1M. Khuấy kỹ cốc bằng đũa thủy tinh một đầu đã mài ráp. Để cốc có đũa thủy tinh cắm ở trong vào tủ ấm 2 - 3 giờ ở 370
C. Sau đó đổ thêm vào cốc khoảng 20 ml dung dịch NaCl 0,9% cho cục fibrin tách ra, ấn nhẹ đũa thủy tinh vào thành cốc, vừa ấn vừa cuộn cho fibrin bám vào thành đũa thành một màng mỏng. Rửa màng fibrin dính ở đầu đũa bằng dung dịch NaCl 0,9% và bằng nước cất.
+ Thử khả năng tiêu fibrin: Cắm đũa thủy tinh có fibrin bám vào ống nghiệm chứa 10 ml dung dịch thử rồi đặt vào tủ ấm ở 370
C. Xác định thời gian để màng fibrin ở đũa thủy tinh tan hoàn toàn.
+ Áp dụng cho trường hợp dịch enzyme đem thử có thể tích > 10 ml.
b. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Nguyên tắc: Nattokinase có khả năng phân giải fibrin. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, tiến hành thử khả năng phân giải fibrin bằngcách tạo ra môi trường thử: thạch – fibrin; với mục đích sơ bộ xác định
31
sự có mặt của Nattokinase trong mẫu nghiên cứu sau khi đã có kết quả trọng lượng phân tử của protein enzyme. Thời điểm phối hợp fibrin với môi trường thạch là khi môi trường thạch đạt nhiệt độ 450C để tránh làm phân hủy fibrin. [46]
Tiến hành:
+ Đông khô màng fibrin trong mục a ở nhiệt độ – 550
C, áp suất 0,055 mBar. Cân khoảng 1,5 g fibrin đông khô. Nghiền fibrin trong chày cối sứ, thêm nước vừa đủ 20 ml theo nguyên tắc đồng lượng thu được hỗn dịch fibrin trong nước
+ Cân 2,0 g thạch, phân tán thạch vào trong 80 ml nước. Đun cho thạch tan hết. Để nguội đến nhiệt độ 450C thu được dung dịch thạch.
+ Thêm dần dần dung dịch thạch vào 20 ml hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng. Cốc đựng hỗn dịch fibrin được đặt trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút để đảm bảo phân tán đồng nhất thạch và fibrin. Sau khi tạo thành, hỗn dịch thạch – fibrin được đổ vào các đĩa petri đã chuẩn bị từ trước. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6 cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/18 giờ. Tiến hành với các mẫu sau:
• Hai mẫu đối chứng: Nattospes; Nattokinase
+ Chuẩn bị mẫu chứng Nattospes: Lấy hết phần bột trong nang Nattospes, bỏ vỏ nang. Phần bột được hòa vào 5 ml dung dịch đệm phosphat pH = 7,6. Lọc bỏ phần cắn không tan, thu phần dịch trong. Phần dịch trong là mẫu chứng Nattospes có hàm lượng 300 FU/5 ml.
+ Chuẩn bị mẫu chứng Nattokinase: Hòa tan 1g Nattokinase trong 5 ml dung dịch đệm thu được mẫu chứng Nattokinase có hàm lượng 20.000 FU/5 ml.
• Ba mẫu thử: dịch trong (từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto); dịch enzyme 60% (kết tủa với amoni sulfat 60% bão hòa); phân đoạn 10 (tinh chế dịch enzyme 60% bằng sắc kí lọc gel Sephadex G – 75).
• Ba mẫu trắng: nước cất; đệm phosphat pH = 7,6; NaCl 0,9%.
• Quan sát vòng phân giải fibrin trên đĩa thạch [46]
2.3.8. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm
• Phân tích Anova trên phần mềm Excel 2007 để xác định sự khác nhau về kết quả giữa các phương pháp.
32
• Cách tính % tăng giảm về đường kính phân giải cơ chất của môi trường thử so với môi trường canh thang MT2.
(∆p%: % tăng giảm của môi trường thử so với môi trường canh thang MT2) ∆p% =
b b a−
x 100%
a = đường kính phân giải của môi trường thử có bổ sung các yếu tố dinh dưỡng.
b = đường kính phân giải của môi trường canh thang MT2.
Bảng 2.3: Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm
Giá trị Công thức Giá trị trung bình 𝑥̅ 𝑥̅ = 1 𝑛∑ 𝑥𝑛𝑖=1 𝑖 Độ lệch chuẩn SD SD =�𝑛−11 ∑𝑛 (𝑥𝑖− 𝑥���)2 𝑖=1
33
Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto
Theo các nghiên cứu đã được công bố, trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có nhiều loại enzyme khác nhau [51],[60],[61],[62]. Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzyme, đặc biệt là các protease ngoại bào của B. subtilis natto.
Mục đích: Bước đầu khảo sát sự tồn tại của các enzyme trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
Tiến hành: Nuôi cấy B. subtilis natto trong 150 ml môi trường MT2 theo phương pháp được nêu ra trong mục c phần 2.3.1. Li tâm dịch lên men (4.000 vòng/20 phút) để thu riêng 100 ml phần dịch nổi hay dịch trong. Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của dịch trong theo các phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.4. Mẫu trắng là môi trường canh thang không cấy B. subtilis natto và được