Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn (lactobacillus rhamnosus GG

Trang 1

Se =— SSS —— ie

ee NGUYEN NGOC THOA

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NI CÁY VÀ CHIET TÁCH PEPTIDOGLYCAN TỪ VÁCH

TE BAO VI KHUAN Lactobacillus rhamnosus GG

=—==

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ KHÓA 59 (2004 — 2009) Người hướng dẫu : TS NGUYÊN THỊ LẬP

NNữỉ thực hiện :_ Bộ mơn Hố Sinh

Bộ mơn C'ông Nghiện Dược (Trường ĐH Được Hà Nội) Viện Công Nghệ Sinh Học

(Viện Khoa hoc va Cong nghé Viet Nam) : 07/2008 - 05/2009 _ Pama Đa,

Trang 2

LOI CAM ON

Trước hết, em xin bày tỏ lòng kinh trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới cô giảa TS Nguyễn Thị Lập, người thấy đã chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quỷ bảu cho em trang học tập, nghiên cửu cũng như Irong cuộc song

Em xin gui loi cam ơn chân thành tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân, thấy giáo Tha Lê Xn Hồnh đã ln nhiệt tình giún đữ va di hên cạnh em rong quả frìinh làm thực nghiệm

Em cũng xin trân trọng cảm ơn TS Quyên Dinh Thi va cde anh chị cong tác tại nhòng công nghệ sinh học enzym — Viện công nghệ sinh học đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khỏa luận của mình

Em xin cam ơn các chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Hóa Sinh và Bộ môn Công Nghiệp Dược đã hỗ trợ em trong quá trình làm thực nghiệm

Em xin cảm ơn Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo, các nhòng han và các thầy cã đã tạa mọi điều kiện và đìu dất em trong quả trình học tập tại Irưởng

và thực hiện kháa luận tất nghiệp

Cuối cùng, em xin dành lời cảm cm từ trái tìm mình tới gia đình và những người hạn thân thiết đã luận luân động viên, khích lệ em trong hoe tap, trong cuộc sống và hết lòng giúp đỡ em thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 3 năm 2009 Sinh viên

Trang 3

MUC LUC Trang bia phy Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình vẽ ieee

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN iygtcbiïldbeibabidiadsiobsscsodtuage 3

1.1 VIKHUAN Lactobacilius rhammosus GΠ2z sai

Bk Ec gio bu cà Biih ĐT uáacdctasaáuibeisiabidliciedgisoasase 3

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển .- 5< c<cesecrrrve 4

1.1.3 Phương pháp phân lập giông thuần, giữ giông, nhân giống 5

1.1.4 Phương pháp định tỉnh vi khuẩn 5Ä c1 1 11161135 6

1.1.5 Phương pháp định lượng vi khuẩn - 555cc ccsz+zcesce 7

1.1.6 Tae dung cua Lactobacillus rhamnosus trén lam sang va img dung9

1.2 Peptidogliycan và tác dụng kích thích miễn dịch 10

1.2.1 Đại cương về peptiđoglyCän - -sccccseccecssererrsxrersieee M1:

1.2.2 Phương pháp định tính peptidoglycan coi I]

1.2.3 Tác dụng vả cơ chẻ kích thích miễn dịch đã nghién ctru cia peptidoglycan 1 1

1.3 Các phương pháp chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuẩn 13

1.3.1 Vách t bảo vi khuẩn Gram dương - 5c sccsscscsccvcersseee 13 1.3.2 Những quy trình tỉnh sạch peptidoglycan đã được công bỏ trên thể BIO toan v00 40 gục tong 0020686/10)6001613016803u05u12288 ===5 14

CHƯƠNG LÍ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

Trang 4

ế> 4⁄5 MŨI HƯƠHH ME ca gá tuoi da ddioioc¿dk giïyktušg64G134G146640166600 5e 18

4 A TARY Ge REE aauncekooiiiicciSkoioiateniticakzxectusdi 19 2.2 PHUONG PHAP NGHIEN CU U.ssssccosssescssssossversncsosessssrrsssernsesovese „19

uc: 4.:Ê HƯƠIE Pháp lầm mỗi TOROS is soins esi cceennesnecdetencannitonccbcedenalareseiacee 19

2.2.2 Phương pháp phân lập giống thun 55c 55c lO)

2:24 Phưng: pháp BÌ HỒN iiáccáccá66cGeae0xeiobslSusgadilise 21

2.2.4.Phurong phap mhén giGmg cicessscsesesssverseesrseersesseaserseteaereneeseeenee22

2.2.5.Khao sat thời gian nuôi cây đẻ thu được sinh khối tôi đa 22

2.2.6.Khao sat pH môi trường nuỗi cấy để thu được sinh khối tối đa 23

2.2.7, Quy trinh chiét tach peptidoglycan tir vach tế bao vi khuan Lactobacillus R00 1 cau uy rời tt G6 UattùàGisad66002dsxsa 33 2.2.8 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE định tính peptidoglycan 24

CHUONG ITI KET QUA NGHIEN CUU VA BAN LUẬN 26

3.1 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU — 26

3.1.1 Thời gian nuôi cây đẻ thu được sinh khối tối đa 26

3.1.2 pH môi trường nuôi cấy dé thu được sinh khỏi tôi đa 27

3.1.3 Sinh khối thu được từ môi trường MRS (Merck) và MRS tự pha 28 3.1.4, Quy trình nuôi cấy tỗi ưu cho vi khuan Lactobacillus rhamnosus GG 29

3.1.5 Kết qua dinh tinh peptidoglycan chiết tách được 7Ô NT LH at xáidiakb goi kkkguagsyayanazezff 3.2.1 Quy trinh nudi cay Lactobacillus rhamnosus GG 32

3.2.2 Quy trình chiết tách peptidoglyean se 15

KT CƯ sissies ice a casei cs anaes a iba BE XUẤT e2 i ae i Nd tai ie hakiiatiini 40 TAI LIEU THAM KHAO

Trang 5

ATCC BCP C'WPs DNA DNase ELISA EDTA IgA IL-1-beta kDa LAGG MRS NAM NAG OD PCR PBS RNase SDS- PAGE TCA TNF-alpha DANH MUC CHU VIET TAT Acid amine American Type Culture Collection

Bromo cresol purple Cell wall proteins

Deoxinbonucleic Deoxiribonuclease

Enzym-linked immunosorbent assay Ethylen diamine tetra acetic acid Immunoglobin A

Interleukin-1-beta Kilo Dalton

Lactobacillus rhamnosus strain GG De Man, Rogosa and Sharpe

N-acetyl muramic N-acetylglucosamin Optical density

Polymerase chain reaction Phosphate- buffered Saline Ribonuclease

Sodium dodecyl sulfate

Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN

STT Tên hình TRANG

Hình ! Hinh thái vi khuẩn GG soi trực tiếp 3

Hinh 2 Hinh thai khuan lac L.GG +

Hình 3 Phan lap giéng thuan bằng phương pháp cấy ria 5 Hình4 Ba phương pháp định lượng vi khuẩn 8

Hinh 5 M6 hinh chudi polyme peptidoglycan 11

Hinh 6 Sơ đỗ cấu trúc vách tế bảo vi khuẩn Gram (+) 14

Hình 7 Đường cong sinh trưởng phát triển của vi khuẩn

L.GG nudéi cay bang MRS ty pha 26

Hinh 8 D6 thị tương quan giữa pH môi trường nuôi cay 28

và sinh khối tế bào

Hình 9 Đỏ thị tương quan giữa sinh khối thu được từ MRS (Merk)

va MRS tur pha 29

Hinh 10 Anh dién di peptidoglycan sau khi pha va

vach té bao 30

Hinh 11 Anh dién di peptidoglycan sau khi pha vo

Trang 7

DAT VAN DE

Nam 1986, tham hoa hạt nhân tôi tệ nhất trong lich sử xảy ra tại Chernobyl làm thiệt mạng hơn 20.000 người và nhiều nạn nhân khác bị

nhiễm phóng xạ đã phải chịu đựng những nỗi đau khôn lường về thể xác cũng như sự sống mong manh kéo dài nhiều ngảy Trong khi đó, vaccine va kháng sinh không có hiệu quả trong điều trị tình trạng suy giảm miễn dịch

nảy Do vậy, các nhà khoa học Nga đã tập trung nghiên cứu để tìm ra một

sản phẩm có tác dụng tăng cường hệ thông miễn dịch tự nhiên của cơ thẻ, an

toàn vả kinh tế

Ngảy nay trên thế giới, việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch

không đặc hiệu trong việc tăng cường và điều hòa hệ thống miễn địch của cơ thể ngày cảng trở nên phô biển Những chất kích thích miễn dich không đặc

hiệu nảy sẽ làm tăng sức để kháng của cơ thẻ, kích thích sản xuất kháng thé

đặc hiệu chống lại những tác nhân gây bệnh Do vậy, chúng được sử dụng

nhiễu trong phỏng và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến miễn địch như suy giảm miễn dịch, dị ứng và ung thư Một trong những chất rất được quan tâm phát triển hiện nay là Delta Immune ban chat la peptidoglycan cé trong vách tế bảo Lactohacillus rhamnosus GG, Đề góp phần phát triển, nghiên

cứu, ứng dụng peptidoglycan trong điều trị, chúng tôi đã thực hiện khóa luận

tốt nghiện: “Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và chiết tách peptidoglycan

Trang 8

1 Nghién ctru va x4y dumg quy trinh nudi cay téi wu vi khuan Lactobacillus

rhamnosus GG

2 Xây dựng quy trình chiết tách và định tính được peptidoglycan từ vách tế

Trang 9

CHUONG I: TONG QUAN

1.1 VI KHUAN Lactobacillus rhamnosus GG

1.1.1 Nguồn gốc và hình thái

Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) hay còn có tên gọi khác là Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 là một dòng của loài vi khuẩn có ích,

sinh acid lactic Lactobacillus rhamnosus, thugc chi Lactobacillus, ho

Lactobacilaceae [12] Nam 1983, hai nhà khoa học người Phần Lan

Sherwood Gorbach và Barry Goldin đã chiết tách thành công vi khuẩn này ra từ ruột của những người khỏe mạnh [46]

Về đặc điểm hình thái, 1.GG là trực khuẩn Gram đương, dưới vật kính dầu 100% có hình que đài thanh mảnh, màu nâu, kích thước tế bào khoảng

0.7-1.1 x 2.0-4.0 n¡m, không có khả năng di động (hình 1) Trong phương

pháp nhuộm Gram L.GG bat mau tim [10]

Hình 1 Hình thái vi khuẩn L.GG soi trực tiếp

Ngồi ra, khi ni cấy /.GG trên đĩa thạch petri thu được những khuẩn

lạc to, hình dạng trông giỗng như hạt vừng, bẻ mặt nhẫn, màu trắng sữa, đục

Trang 10

Hình 2 Hình thái khuẩn lạc L.GG [4] 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Laetabaeillus rhamnosus GG có nhu cầu dinh dưỡng rất lớn Nhu cầu

vé carbon duge cung cap tir glucose, Nhu cau về các hợp chất nitrogen chủ

yếu là từ cao thịt, cao nắm men và peptone Nhu cầu về chất khoáng và các nguyên tô vi lượng gồm muối kalihydrophosphat, diamonium hydrogen citrate và natri acetafe, ion magie và mangan [8] Vì vậy, môi trường chuẩn

và thích hợp nhất để tăng sinh, giữ giống và chiết tách thành phần từ vi

khuân thuộc chỉ Ứactobacillus là môi trường De Man Rogosa Sharpe (MRS) [29]

Vẻ hỗ hắp, L.GG là vi khuẩn ky khí [31]; có khả năng tôn tại trong một khoảng phân bế nhiệt độ khá rộng là 2-52°C, tuy nhiên nhiệt độ phát triển tối

uu la 37°C [5] Do vay điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn này là tủ ẩm 37C

có bố sung 5% CO,

Lactobacilius là những vì khuẩn sinh acid lactic do vậy làm giảm pH của môi trường và làm đổi màu chỉ thị từ màu tím pH trung tính sang màu vàng ở pH acid trên môi trường Bromo Cresol Purple (BCP) Chúng có khả năng tên tại trong một khoảng pH acid thấp (3- 4,5), phát triển tốt trong

khoảng pH từ 5 đến 7 [5], [14], tuy nhiên pH thích hợp nhất là 6,2 [31]

L.GG phat triển theo quy luật hàm số mũ sau 18 giờ, ngừng lại sau 24

Trang 11

log (pha lũy thừa) phát triển năng động nhất trong khoảng thời gian từ 5-18

giờ Pha dừng hay pha ỗn định là pha sinh khối tế bảo không tăng thêm nữa từ 18-24 giờ Cuỗi cùng là pha suy tàn từ 24-45 giờ [31]

1.1.3 Phương pháp phân lập giống thuần, giữ giống, nhân giống

Phân lập giống thuần là phương pháp tạo ra vi sinh vật thuần khiết phát triển từ một tế bào ban đầu riêng biệt Để đạt được mục đích đó người ta tạo

ra các khuẩn lạc riêng rẽ bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy

ria Đây là hai phương pháp thông dụng nhất do Koch nêu ra Trong phương

pháp pha loãng, đầu tiên pha loãng mẫu cần phân lập bằng nước muỗi sinh lý vô trùng để cho số lượng của chúng ít đi do đó các khuẩn lạc sẽ mọc tách

rời nhau ra Phương pháp cấy ria được minh họa trong hình 3, khuẩn lạc riêng rẽ ở vị trí số 4 sẽ được lấy ra, tăng sinh trong môi trường MRS lỏng để tạo các ampul giống Khi cấy xong, đem ủ trong tủ ấm 37C, lật ngược đĩa petri đáy lên trên và nắn ở đưới Sau thời gian cần thiết sẽ thu được khuẩn

lạc riêng rễ [8]

Hình 3 Phân lập giống thuần bằng phương pháp cấy ria [$]

Giữ giống là một khâu quan trọng để đảm bảo chất lượng và tính én

định của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong một thời gian dài Đối với vi

Trang 12

như sau: ống nghiệm được đồ khoảng 2/3 môi trường MRS thạch, tiệt trùng ở 121C trong 135 phút, sau đó trong tủ cây vô trùng đâm sâu que cấy có vi khuẩn dọc theo ông thạch cho đến tận đáy Tùy theo yêu cầu có thể đâm từ I-3 đường [8] Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp sẽ thu được khuẩn lạc hình que, thanh mảnh, màu nâu sắm nhưng ngăn hơn khuẩn lạc trên đĩa

petri Phuong pháp nảy có thể giữ giống trong vòng từ 1,5- 2 tháng nếu bảo quản ở 4°C Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học, dong kho

trở thành phương pháp phố biến để bảo quản vỉ sinh vật Thời gian bảo quản

khoảng 6 tháng [4]

Đề thu được nhiều sinh khối tế bảo, vĩ khuẩn được tăng sinh trong mỗi

trường MRS lỏng (MRS broth) Trước tiên, giỗng thuận khiết trong các ampul được lẫy ra một cách cẩn thận và cây truyền sang môi trường MRS lỏng để hoạt hóa lại, sau đó nuôi cấy trong điều kiện thích hợp băng cách bỏ sung mỗi trường liên tiếp sau mỗi chu kì phát triển Phương pháp bán liên

tục nảy đã được sử dụng rất nhiêu đề thu sinh khối nắm men phục vụ trong

công nghiệp [7] [8], [29]

1.1.4 Phương pháp định tính vi khuẩn

Người ta có thê định tính vi khuân bảng phương pháp soi trực tiếp trên

kính hiển vi điện tử để quan sát hình thái, cách sắp xếp tế bảo hay nhuộm

Gram dé phan loại vi khuẩn Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương

bat mau tim con Gram âm bắt màu hồng Ngoài ra, bằng cách quan sát hinh dạng, mảu sắc và kích thước khuẩn lạc cũng có thể xác định được vi khuẩn

đo mỗi vi khuẩn có một khuẩn lạc đặc trưng riêng Vì thể với các KIT định tính và khỏa phân loại Bergey có thể nhanh chóng định danh tên vi sinh vật

[12]

Trang 13

1.1.5 Phương pháp định lượng vi khuẩn

Vi khuân có thẻ được định lượng một cách trực tiếp hoặc gián tiếp theo ba cách chủ yếu được minh họa băng hình 4, đó là định lượng trực tiếp bằng

buông đếm hông cầu, định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng cách đếm số lượng

khuẩn lạc trên mỗi trưởng đặc và phương pháp đo độ đục [8], [21]

Với phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng câu, số tế bao trong ImÌ mỗi trưởng được tỉnh theo công thức sau đây [8] : „ 8x 4000 x b c x 1001) Trong đó : x : lượng tế bao trong 1 ml a: so té bảo trong Š ö lớn b; tỷ lệ pha loãng mỗi trường c: số ô nhỏ trong 5 õ lớn

Nguyên tắc của phương pháp định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng cách

đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trưởng đặc lả: một tế bảo ở pha tăng trưởng hay ở giai đoạn sớm của pha ổn định đều có thể phân chia theo cấp số nhân

cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được Số lượng

khuân lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉnh là số lượng tế bào sống trong thê tích đó Do vậy cần phải pha loãng sao cho mỗi

khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào sống duy nhất [8] Số lượng

khuẩn lac trong 1 ml mau được tính bằng công thức sau :

Kas =< 5 ụ

Trong đỏ :

n : số khuẩn lạc trung binh trong đĩa netri ở mỗi độ pha loãng nhất định v : thể tích dịch mẫu dem cay (1 ml)

Trang 15

1.1.6, Tac dung cua Lactobacillus rhamnosus trén lam sang va rng dung Lactobacillus rhamnosus la mot probiotic thuộc hệ vị khuẩn có ích ở

đưởng ruột, theo tiếng Hy Lạp, probiotic có nghĩa là "dành cho cuộc sống” [43] Day la một chủng vi khuẩn đã được chứng minh với nhiều tác dụng có

ÿ nghĩa trên lắm sảng

Theo két qua nghién ctu in vitro va in vive gan đây, L.GG tăng cường

chức năng sinh lý của hệ thông ruột bằng cách bám chặt vào chất nhờn ở thành ruột, lưu trú tại đây và cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh Chúng được ví như một hảng rào bảo vệ cơ thẻ khỏi những tác nhân gây bệnh đường ruột

và do đó được ứng dụng trong phòng và điều trị tiêu chảy đặc biệt là ở trẻ

em [35]

Kết quả thử nghiệm lâm sảng vẻ điều trị tiêu chảy do vi khuẩn Rotavirus được tiễn hành trên 287 trẻ em ở độ tuổi từ 1-36 tháng cho thấy L.GG lam giảm thời gian bị nhiễm Rofavius cũng như làm giảm thời gian phải năm viện điều trị của bệnh nhân [20]

Đông thời 7.GG tăng cường khả năng thải độc, bài tiết, chuyên hóa của cơ thẻ Đã có những bằng chứng khoa học cho thấy L.GG làm giảm tích lũy

aflatoxin trong ruột từ 30% xuống con 5% thông qua việc tăng cường thải trừ phức hợp aflatoxin- L.GG [22]

L.GG cũng đã được chứng minh là có khả năng cải thiện vả tăng cưởng hệ thống miễn địch của cơ thẻ thông qua việc kich thích sản xuất các cytokine của tế bào đơn nhân máu ngoại vi [30] [32], tăng đáng kế lượng interferon gamma [36], kich thich dap ứng miễn dịch hệ tiêu hóa bằng cách

tăng sản sinh kháng thể IgA có trong lớp màng nhây của ruột [30] Chính vi

thể, 7.GG được ứng dụng trong các chế phẩm vi sinh giúp tăng cường sức đề

Trang 16

Đelta Immune là một ứng dụng mới hiện nay, về bản chất đỏ là những

đoạn thành tế bảo của /.GG với cầu trúc cơ bản là peptidoglycan được dùng

như một chế phẩm tăng cường hệ miễn dịch, sử dụng rộng rãi ở Nga trong

khoảng gắn 20 năm nay và ở Mỹ trong khoảng 5 năm nay [46] Với tác dụng

kích thích miễn dịch không đặc hiệu, Delta Immune được dùng đẻ điều trị

các bệnh suy giảm miễn địch phổ biến hiện nay như: viêm phế quản mãn,

viêm loét đường tiêu hóa và đặc biệt là phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tỉnh, ung thư [46]

1.2 PEPTIDOGLYCAN VA TAC DỤNG KÍCH THÍCH MIEN DICH

1.2.1 Dai cwong vé peptidoglycan

Peptidoglycan hay còn có tên gọi khác là Murein có thành phân cơ bản bao gỗm: N-acetylglueosamin, acid N-acetyl muramic và 1 chuỗi tetrapeptid

chửa cả L và D acid amin, trùng hợp xen kẽ với nhau tạo thành chuỗi

peptidoglycan Tetrapeptid trên mỗi chuỗi peptidoglycan liên kết với

tetrapeptid trên chuỗi khác tạo thành lớp và tetrapeptid trên các lớp khác

nhau liên kết chéo với nhau tạo thành mạng lưới không gian đa lớp vững chắc bao quanh ngoài màng sinh chất Đẳng thời các thành phân của mạng

lưới peptidoglycan liên tục được mở ra để đường mới có thẻ găn thêm vào,

nhờ đó mả tê bào có thé sinh trưởng, phân chia được (hình 5) [3]

Trang 17

>” a» eid N-acetyl muramic

œ az acid amin

Hình 5 Mô hình chudi polyme peptidoglycan

1.2.2 Phương phap dinh tinh peptidoglycan

Đề định tính peptidoglycan người ta thường dùng kỹ thuật dién di SDS- PAGE với thang protein đã biết về trọng lượng phân tử Peptidoglycan được coi là tình sạch nêu kết quả thu được những vạch tách rời riêng biệt và trọng lượng phần tử phù hợp với các nghiên cửu làm cùng phương pháp [9]

Theo kết quả của các nghiên cứu đã tiễn hành, peptidoglycan tỉnh sạch có nhiều loại khác nhau với trọng lượng phân tử có thể lả: 15 kDa [17]; 30 kDa [13]; 46 đến 54 kDa [1 1]; 50 kDa [34] [46] Theo một nghiên cứu tách

chiết của Ashok Kumar và cộng sự cho kết quả như sau: 120, 92, 80, 66, 55,

42, 36, 29, 24, 18 va 16 kDa [26]

1.2.3 Tác dụng và cơ chế kích thích miễn dịch đã nghiên cứu của peptidoglycan

Chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu là những chất có khả năng làm tăng sức đề kháng của cơ thẻ đối với nhiều tác nhân gây bệnh (kháng

nguyễn) mà bản thân nó không có liên quan gì vẻ cấu trúc kháng nguyên vả không cần thiết phải đưa vào cơ thể cùng với kháng nguyên song vẫn có hoạt tính của một trợ chất miễn dịch Với khả năng đó các chất kích thích

miễn dịch không đặc hiệu này cé mét vi tri quan trong trong sự phát triển

Trang 18

biện pháp điều trị bằng miễn dịch hiện nay Đặc biệt trên cơ sở nghiên cứu

được lý miễn địch tiền lâm sàng, các chất này đã tỏ ra có triển vọng lớn nhất

trong việc chấp thuận hợp pháp đẻ ứng dụng trên lâm sảng [2]

Vẻ tác dụng kích thích miễn dịch của peptidoglycan

Peptidoglycan là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu Nó đã

được chứng minh là có khả năng kích thích sản xuất IL-1-beta trên cá chép

Cyprinus carpio sau 4 giờ và đạt được nông độ cao nhất sau 5 ngày [23]

Thêm nữa, peptidoglycan hiệp đồng tác dụng cùng với

phytohaemoagglutinin (PHA-P) tăng cường đáp ứng miễn dịch của co thé [23]

Peptidoglycan từ vách tế bào /.GG còn được biết đến dưới tên Delta

Immune hay Russian Choice Immune kích thích rất mạnh sự sinh trưởng vả biệt hóa cao các bạch cầu lympho tại đường ruột cũng như trong máu Ngoal ra, Delta Immune con lam tăng trưởng cytokines (những phân tử sinh học điều hành hoạt động tế bảo} Đặc biệt là khả năng trợ giúp đại thực bao, day

là những tế bảo miễn dịch có vai trò quan trọng trong khởi đầu cơ chế miễn dịch đông thời điều hòa hoạt tính của TNFE-alpha và Interleukin-2 để các chất này không gây tên thương cho cơ thể trong các bệnh viêm mãn tính, dị

ứng và bệnh tự miền [42]

Về cơ chế tác dụng của peptidoglyean, [1|

Có thê nói, sự có mặt của peptidoglycan trong cơ thẻ không gây sản

xuất kháng thể chống lại nó mả chỉ kích thích cơ thé tăng cường sản xuất

khang thé noi chung dé chong lai bat cứ một kháng nguyên nào khác đang

ton tại trong cơ thẻ

Peptidoglycan tác dụng lên các chất có thẩm quyên miễn dich (dai thực

bao, lympho T va B) Cac tế bào có thâm quyền miễn địch này đáp ứng với

Trang 19

vai trỏ của chất kích thích miễn địch không đặc hiệu Ở giai đoạn tiếp nhận kháng nguyên, chất kịch thích miễn dịch làm tăng hoạt tính thực bảo do đó

gây tăng hoạt tính kháng nguyên, tăng sản xuất Interferon, kich thich tăng sinh tế bào để chuyên đại thực bào có định thành di động Sang giai đoạn chuyển dạng lympho, chất kích thích miễn địch kích thích chuyển dạng

Iympho thành các tế bào trẻ hóa trở lại (dang blast), chuan bj cho qua trinh

nhân lên và phân chia Và giai đoạn phân chia và nhân lên, chất kích thích mien dịch làm tăng cường quá trình này, biểu hiện hàm lượng acid deoxiribonucleie (ADN) tăng lên rõ rệt do đó một lượng lớn các tế bảo có

khả năng tông hợp kháng thể Và kết quả là làm tăng sinh tổng hợp kháng

thé

1.3 CAC PHUONG PHAP CHIET TACH PEPTIDOGLYCAN TU VACH TE BAO VI KHUAN

1.3.1 Vách tế bào vi khuẩn Gram dương

Vách tế bảo là lớp ngoài cùng bao quanh vi khuẩn, bên chắc và có độ day 20-80nm So di nhu vậy là do vách tế bào ví khuẩn Gram (+) được cau tạo bởi hệ thông mạng lưới peptidoglycan lập thể ba chiều, là polyme gắn

kết đa chiều vững chắc (hình 6) Chính lớp peptidoglycan này lả cơ sở để

phan biét Gram (+) va Gram (-) vi peptidoglycan chiém khoang 90% trong

vách tế bảo Gram (+) Thêm vảo với lop peptidoglycan nay con có acid

teichoic, Acid teichoic là nolyme của D- alanin và glycerol phosphat, cỏ thể liên kết với peptidoglycan hoặc màng tế bào chất, loại acid teichoic liên kết với màng tế bảo chất được gọi là acid lipoteichoic Nhờ cấu tạo như vậy

vách tế bảo thực hiện được chức năng duy trì ngoại hình tế bảo, bảo vệ tế

bảo chỗng lại những điều kiện ngoại cảnh bất lợi [3]

Trang 20

Protein mang (CWPS) : r : Polysaccharide (PS) —— x f 151] a Peptidoglycan (PG) —— es he,

IIIfffff ng AiG A MAA NAN AN

Mang te bao IIIIIIILII IIiIIILLÔ) WIUU IWU IIULU 0

Hình 6 Sơ đỗ cầu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram (+)

1.3.2 Những quy trình tỉnh sạch peptidoglycan đã được công bố trên

thé giới

Đã có nhiều quy trình chiết tách thành công peptidoglycan được công

bố, nhìn chung có thể chia thành 3 giai đoạn chính, đó là: phá vỡ vách tế bao

vi khuẩn; tỉnh sạch vách tế bảo vả cuỗi cùng là tách riêng thu lay peptidoglycan Cy thé nhu sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn phá vỡ vách tế bào vi khuẩn

Trong các nghiên cứu đã tien hanh, vach tế bảo vi khuẩn Gram (+) co

thể được phá vỡ bằng 2 cách: sử dung LiCl hodc cát thủy tỉnh

e Quy trình sử dụng LIC]:

Phan tan sinh khoi té bao vao dung dich LiCl 5M (10-15mg LiCl trong Iml H;O) tạo thành một hỗn dịch, sau đó ủ ở ÚC, trong 10 phút Mục đích của LÍCI là để loại bỏ protein lớp ngoài cùng (S-layer) của vách tế bảo vi

khuản, nhiệt độ thấp đẻ ức chế sự tái hop cua lp S-layer này [28]

Trang 21

Với nhương pháp này, người ta có thể quan sát các thành phản cầu tạo

và cầu trúc của peptidoglycan dưới kính hiển vi điện tử Tuy nhiên, LiCI là

hóa chất đắt tiên và đây là một kỹ thuật phẫu thuật ở mức độ nano phúc tạp do vậy khó có thẻ thực hiện ở nước ta hiện nay

se Quy trinh sử dụng cát thủy tinh:

Theo Ashok Kumar và cộng sự, tế bảo vi khuẩn được phá vỡ bằng cát

thủy tỉnh (đường kinh 0,17-0,18 mm) trong máy làm đồng nhất hóa Hỗn

dịch đem ly tâm (3000 vỏng/phút, 10 phút, 4'C) thu dịch nỏi Ly tâm dich nỗi (13000 vòng/ phút, 25 phút, 4”C) thu căn tế bảo, Rửa căn nảy bằng nước

3 lần [26] Ngoài loại cát thủy tỉnh trên, vách tế bào cũng có thể được phá vỡ

bằng cát thủy tỉnh (đường kinh 0,45-0,50 mm) [40] Mặt khác, trong nghiên cứu của mình, Fox A và cộng sự công bỗ lượng cát thủy tĩnh sử dung la 30g

[16]

Theo một nghiên cứu khác sau khi tiễn hành lăc mạnh hẳn dich sinh

khối tế bảo với sự có mặt của cát thủy tỉnh đem ly tâm (1700 vòng/ phút, Š

phút, 4”C) đẻ loại bỏ những tế bảo chưa bị phá vỡ Dịch nỏi thu được đem ly

tam (17680 vong/ phut,15 phat, 4°C) thu cắn là vách tế bào, tiếp đó rửa lại

bảng nước cất vài lần và đồng khô Cứ 0,1 mg vách tế bảo được phân tán

vảo Iml H;O chứa L0” acid trichloroacetic (TCA) vả đun söi trong I5 phút

Cuỗi cùng rửa lại | lan bang dém phosphat (PBS) pH 7,3 va 4 lan bang nude

[37]

Không chỉ được xử lý bằng cát thủy tỉnh, có quy trình còn sử dụng thêm

một tác nhân lảm mát là đồng khí CO› Cách này có thẻ phá vỡ hơn 95% tế

bao [16]

Trang 22

Giai doan 2: Giai đoạn tỉnh sạch vách tế bào vi khuẩn bang enzym

Sau khi phá vỡ cầu trúc, vách tế bảo vi khuẩn được xử lý bằng một số

enzym Sau đây là một sỏ phương pháp đã được nghiên cứu vả tiến hành trên thể giới:

Theo Ashok Kumar, cắn tế bào sau ly tâm được phan tan vào dung dịch đệm phosphat pH 7,6 chứa tryspin (200ug/ml), RNase (100Hg/ml), DNase

(50ug/ml) Đem ủ ở 37C, 18 giờ Sau đó rửa bằng nước 3 lần và đông khô

[26]

Trong nghiên cứu của X Zhang và cộng sự, vách tế bảo được xử lý

băng 3 enzym trên nhưng khác ở nông độ sử dụng: DNase (1 mgig sinh khối

ướt), RNase (10 mg/g sinh khỏi ướt) tryspin (20 mg/ø sinh khi ướt) Sau

đây, để loại bỏ protein màng ngoài cùng (CWPS) xử lý tiếp băng các

protease nhu: proteinase K (2 mg/g trong lugng wot), pespin (20 mg/g trong

lượng ướt), papain (5 mgig trọng lượng ướt) Bước tiếp theo là dùng hỗn

hợp dung mỏi chloroform- methanol (2:1} để loại bỏ acid lipoteichoic hay glycosyl glycerid [41]

Mặt khac, Fox A va céng su dua ra mét guy trinh nhu sau: vach te bao

được ủ với RNase (0,025mg/mg } ở 37C trong 4 giờ và lắc liên tục Lẫy ra

rửa bằng đệm phosphat (PBS) và xử lý tiếp bằng trypsin (0,025mg/mg) ở

3TC trong 4 giờ Rửa lại lằn nữa rồi phan tan vao dém phosphat (PBS) pH

7,0 có chứa 0,00I1M cystcin và 0,001M EDTA Cuỗi cùng ủ với papain (

0,02mg/mg) ở 37C trong 4 giờ, rửa bằng đệm phosphat (PBS) 2 lần, bằng

nước 1 lan, thấm tách và đông khô [16]

Giai đoạn 3: Giai đoạn tách riêng thu lấy peptidoglyean

Peptidoglycan được tách ra từ vách tế bảo tính sạch băng cách chiết 5 lần với formamid ở 170C trong 1 giờ Sau lân chiết cuối cùng, phần còn lại không tan được rửa với nước I lần, thâm tích lại bằng nước trong 48 giờ va

Trang 23

đông khé Phuong phap nay đã được mô tả chỉ tiết bởi Krause và MeCarty

[27]

Ngoai ra ciing cé thé xu ly bing acid trichloroacetic (TCA) Cir 1 g té bao cho vao 100ml TCA 5% dé ở nhiệt độ phòng, 24giờ trong máy lắc Tiép

dén dun nong & 90°C trong 15 phut, ria 3 lần bằng nước, 1 lần bang acetone

va lam kh6 [24], [25]

Theo một nghiên cứu khác, vách tế bảo được xử ly voi TCA 10%, dun nóng ở 60C trong 4 giờ Hỗn dịch thu được đem ly tâm (32980 vỏng/nhút,

30 phút, 4'C) thu lay căn, rửa lại 1 lần bằng nước [41]

Trang 24

CHUONGII

VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 VAT LIEU

2.1.1 Chủng vi khuẩn

Ching Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) do Vién Kiém Neghiém Thuốc Trung ương cung cấp

2.1.2 Hóa chất

- Mỗi trường nuôi cây: MRS đặc và MRS thạch (Merck, Đức) - Pepton, cao nắm men, cao thit, glucose, natri acetat, Natri clorid - Cat thủy tình (đường kính: 0,1 7-0,18 mm}

- Đệm phosphat (PRS) nH 7,6

- Cac enzym: DNase 10 mg/ml va RNase 10 mg/ml, Trypsin 1X (25mg/ml) (Sigma, Australia)

- Trichloroacetic acid (TCA) 5%

- Thang protein: Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas,

My)

2.1.3 Môi trường MIRS

Cũng thức mỗi trường MIRS lóng tự pha:

Trang 25

Công thức mỗi trường MRS đặc:

Cir 1000ml MRS lòng được bỗ sung thêm 18,0g thạch pH: 6,2; 25°C Moi truéng MRS-Merck: + Long: 52,2 g/l 2.1.4 Máy móc, thiết bi - Noi hap - Tủ cây vô trùng - Tủ ấm CO; - Tủ lạnh sâu -&0”C va -20°C - May do pH - May do quang - Thiết bị làm đồng nhất hóa - Tuyp Eppendorff |,5ml - Ong Falcon 50m! - Pipet bam 10, 100, 1000 ul (EppendorfT) + Đặc: 66,2 gi - May dién di Bio-Rad - May spin - Binh nón 100, 250, S00, 1000mÏl - Cân kỹ thuật - Là vi song - May dong kho

- May siéu ly tâm lạnh

- Máy lắc ngang

- Đĩa petri, ông nghiệm, đầu côn các loại

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp làm mỗi trường

Pha chế mỗi trường: từng thành phan của môi trường MRS được cân,

đong chính xác theo công thức băng cân kỹ thuật Sau đó hòa tan hết với

nước, bỏ sung nước cho đủ thẻ tích Nếu môi trường có thạch can lam tan

thạch băng cách đun trong lò vỉ sóng khoảng 30 giây (chủ ý không để môi trưởng tràn ra ngồi) Mơi trường cản phải trong để quan sát, nêu cần thiết thì

tiến hành lọc băng bông Điều chỉnh pH của môi trưởng bằng dung dịch HCI

Trang 26

hay NaOH vẻ pH 6.2 Đối với MRS-Merck pha theo công thức quy định của

nha sản xuất,

Sau khi pha xong phân phối mỗi trường vào ống nghiệm, bình nón bằng phêu thủy tỉnh, sau đó đậy lại bằng nút bông Quá trình nảy phải chủ ý

không để môi trường đính vào miệng bình đẻ tránh nhiễm, Dem tiệt khuẩn mỗi trưởng băng nỗi hắp ở 121C, 1atm trong 15 phút Nếu mỗi trưởng chưa

dùng đến phải bảo quản trong tủ lạnh 4”C

L.GG được tăng sinh trong MRS-Merck và MRS tự pha từ cùng một éng gidng long Nudi cay trong ti 4m 5% CO, sau 24 gid dem ly tam (8000

vong/phat, 5 phut, 4"C) thu cin, phan tan cin nay vao 10ml H2O cat Tran

déu hon dich trén bang cach ding pipet hút lên hút xudng vai lan réi do dé

đục ở bước sóng 600nm bảng may do mat dé quang UV-VIS 2.2.2 Phương pháp phân lập giỗng thuần

Giống thuẫn được phân lập bằng phương pháp pha loãng:

- Chuan bị 5 ống nghiệm, mỗi ông chứa 9ml nước muối sinh lý vỗ trùng,

đảnh số thứ tự từ 1 đến 5

- Lay một lượng bột từ chế phẩm chứa /.GG cho vào ông nghiệm số 1, lắc

nhẹ

- Dùng pipet pasteur 1000u1 hút Imi từ ống nghiệm số 1 cho vào ống

nghiệm số 2, trộn đều bằng cách hút lên, hút xuống vải lẳn Cứ tiếp tục làm

như vậy cho đến ông số 5

- Sau đó lẫy Iml từ mỗi ông số 4 và ống số 5 cho vào 2 đĩa petri đã tiệt trùng

- Hé mở đĩa petri đỗ nhanh khoảng 12-15ml MRS thạch đã tiệt tring con am

vào, xoay qua xoay lại vải lần

Trang 27

- Sau 72 gid lay mét khuan lac moc riéng ré tang sinh trong môi trường MRS long sé thu được vi khuẩn /.GG thuần khiết Ông giống vi khuẩn ở dạng lỏng

bảo quản trong tủ lạnh 4”C giữ được trong 1 tuần

2.2.3 Phương pháp giữ giống

L.GG được giữ giống bảng kỹ thuật cấy đâm sâu trên thạch đứng và cứ |,5- 2 tháng cây truyén mot lan

Cấy đâm sâu trên thạch đứng

Thạch đặc được đỏ từ 1⁄2 đến 2/3 ông nghiệm, sau khi tiệt trùng đê đứng, thạch đông lại ta có ông thạch đứng Tủ cấy được tiệt trùng bing con 95" va

UV trước khi sử dụng

Các bước sau được thực hiện trong tủ cấy vô trùng:

- Đưa que cấy vòng có vỉ sinh vật đâm sâu vào đọc sát theo thành ông thạch

cho đến tận đáy ông nghiệm, đâm từ 1-3 đường Lưu ý khi cắm que cấy vào

cũng như khi rút que cây ra, chủ ý phải giữ que cấy thăng, nhẹ nhang va không làm cho mỗi trường bị nứt nẻ

- Tiếp đến nuôi cây trong tủ âm 37C, 59% CO:, trong 42 giờ Sau đó ống

giảng được bảo quản trong tủ lạnh 4°C

Cây truyền từ ống thạch đặc sang mỗi trường MRS lỏng Que cây vòng được sử dụng với các bước lần lượt như sau:

- Đốt đèn côn trong tủ lên

- Tay trải cảm 2 ông nghiệm: ống thạch đứng ở phía ngoài và ông mỗi trường

MRS lỏng ở phía trong (lưu ý: không để môi trường chạm vảo nút bông) giữa

2 ngón tay cải vả ngón tay trỏ, lòng bản tay hướng lên trên - Dùng tay phải xoay lỏng các nút bông

- Tay phải cảm que cây và vô khuẩn trên ngọn lửa đèn côn,

- Kẹp nút bông giữa các ngón tay vả giữ như vậy đến khi đóng các nút bông lại

Trang 28

- Đưa que cây vào ông thạch đứng và lấy một ít thạch có vi khuẩn rồi cho vào

ống môi trường MRS lỏng Lưu ý: không đẻ đầu que cấy chạm vào thành các

ống nghiệm

- Rút que cấy ra, đốt miệng ông nghiệm và nút bông rồi đậy lại

- Đề các ông nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cần và đẻ lại vị trí cũ - Nuôi cây trong tủ âm CO; trong 24 giờ, sau đó cây vào một ông thạch đặc khác

1.2.4 Phương pháp nhân giống

Trong tủ cấy vô khuẩn đỗ nhẹ nhàng ông nghiệm chứa L.GG đã hoạt

hóa băng 10mi MRS (ống giống vi khuẩn ở dạng lỏng) vào bình nón đựng IDml mỗi trường lỏng MRS đã tiệt trùng Hơ nhẹ miệng hình nón qua ngọn

lira, day lai bang nut béng roi dé vao th am 37°C, 5% CO:, nuôi cay trong

những khoảng thời gian thích hợp

Thu sinh khôi băng ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút, 4”C)

2.2.5 Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được sinh khối tối đa

Thí nghiệm này được thực hiện theo các bước sau day:

- Chuẩn bị 10 ống nghiệm được đánh số thử tự lần lượt từ I đến 10, mỗi ống

có Ìml mỗi trường MRS lòng tự pha

- Các ông nghiệm được đem hắp tiệt trùng

- Sử dụng phương pháp nhân giếng: lấy Iml ông giống vi khuân ở dạng lông

cho lin lượt vào từng ông nghiệm trên

- Sau các khoảng thời gian nuôi cấy 6 giờ; 12 giờ; 18 giờ; 24 giờ; 30 giờ; 36

giờ; 42 giờ; 48 giờ; 54 giờ; ó0 giờ lần lượt lẫy ông nghiệm từ I đến 10 cất vào tủ lạnh đề làm ngưng quá trình sinh trưởng vả phát triển của vi khuẩn

- Ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút, 4'C) thu cắn, phân tán cắn này vào 10ml

Trang 29

2.2.6 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy để thu được sinh khối tối đa Thi nghiệm nay được thực hiện theo các bước sau day:

- Chuẩn bị § ống nghiệm được đánh số thứ tự lần lượt từ 1 đến 8, mỗi ống có

1ŨmÏ mỗi trường MIRS lỏng tự pha

- Đo pH của mỗi ông băng máy đo pH sau đó dùng HCI hay NaOH đẻ điều chỉnh pH theo thứ tự lan lượt là: 5,6; Š,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6; 6,8; 7,0

- Các ông nghiệm được đem hắp tiệt trùng

- Sử đụng phương pháp nhân giỏng: lẫy Iml ông giống vi khuẩn ở đạng lỏng cho lan lượt vào từng ông nghiệm trên

- Sau 24 giờ nuôi cây đem ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút, 4'C) thu căn Căn

nảy chính là sinh khối tế bảo được phân tán vào 10ml HạO cất

- Trộn đều hỗn dịch trên bằng cách dùng pipet hút lên hút xuống vài lần rồi đo độ đục ở bước sóng 600nm bằng máy do mật độ quang LV-VIS

2.2.7.Quy trình chiết tách peptidoglycan từ vách tế bào vi khuan Lactobacillus

rhamnosus GG

Giai doan 1: Giai doan pha v@ vach té bao vi khuan

Chuẩn bi sinh khói tế bảo: cân một lượng sinh khôi L.GG 6 dang déng khé

để sử dụng là 0,45g tương đương với khoảng 0,5g sinh khối ướt (sinh khối thu được sau khi ly tâm ở 8000 vòng/ phút, 5 phút, 4C)

Lượng tế bào trên được bổ sung thêm 15g cát thủy tỉnh (đường kính:

0,17-0,18mm), thêm nước tạo thành 200ml hỗn dịch Vách tế bảo được phá

vỡ băng máy làm đỏng nhất hóa Cánh khuấy quay với tốc độ 1000 vòng/

phút, đưa từ từ lên cho cánh khuấy tiếp xúc với hỗn địch khoảng 1 phút, sau đó bỏ ra đẻ yên 1 phút, lặp lại 10 lần

Hỗn dịch thu được sau đó ly tâm (3000 vong/ phut, 10 phút, 4"C) thu

dich nỗi Dịch nổi này được ly tâm (13000 vòng/ phút, 25 phút, 4'C) thu cắn,

rửa căn 3 lần bằng nước,

Trang 30

Giai doan 2: Giai doan tinh sach vach té bao vi khuan bang enzym

Cho khoảng 20ml đệm phosphat PBS pH 7,6 vào cẵn thu được ở trên để

tạo thành một hỗn dịch đặc Sau khi giải đông enzym, hút lan uot Sul DNase

10 mg/ml (0,1 mg/g sinh khối ưới, 500 HI RNase 10 mg/ml (10 mg/g sinh khỏi ướt) vả 800 pl tryspin 25 mg/ml (40 mg/g sinh khéi ướt } cho vào hỗn

dịch đặc ở trên Sau đó đem ủ 4 giờ trong tủ ẩm 37C Thu lại cắn băng ly tâm

(13000 vòng/ phút, 25 phút, 4”C), rửa bằng nước 3 lắn và đông khô

Giai đoạn 3: Giai đoạn tách riêng thu lấy peptidoglycan

Căn là vách tế bảo ở giai đoạn 2 được xử lý tiếp với 10ml trichloroacid

acetic (TCA) 5%, ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc ngang với tốc độ 150

vòng/phút trong 24 giờ Hỗn địch thu được ở trên sau đây được ly tâm (13000

vòng/phút, 25 phút, 4”C) thu căn, rửa căn 3 lẫn bằng nước và đơng khư

2.2.8 K¥ thuat dién di SDS-PAGE dinh tinh peptidoglycan

Peptidoglycan chiết tách từ vách tế bảo vĩ khuẩn /.GG được định tính

dựa vào trọng lượng phản tử băng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

Quá trình chuẩn bị mẫu:

- Mẫu 1 là mẫu dừng lại ở giai đoạn I và được đông khô Mẫu 2 là mẫu được

xử ly theo 3 giai đoạn ở trên

- Pha Img bột mẫu với 30u1 HạO thành dung địch

- Đo hàm lượng protein có trong mẫu băng phương pháp Brad-ford: cho ImÏl

dung dịch Brad-ford chuẩn vào mẫu thử và mẫu chứng (nước muỗi sinh lý) - Sau 2 phút đo quang ở bước sóng 595nm bang may đo quang Mẫu cé ham lượng protein đạt yêu câu sẽ được chạy điện di

- Mẫu được cho thêm 10ul Dye (lam trong ti hot) sau đó ly tâm nhẹ - Cho mẫu có Dye vào nỏi biến tỉnh protein (95°C, 10 phút, không lắc)

- Lẫy mẫu ra và làm lạnh đột ngột bằng bình đã

Trang 31

Quá trình chuẩn bị máy để chạy điện di được tóm tắt như sau:

- Đâu tiên lắp 2 bản kính của máy

- Pha gel tách theo công thức với chủ ý là Sol C được cho từ từ dọc theo

thành cốc để không tạo bọt Sau đó nhẹ nhàng đỗ gel tách vào bản kính Cho EtOH lên khe kính rồi để 20 phút

- Pha gel cô theo công thức nhưng khi nảo tiễn hành đồ gel thì mới cho APS vả Tedmed vào

- Tiếp theo giéng lược được lắp vào ngay sau khi đỗ gel cô, nếu thấy giếng bị hut thi bé sung gel cho du

- Sau 20 phút rút lược ra sao cho không có bọt, nếu có bọt thì xử lý bằng

cách lấy pipet sục EtOH 90” vào đẻ làm sạch các giéng

- Sau cùng đỗ dung địch đệm điện di vào

Quá trình tải mẫu vào các giếng và chạy điện di:

- Hút 20Iil mẫu đã biến tính protein cho vào giếng

- 5u marker chuẩn của hãng Fermentas được chạy song song cùng với 2 mẫu thử - Chạy máy với cường độ dòng điện 18-2ImA khi chạy qua đoạn gel cô vả 25mA khi chạy qua đoạn gel tách,

- Thửi gian chạy là khoảng 75 phút

Quá trình nhuộm mẫu:

- Tắt máy, tháo bản kinh ra ngảm trong nước rồi nhẹ nhàng lấy bản gel ra

- Đồ thuốc nhuộm Coomassie Blue R vào bản gel, để trên máy lắc nhẹ, sau 24

giờ đọc kết quả vả chụp ảnh

Trang 32

CHUONG III

KET QUA NGHIEN CUU VA BAN LUAN

3.1 KET QUA NGHIEN CUU

3.1.1 Théi gian nudi cay dé thu được sinh khối tối đa

Sinh khối tế bào thu được sau những khoảng thời gian được biểu dién

thông qua giá trị mật độ quang OD theo bảng 1 (xin xem phân phụ lục) Đây là kết quả thu được tử 3 lan thi nghiệm độc lập, giá trị mật độ quang lả giá trị trung bình của 3 lân đo

Từ kết quả trên ta có đỏ thị sau: 3 2.5 3 — G 24 So 1.5 - ⁄ “1Ó 0.5 - 0 q 1 1 4 T 1 1 T T 0 6 12 18 24 30 36 42 43 54 60 t (giờ)

Hình 7 Đường cong sinh trưởng phát triển của vỉ khuẩn L.GG nuôi cấy bing MRS ty pha

Nhận xét:

- Thời gian nuôi cấy ví khuẩn sử dụng môi trường MRS tự pha để thu được

sinh khdi tỗi đa lả 24 giờ

- Lactobacillus rhamnosus GG phat trién theo quy luật hàm số mũ sau 18 giờ, ngừng lại sau 24 giờ, chia làm 4 pha: pha thích ứng kéo dải từ Ú-6 giữ; pha

Trang 33

lũy thừa phát triển năng động nhất tir 6-18 gid, pha ổn định từ 18-24 giờ và

pha suy tan từ 24-60 giờ

3.1.2 pH môi trường nuôi cấy để thu được sinh khối tối đa

Sinh khối tế bào thu được ở những pH môi trường khác nhau biểu diễn thông qua giá trị mật độ quang (OD) theo bảng 2 (xin xem thêm phụ lục) Đây

là kết quả thu được từ 4 lần thí nghiệm độc lập, giá trị mật độ quang là giá trị

trung bình của 3 lan đo

Từ kết quả này ta có đỏ thị sau: 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 56 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 pH Hình 8: Đồ thị tương quan giữa pH môi trường nuôi cây và sinh khối tế bào Nhận xét:

- Lactobacillus rhamnosus GG phat triển tốt trong khoảng pH từ 5,6 đến 7,0

vì giá trị mật độ quang OD không chẽnh nhau quá nhiều giữa các pH khác

nhau

- Tuy nhiên, pH thích hợp nhất cho sự tăng sinh của vi khuẩn này là 6,2

Trang 34

3.1.3 Sinh khối thu được từ môi trường MRS-Merck và MRS tự pha Sinh khối tế bào thu được từ môi trường MRS-Merck và môi trường MRS tự pha được biểu diễn thông qua giá trị mật độ quang (OD) theo bảng 3

(xin xem thêm phân phụ lục) Kết quả trên là kết quả thu được từ 4 lần thí

nghiệm độc lập, giá trị mật độ quang là giá trị trung bình của 3 lần đo Từ kết quả trên ta có đẻ thị sau: 3000 + 2500- 2000: oo 1500: 1000- MRS- MRS tw Merck pha Hình 9 Đồ thị trơng quan giữa sinh khối thu được từ MRS-Merck va MRS ty pha Nhận xét:

- Khi nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus GG bằng môi trường MRS

tự nha có pH 6,2 trong 24 giờ thì sinh khối thu được tương đương với lượng

sinh khối khi nuôi cấy bằng môi trường MRS-Merck Lượng sinh khối từ

MRS tự pha băng 99,9 % lượng sinh khối MRS-Merck

- Do vậy, công thức của môi trường MRS tự pha là công thức tối ưu cho sự

tăng sinh của L.GG va cé thé ding thay thé cho MRS-Merck

Trang 35

3.1.4 Quy trình nuôi cấy tối ưu cho vĩ khuẩn Lactobacillus rhamnosus GG

Dựa vào kết quả thu được ở trên để xây dựng một quy trình nuôi cấy tôi

ưu cho y¡ khuẩn #acfobacillus rhamnosus GG nhằm thu được sinh khối nhiều nhất phục vụ cho các nghiên cửu tiếp theo Quy trình đó bao gồm các bước diễn ra theo sơ đỗ sau đây:

Giống thuần khiết trong các ampul—> hoạt hỏa giống trong l0Ôml MRS long tyr pha ———* binh non chira 100ml MRS tu pha, 24 gid, 37°C, 5%

CO, ——— binh nén chira 250ml MRS tu pha, 24 gid, 37°C,

5% CO; ————>bình nón chứa 500ml MRS tự pha, 24 gid, 37°C, 5% CO,—

bình nón chứa 1000ml MRS tự pha, 24 giờ, 37C, 5% CO; ——+ sinh sản

tiép theo trong các thiết bị thuần khiết ———> nuôi cấy đại trà ———> thu

sinh khải

Sinh khối sau đấy được thu lại bằng cách ly tâm (8000 vòng/phút, 5 phút,

4C) và sử dụng ngay đẻ chiết tách peptidoglycan Còn nêu không sẽ được

đông khô đẻ bảo quản

3.1.5 Kết quả định tính peptidoglyean chiết tách được Kết quả điện di được thẻ hiện trong hình 10 và hình 11:

Trang 36

45 kDa 35 kDa i> c Peptidoglycan tử Ñ bang ci thay tnt

Đường chụy †: thang protein

Đường chạy 2: mẫu ủ với

enqym trang +l giữ

Dudng chay 3: peptidoglycan

chiết tắch được sau khi nhá vữ vách tế hàa (mẫu 1)

Hình 10 Ảnh điện di peptidoglycan sau khi pha v@ vach té bao

Trang 37

116 kDa 66 kDa

Peptidoglycan thu được qua 3 giai

đoạn chiết tách 45 kDa

35 kDa

25 kDa

Hình I1 Ảnh điện di peptidoglycan sau khi phá vỡ vách tế

bào xứ lý bằng enzym va acid trichloroacetic (TCA)

Puing chay |: peptidoglycan chiét tích được sau khi nhá vữ vách tế bảo, ủ với enspm trang 4 giờ va xử lý bằng 5% TCA (mẫu 3)

Đường chụp 3: thang protein

31

——

a

Trang 38

Nhận xét:

Với nông độ mẫu là l mg/ 301 H;O thu được kết quả điện đi của từng

mẫu như sau:

Mẫu I1 là peptidoglycan thu được sau khi phá vỡ vách tế bảo bằng cát

thủy tĩnh, trên đường chạy số 3 cho 2 vạch tương ứng với khoảng 76 kDa, 66

kDa (hình 10) Vạch thu được khả rõ nét, tuy nhiên vạch mờ hơn so với mẫu

2 (hinh I1 1)

Mẫu 2 là peptidoglycan sau khi phá vỡ bảng cát thủy tính sau đỏ tiếp tục xur ly bang 3 enzym (DNase, RNase, tryspin) va 5% TCA , trên đường chạy so 1 (hinh 11) cho khoang 10 vach tuong img vi 72 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 43

kDa, 40 kDa, 37 kDa, 35 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 22 kDa Trong do, vach dam

nét nhất la vach 50 kDa, diéu nay chi ra ring loai peptidoglycan chinh thu

được là loại có trọng lượng phân tử 50 kDa Như vậy, khác với mẫu 1, mau 2 cho các vạch rắt rõ nét và các loại peptidoglycan với trọng lượng phan tử nhỏ

hơn Peptidoglycan nhỏ nhất chiết tách ra được là loại có trọng lượng phân tử

khoảng 32 kDa

Song nhìn chung cả 2 mẫu đều có độ tỉnh sạch khá cao Do vậy, chúng

tôi kết luận rảng đã chiết tách duge peptidoglycan tir vach té bao L.GG (hinh 11)

3.2 BAN LUAN

3.2.1 Quy trinh nudi cdy Lactobacillus rhamnosus GG

Về việc lựa chọn vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus GG

L.GG là một probiotic, thuộc hệ vi khuẩn cỏ ích tại đường ruột mới đây

đã được chỉ ra là có ảnh hưởng tới hệ thông miễn dịch của cơ thẻ trong các nghiên cửu in vitro, mo hinh dong vật và thử nghiệm lâm sảng và những tắc dụng này đã được ứng dụng chủ yếu trong điều trị các bệnh vẻ dị ứng và viêm nhiễm Trong những năm gân đây, người ta đã tập trung phát triển và ứng

Trang 39

dụng các thanh phan duge chiét tach ra tir vach té bao L.GG (peptidoglycan)

Không những thể, các sản phẩm từ L.GG được lựa chọn bởi sự vượt trội về

tính an toàn sinh học cao, hiệu quả trong phòng và hỗ trợ điểu trị ung thư, nâng cao sức đẻ kháng cho cơ thể Do vậy, việc phân lập, giữ giống và xây dựng quy trình nudi cay toi ưu cho vi khuẩn này là có tính ứng dụng rất cao ở nước ta hiện nay Đây chính là lý do chúng tôi chọn UL.GG chứ không phải

một #.acfobacilius khác làm đổi tượng cho nghiên cứu của mình

Trong nghiên cửu của mình, chúng tôi chọn phương pháp pha loãng dé tạo ra vi khuân L.GG thuần khiết phục vụ cho công tác nghiên cửu do đơn

giản mà vẫn hiệu quả Đề đảm bảo chất lượng và tính ôn định của vi khuẩn nghiên cứu trong một thời gian dài, chúng tôi giữ giống bằng kỹ thuật cấy

đâm sâu trên thạch đứng do đặc điểm của 7.GG là vi khuẩn hỗ hắp ky khí

Để xây dựng được một quy trình nuôi cấy tối ưu cho vỉ khuẩn Lactobacillus rhamnosus GG với mục đích thu sinh khỏi tôi đa cẩn phải tìm

ra phương pháp pha chế môi trường, thời gian nuôi cấy và pH môi trường

thích hợp nhất cho sự tăng sinh của vi khuân này Do đó chúng tôi tiễn hành khảo sát sinh khỏi thu được từ MRS tự pha so với MRS-Merck, thời gian nuôi

cây và nH môi trường tôi wu cla L.GG

Về việc sử dụng môi trường MRS lỏng tự pha để thu sinh khối tế bào

Phải nói rằng, làm mỗi trưởng là một khâu quan trọng bậc nhất trong công tác nghiên cứu vi sinh vật vì mỗi trưởng kém phẩm chất hoặc không

đúng yêu cầu thì kết quả nghiên cứu sẽ khác nhau rất nhiều Vì vậy việc tiễn hành pha chế mỗi trường cần phải được tiễn hành cẩn thận và chính xác Dé

Trang 40

Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rõ rằng rằng sinh khôi thu được từ MRS- Merck và MRS lỏng tự pha tương đương Do vậy công thức và phương phán làm mỗi trường là một kết quả có ý nghĩa của khóa luận nảy trong việc triển khai nuôi cấy L.GG với một lượng lớn vì giá thành của MRS-Merck tương

đổi đắt

Vé ket qua khảo sát thời gian và pH môi trường nuôi cay

Thời gian nuôi cây là một thông số quan trọng cản khảo sát đẻ tìm ra một quy trình nuôi cấy với mục đích thu được tế bào ở pha đừng hay pha én

định làm nguyễn liệu cho quá trình chiết tách peptidoglycan Kết quả thu được cho thấy thời gian tôi ưu cho F.GG là 24 giờ Điều nảy rất có ý nghĩa

vì nguồn nguyên liệu tốt là cơ sở ban đầu cho quá trỉnh tính sạch peptidoglycan sau nảy

pH của môi trường nuôi cấy cũng là một yếu tổ có ảnh hưởng nhiều đến lượng sinh khối thu được của L.GG Do vậy, mục đích của thí nghiệm nảy la

tìm ra một pH thích hợp nhất để thu được sinh khỏi tối đa Nghiên cứu của

chúng tôi chỉ ra pH tỗi ưu cho L.GG là 6,2

Kết quả khảo sát vẻ thời gian nuôi cấy tôi ưu là 24 giờ và pH mỗi trường

6,2 của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu trên loài Lacfobacilius rhạmnosus của tác giả Niju Narayana vả cộng sự [31]

Phương pháp đo độ đục được sử dụng do đơn giản, nhanh chóng và

thuận tiện Song cân phải nói thêm rằng các giá trị mật độ quang thu được có

thể chưa phải là con số có ý nghĩa thông kê phản ánh chính xác lượng tế bảo

có trong đỏ Tuy vậy các mẫu thử được nuôi cây vả đo độ đục trong cùng một điều kiện do vậy đó là những con số nói lên mỗi tương quan về sinh khỏi tế bảo thu được sau những khoảng thời gian nuôi cấy và pH môi trường khác

nhau