nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn bacillus thu sinh khối nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản

Các chủng vi sinh vật như là Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp., clostridium sp., được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Duy, ThS Khúc Thị An, Ths Nguyễn Kim Cúc, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và động viên tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này

Cô Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi có thể thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm thực hành một cách tốt nhất

Xin cảm ơn các quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, để tôi có thể tích lũy được kiến thức để thực hiện được đồ án, và xa hơn là phục vụ cho những chặng đường tiếp theo sau khi rời ghế nhà trường

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp, 50Sh, 50MT, 50 TP2, các anh, chị cao học, anh Nguyên, anh Đảm, chị Xuân, và tất cả các anh chị, các bạn, cùng thực hiện đề tài với tôi tại phòng thí nghiệm, đã cùng chia sẻ bao nhiêu buồn vui của việc làm đề tài

và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Cuối cùng, cho tôi được gửi lời cảm ơn đến ba mẹ tôi, đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần, cho tôi lời khuyên cũng như san sẻ gánh nặng cho tôi trong 4 năm học và thực hiện đề tài

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn vì sự quý báu đó !

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU ix

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về Bacillus 1

1.1.1 Đặc điểm chung về Bacillus 1

1.1.2 Những ứng dụng của Bacillus 1

1.2 Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3

1.2.1 Khái niệm probiotic 3

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3

a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic 3

b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản 4

1.2.3 Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 6

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi trồng thủy sản 7

1.3.1 Ở Việt Nam 8

1.3.2 Trên thế giới 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Vật liệu 11

2.1.1 Chủng vi sinh vật 11

2.1.2 Môi trường hóa chất chuyên dụng 11

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật 15

2.2.2 Xác định khả năng sinh trưởng 16

2.2.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 17

2.2.4 Xác định đặc điểm hình thái 19

2.2.5 Định danh vi khuẩn 19

2.2.6 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 20

a/ Bố trí thí nghiệm thay thế nguồn cacbon 20

b/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 21

c/ Bố trí thí nghiệm khảo sát giá trị pH thích hợp 21

d/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ muối thích hợp 22

e/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 22

2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện lên men trong hệ thống lên men tự động BIO FLO 110 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Xác định khả năng sinh trưởng 23

3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 25

3.3 Mô tả đặc điểm hình thái 27

3.4 Định danh chủng B 3.7.1 31

3.5 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp 33

3.5.1 Khảo sát thay thế nguồn cacbon 33

3.5.2 Khảo sát nguồn nitơ thay thế 33

3.5.3 Khảo sát pH thích hợp 34

3.5.4 Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp 34

3.5.5 Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 36

3.6 Khảo sát lên men của chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Tài liệu tham khảo 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Ảnh đại diện Bacillus 1

Hình1.2 Bào tử Bacillus 1

Hình 2.2.1 Sơ đồ xác định khả năng sinh trưởng 18

Hình 2.2.2 Các bước xác định hoạt tính kháng khuẩn 19

Hình 2.2.3 Đo kích thước vòng kháng 20

Hình 2.2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon thay thế 22

Hình 2.2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 23

Hình 3.1.1 Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.1 25

Hình 3.1.2 Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.2 25

Hình 3.1.3 Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.1 26

Hình 3.1.4 Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.4 26

Hình 3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của B3.7.1 và B3.10.1 đối với Vibrio V1.1 27

Hình 3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V1.1 27

Hình 3.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.1 và B 3.10.1 đối với Vibrio V3.3 28

Hình 3.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V3.3 28

Hình 3.3.1 Khuẩn lạc chủng B 3.7.1 30

Hình 3.3.2 Tế bào chủng B 3.7.1 nhuộm Gram 30

Hình 3.3.3 Khuẩn lạc chủng B 3.7.4 31

Hình 3.3.4 Tế bào chủng B 3.7.4 nhuộm Gram 31

Hình 3.3.5 Khuẩn lạc chủng B 3.10.1 32

Hình 3.3.6 Tế bào chủng B 3.10.1 nhuộm Gram 32

Hình 3.3.7 Khuẩn lạc chủng B 3.10.2 33

Hình 3.3.8 Tế bào chủng B 3.10.2 nhuộm Gram 33

Hình 3.4.1 Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7.1 34

Hình 3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 36

Hình 3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37

Hình 3.5.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37

Hình 3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.1 38

Hình 3.5.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.4 38

Hình 3.5.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.1 39

Hình 3.5.7 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.2 39

Hình 3.5.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của 2 chủng B 3.7.4 và B 3.10.2 40

Hình 3.5.9 Khảo sát lên men chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio 29 Bảng 3.2 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Bacillus sp B3.7.1 với các

trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 35

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 FAO Food and Agriculture Organization – Tổ chức Nông

Lương Liên Hợp Quốc

2 WHO World Health Organizatin – Tổ chức Y tế thế giới

MỞ ĐẦUTính cấp thiết của đề tài

Ở nước ta hiện nay, nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản là một trong những tiềm năng và thế mạnh, năm 2010 tổng sản lượng nuôi 2.7 triệu tấn, diện tích nuôi đạt 1.110.000 ha, sản lượng đạt 3,1 triệu tấn (theo thống kê của Tổng cục Thủy sản) Tuy nhiên, trong ngành nuôi trồng thủy sản, mỗi năm cũng gặp rất nhiều khó khăn và thiệt hại, gây tổn thất lớn cho người nuôi do vấn đề về dịch bệnh trên thủy sản gây ra

Hầu hết người nuôi thường sử dụng các loại hóa chất khử trùng hoặc kháng sinh

để phòng bệnh Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này không cao, đồng thời còn gây ảnh hưởng đến môi trường Nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây

ra dư lượng kháng sinh trong sản phẩm và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng

Trên thị trường thuốc và chế phẩm nuôi trồng thủy sản của nước ta những năm gần đây, xuất hiện một cái tên mới được sử dụng, đó là “ Probiotic” Các chủng vi sinh

vật như là Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp., clostridium sp., được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi

trồng thủy sản hiện nay Giúp giảm thiểu những bất lợi do hóa chất gây ô nhiễm môi trường được sử dụng trong quá trình nuôi, hoặc hạn chế sử dụng các loại kháng sinh vì

có thể gây nhờn thuốc

Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính probiotic: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chất hữu cơ thừa … đã được áp dụng Các chế phẩm sinh học không những tăng cường khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa việc sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh Nhiều nhóm vi sinh

vật mang các đặc tính probiotic đã được sử dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Bacillus

Vì lý do trên, trong khuôn khổ của một luận án tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện

đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn Bacillus thu sinh khối

nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản” là cấp thiết

Mục tiêu của đề tài: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu sinh khối của các chủng

Bacillus có khả năng kháng khuẩn, mô tả, định danh các chủng đó, ứng dụng vào sản

xuất chế phẩm probiotic, nhằm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

Nội dung thực hiện:

- Xác định đặc điểm sinh trưởng của các chủng Bacillus

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio

gây bệnh

- Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính probiotic

- Định danh các chủng có hoạt tính probiotic

- Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng có hoạt tính probiotic

- Khảo sát điều kiện lên men các chủng có hoạt tính trong hệ thống lên men BIO FLO 110

Sinh viên thực hiện

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Bacillus

1.1.1 Đặc điểm chung về Bacillus

Bacillus là vi khuẩn hình que, hay trực khuẩn, thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+),

hiếu khí bắt buộc hoặc kị khí tùy tiện, dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, dương tính với catalase, di động bằng chu mao Do có khả năng hình thành nội bào tử nên

Bacillus có khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô hạn, chịu mặn, chịu chất khử và

các phân tử có hại khác

Mỗi tế bào Bacillus chỉ sinh ra một bào tử trong điều kiện khắc nghiệt về dinh

dưỡng và điều kiện sống Bào tử có cấu tạo gồm nhiều lớp, lớp ngoài cùng, lớp áo bào

tử, vỏ bào tử và lớp lõi Mỗi lớp có cấu tạo và vai trò khác nhau, giúp bào tử có thể thích nghi với môi trường sống khắc nghiệt

1.1.2 Những ứng dụng của Bacillus

Bacillus là loài được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và rất đa dạng, được

nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong đời sống con người ở nhiều lĩnh vực khác nhau

Từ sản xuất các sản phẩm truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, trong y-dược,

Hình 1.1 Tế bào vi

khuẩn Bacillus

Hình 1.2 Bào tử Bacillus

da giầy, xử lý môi trường, trong chăn nuôi thủy sản….Chẳng hạn Bacillus subtilis

được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong sản xuất enzyme ngoại bào (protease), ứng dụng dùng để thủy phân protein của thịt, cá, được sử dụng nhiều trong các sản phẩm nước mắm hay các thực phẩm đóng hộp, hoặc dùng trong tách chiết phá vỡ mô

cơ tế bào

Vào năm 1947 Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg (Phadarate và cộng sự,1997), tìm thấy các enzyme thuộc nhóm subtilisin, khi nuôi cấy

chủng B licheniformis và được đặt tên là subtilisin Carlsberg Subtilisin, là một nhóm

enzyme protease kiềm (serine protease) Enzyme này có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide, các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm, cũng như tất cả các serine protease (Govind và cộng sự, 1981), được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da, và ngay cả trong y học, do subtilisin có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng và nhiệt độ cao

Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, bột giặt, chất làm sạch kính, kem đánh răng, hoặc răng giả Các enzyme protease thích hợp sẽ được bổ sung vào chất tẩy thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng,

dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do con người tiết ra Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất năm 1956 với tên BIO-40 Đến năm 1963, Novo industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX

được chiết xuất từ B licheniformis Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ chủng Bacillus (Rao và cộng sự, 1998; Thangam và cộng sự, 2002) và chủ yếu là từ B subtilis Trên

thế giới, mỗi năm người ta dã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa Trong đó có hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor international mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta và cộng sự, 2002)

Trong ngành công nghiệp thuộc da một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra song Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất

đã giúp nâng cao chất lượng, làm giảm ô nhiễm và giảm chi phí sản xuất khi phải sử lý môi trường Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da (Christner, 1996; Varela và cộng

sự, 1997; Thangam và cộng sự, 2002) Ngoài ra còn có rất nhiều nghiên cứu và ứng

dụng khác của Bacillus trong các lĩnh vực khác vẫn chưa được đề cập và nghiên cứu, điều này cho thấy tiền năng rất lớn của Bacillus nói chung hay vi sinh vật nói riêng đối

với con người

Một ví dụ nữa cho việc của Bacillus đó chính là sử dụng trong sản xuất thuốc

trừ sâu sinh học, chủng vi sinh vật thông dụng nhất được sử dụng để sản xuất là chủng

Bacillus thuringiensis, bản chất là việc sử dụng độc tố ở dạng tinh thể hay bào tử của vi khuẩn để tiêu diệt sâu bọ và côn trùng có hại Bacillus thuringiensis lần đầu tiên được

phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học Shigente Ishiwarti, khi ông tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột của một số sâu tơ Ông là người đầu tiên

phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, và gọi đó là Bacillus sotto Năm 1911,

Bernard người Đức, tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi khuẩn

ký sinh trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring 1971,

chế phẩm Bacillus thuringiensis đã được nghiên cứu và sử dụng và phát triển cho tới

ngày nay

1.2 Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Khái niệm probiotic

Theo nghĩa gốc, từ “probiotics” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là

“Cho cuộc sống” Tuy nhiên, theo thời gian định nghĩa này cũng đã phát triển LiLy

và Stillwell (1965) đã mô tả “Probiotics” như một hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh có khả năng thúc đẩy sự phát triển của sinh vật khác Sau đó định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 1970, đó là “ probiotics” cũng bao gồm cả dịch chiết tế bào có khả năng thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật (Gomes và Malcata, 1999) Năm 1974 Parker đã áp dụng khái niệm này khi bổ sung vào trong thức ăn của gia súc và nhận thấy ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ khi sử dụng nó thông qua việc góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của gia súc

Vì vậy, khái niệm “probiotics” được sử dụng để mô tả “cơ quan và chất góp phần tạo

ra khả năng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”

Định nghĩa chung này sau đó được định nghĩa chính xác hơn bởi Fuller (1989), định nghĩa Probiotics như “một chất bổ trợ cho thức ăn chứa vi sinh vật sống mang lại những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột của chúng”

Năm 2001, chuyên gia của FAO và WHO đã định nghĩa về probiotics “là những

cơ thể vi sinh vật sống, khi được đưa vào cơ thể vật chủ với một lượng nhất định sẽ đem lại lợi ích về sức khỏe cho vật chủ” và đến thời điểm hiện tại, đây vẫn là định nghĩa được mọi người chấp nhận và sử dụng nhiều nhất

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và tìm thấy trong phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, người từng đạt giải Nobel – đã

chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi

sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông nói đến trong cuốn sách “Sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908)

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa

Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón

thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất

ra được Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á sau nhiều năm khi các sản phẩm lên men

từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản

- Các nghiên cứu trong nước

 Ở Việt nam, những nghiên cứu về việc sử dụng men vi sinh để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít Trong những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt

 Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được Ts Nguyễn Văn Duy và cộng sự, (2011); Lê Thị Bích Phượng và cộng sự, (2003); Lê Tấn Hưng và cộng sự, (2003); Võ Thị Hạnh và cộng sự, )2004) nghiên cứu và thử nghiệm

 Những nhóm vi khuẩn probiotic có tềm năng được sử dụng trong sản xuất

chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Moraxella… Thành phần vi sinh trong NTTS gồm những sản phẩm chính là sử dụng các nhóm vi sinh vật sống như: : Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter…

 Các nghiên cứu của Ts.Nguyễn Văn Duy và cộng sự, (2011) cho thấy, các

chủng vi sinh vật thuộc Bacillus có khả năng sinh trưởng và phát triển cạnh tranh và kháng với các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên đối tượng tôm sú

 Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 Theo như thí nghiệm, so sánh giữa không

sử dụng và sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì việc sử dụng hàng ngày cho kết quả tốt nhất Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột ở ngày thứ 18,

mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng luôn giữ được

ổn định

 Chế phẩm Biochie dùng để xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại

Đồ Sơn, Hải phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt, tôm phát triển đồng đều, tăng trưởng nhanh, tỉ lệ sống cao, giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi (Võ Thị Thứ và cộng sự, 2005)

- Các nghiên cứu ngoài nước

 Theo Nair và cộng sự, (1985) vi khuẩn lactic và một số nhóm vi khuẩn có

khả năng tiết ra các chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus

 Theo nghiên cứu của Foster và cộng sự (1991) sử dụng vi khuẩn phân lập

từ đất PM-4 cho vào môi trường ương nuôi ấu trùng Penaeus monodon, và nhận thấy ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ sống của ấu trùng do chúng có khả năng ức chế mầm bệnh

 Qiao Zhenguo và cộng sự (1994) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp

sử dụng cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc ( Penaeus chinensis) dùng cho cải thiện chất

lượng môi trường nước

 Năm 1995, Gariques và Arevalo đã tóm lược quy trình sản xuất sử dụng

các chủng vi khuẩn probiotic Vibrio alginolyticus điều khiển hệ vi khuẩn trong việc sản xuất giống tôm Penaeus vannamei ở Ecuador Chúng làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỷ

lệ sống của ấu trùng tôm một cách đặc biệt, do sự cạnh tranh với những vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng Vì vậy đã giảm nhu cầu thuốc kháng sinh và những chất hóa học dùng

để phòng và trị bệnh

 Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các men vi sinh trong nuôi tôm,

đặc biệt là tại Thái Lan ( Jiravanichpaisial và cộng sự), đã sử dụng Lactobacillus sp Trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Rengpipat và Rukpratanporn cho rằng Bacillus S11 là vi khuẩn hữu ích có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho

ấu trùng tôm sú ăn Kết quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỷ lệ sống

100% khi gây cảm nhiễm với V harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 26%

 Nghiên cứu của Wang Xiang- Hong và cộng sự (1998) cũng cho biết một

số vi khuẩn hữu ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo Tác giả còn cho biết thêm những vi khuẩn trong nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu cơ có hại Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi

1.2.3 Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Một loại probiotic có hiệu quả là phải có khả năng tồn tại và hoạt động trong một môi trường đa dạng dưới nhiều hình thức khác nhau Theo Fuller (1989) thì nó cần phải có những khả năng như sau:

1 Là một sản phẩm sống

2 Không mang mầm bệnh và độc tố

3 Tạo ra các tác dụng có lợi trên vật chủ

4 Có khả năng tồn tại và phát triển trong môi trường ruột của vật chủ

5 Duy trì ổn định và tồn tại lâu dài để được sử dụng sau này trong điều kiện lưu trữ và điều kiện ngoài hiện trường

Việc sử dụng vi khuẩn đường ruột có lợi trong thức ăn cho người và động vật

trên cạn đã được biết đến nhiều Lactobacillus acidophilus được sử dụng phổ biến để

kiểm soát và phòng bệnh do các vi sinh vật mầm bệnh trong ống tiêu hóa của nhiều

động vật trên cạn Vi khuẩn Lactobacillus rhammosus có trong yaourt giúp tăng khả

năng tiêu hóa và kháng lại vi khuẩn có hại trong đường ruột Lý thuyết kiểm soát sinh học đã được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản Nhiều nhà khoa học đã cố gắng sử dụng một số loại probiotic trong nuôi trồng thủy sản để điều khiển quần thể vi tảo của nước trong ao, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh, để tăng cường sự phân hủy các hợp chất hữu cơ dư thừa và cải thiện môi trường ao nuôi

Ngoài ra, việc sử dụng probiotic có thể gia tăng quần thể các sinh vật làm thức

ăn, cải thiện mức dinh dưỡng của các loài thủy sản nuôi và tăng cường khả năng miễn dịch của vật nuôi với mầm bệnh Như vậy, định nghĩa của probiotic đối với nuôi trồng thủy sản được mở rộng, nó bao gồm cả việc bổ sung vi khuẩn sống vào ao nuôi, những

vi khuẩn có lợi này sẽ cải thiện thành phần vi sinh vật của nước và nền đáy nhằm cải thiện chất lượng nước Probiotic được giả định là có khả năng tăng cường và cải thiện sức khỏe của vật nuôi bằng việc loại trừ các mầm bệnh hoặc hạn chế tối đa tác hại của mầm bệnh Vi khuẩn probiotic có thể bám vào bề mặt bên ngoài của vật chủ hay đi vào bên trong ruột hoặc trực tiếp từ nước hoặc qua thức ăn hay qua những hạt có thể tiêu hóa được Hơn nữa, sử dụng probiotic sẽ góp phần làm giảm lượng hóa chất, kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho tôm cá

Probiotic được gọi dưới tên khác nhau như “Chế phẩm vi sinh”, “Vi khuẩn có

lợi” hoặc “Vi sinh vật hiệu quả”, bao gồm các loại vi khuẩn Lactobacillus, Actinomycetes, Nitrobacteria, vi khuẩn chuyển hóa đạm, Bifidobacterium, nấm men…

Những vi khuẩn hữu ích này có thể cải thiện chất lượng nước nuôi thủy sản và hạn chế mầm bệnh trong nước, từ đó gia tăng năng suất nuôi trồng

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic được sử dụng như phương tiện kiểm soát dịch bệnh, bổ sung hoặc trong một số trường hợp thay thế các chất kháng khuẩn Các

nhóm vi tảo (Tetraselmis), nấm men (Debaryomyces, Phafia và Saccharomyces), vi khuẩn gram dương (Bacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Micrococcus, Streptococcus và Weissella ) và vi khuẩn gram âm (Aeromonas, Alteromonas, Photorhodobacterium, Pseudomonas và Vibrio) đều được

sử dụng Tuy nhiên, phương thức hoạt động của probiotic chưa được nghiên cứu đầy

2 Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết để tăng cường dinh dưỡng cho vật nuôi

3 Cung cấp men tiêu hóa để gia tăng quá trình tiêu hóa ở vật nuôi

4 Trực tiếp hấp thụ hoặc phân hủy vật chất hữu cơ hoặc chất độc trong nước cải thiện chất lượng nước

5 Thay đổi quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoặc có thể gây nên kích thích hệ miễn dịch của vật chủ

Những cố gắng để cải thiện quần thể vi sinh vật trong hệ thống nuôi trồng thủy sản đã được tiến hành cách đây khá lâu bằng việc sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi.Vadstein và cộng sự, (1993) cho rằng bổ sung trực tiếp vi khuẩn chọn lọc là một biện pháp để kiểm soát quần thể vi khuẩn trong suốt giai đoạn phát triển ấu trùng của

cá biển Sorgeloos (1994) đề cập đến các vấn đề cấy vi khuẩn hữu ích vào bể, trước khi thả cá bột, sẽ không những chỉ làm giảm cơ hội cho các vi khuẩn gây bệnh phát triển

mà còn có tác động có lợi khi vi khuẩn hữu ích phát triển trong đường ruột của cá bột Việc sử dụng khẩu phần ăn có chứa probiotic có thể có lợi cho các bột khi bị sốc (stress) do môi trường hay do thao tác Trong nuôi giáp xác, probiotic cũng đóng một

vai trò đáng kể Garriques và Arevalo (1995) cho rằng việc sử dụng Vibrio alginolyticus, được phân lập từ nước biển, đã làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng

của tôm P vannamei trong trại giống

Nogami và Maeda (1992) nghiên cứu một dòng vi khuẩn PM-4, phân lập từ ao

nuôi ghẹ, dòng vi khuẩn này đã giảm số lượng Vibrio ssp trong nước nuôi và Portunus trituberculatus và làm tăng năng suất ấu trùng ghẹ Jiravanichpaisal và Chuaychuwong (1997) sử dụng Lactobacillus sp trong nuôi tôm sú (P monodon) để hạn chế bệnh gây

ra bởi nhóm Vibrio và bệnh đốm trắng Các tác giả đã xác định được hoạt động ức chế

của Lactobacillus sp trên nhóm Vibrio, E.coli và Staphylococcus sp

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi

trồng thủy sản

1.3.1 Ở Việt Nam

Các nghiên cứu ở Việt Nam đều sử dụng các chủng của Bacillus và kết hợp với

các chủng khác để làm thức ăn thủy sản Một trong những cơ chế hoạt động của men vi sinh là các men có tác dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất hữu cơ đơn giản (Nguyễn Đình Trung và cộng sự, 2004) vi sinh vật thuộc nhóm

Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử

dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong của ao nuôi, khi đạt mật độ lớn, nó sẽ cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của

các động vật nguyên sinh, các vi sinh vật có hại cho thủy sản, đặc biệt là Vibrio có hại,

ngăn cản hạn chế sự phát triển của chúng

Theo nghiên cứu của các tác giả, Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú,

ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu cơ

trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung 3

loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/mL và 1

đối chứng (không bổ sung vi khuẩn) Kết quả cho ta thấy hầu hết các chỉ tiêu chất lượng nước của các nghiệm thức đều nằm trong khoảng cho phép

1.3.2 Trên thế giới

Theo nghiên cứu của Rengpipat và cộng sư (1998) các chủng Bacillus có khả

năng kháng bệnh cho tôm sú do có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn

dịch tế bào tôm sú Một số tác giả nhận thấy Bacillus có khả năng cô lập vi khuẩn gây bệnh như Vibrio sp Một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi trồng thủy sản như: luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus đã trực tiếp

cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin Nghiên cứu

khác trên cá hồi chấm hồng bắc cực (Salvelinus alpines L) kết quả cũng cho thấy vi

khuẩn có thể đã có vai trò quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá Nghiên cứu

tương tự trên tôm thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung

cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm

Boyd (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm các

chủng Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và Rhodopseudomonas Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,

và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa ta, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản

Foster (1991) đã bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis, và nhận thấy, các enzyme

được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy hầm

Một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của probiotic Nghiên cứu về sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow

trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng

hoạt động thực bào của bạch cầu

Nghiên cứu của Rengpipat và cộng sự (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho

rằng sử dụng Bacillus sp (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã

tiết ra các chất làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể Balcázar

(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V harveyi và virus đốm trắng Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei và cộng sự (2009) trộn B.subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ

lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ

tiêu hóa của tôm

Boyd (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm các chủng

Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và Rhodopseudomonas Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,

và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa ta, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản

Foster (1991) đã bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis, và nhận thấy, các enzyme

được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy hầm

Một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của probiotic Nghiên cứu về sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow

trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng

hoạt động thực bào của bạch cầu

Nghiên cứu của Rengpipat và cộng sự (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho

rằng sử dụng Bacillus sp (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã

tiết ra các chất làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể Balcázar

(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V harveyi và virus đốm trắng Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei và cộng sự (2009) trộn B.subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ

lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường nghiên

cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của Bacillus subtilis

được ghi nhận hơn 50 năm qua Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn

Bacillus subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 loại chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau,

bao gồm: subtilis, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin,

bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin,

difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin…Hầu

hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vi khuẩn cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp nhau

Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này chưa nhiều Rico-Mora (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên

môi trường nghèo hữu cơ Cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ

Verschuere và cộng sự (1999) đã chọn lọc một số dòng vi khuẩn có ảnh hưởng

tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia sau khi nước nuôi đã được lọc

sạch Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi trường có tác dụng chống lại vi

khuẩn gây bệnh V.proteolytics CW8T2 Vì vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu

thế trong việc cạnh tranh năng lượng và chất dinh dưỡng

Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid và cộng sự, 1993) Hiện tượng sản sinh siderophore là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt

có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường Các vi sinh vật này sẽ hấp thụ các phân

tử Fe kết tủa này và làm mất Fe trong môi trường Các vi sinh vật gây bệnh cần nhiều sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe của vi sinh vật trong thủy vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi trường (Neilands, 1981; Wooldridge và cộng sự, 1993)

Những kết quả về tác dụng của Bacillus subtilis C- 3102 (FERM BP- 1096)

cũng đã chứng minh trong việc tăng cân và tăng hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản, gia cầm, gia súc (Liao, và cộng sự, 1992) Theo nghiên cứu của (Logan và Bartlett, 1998)

việc bổ sung một số lượng nhất định các chủng vi khuẩn Bacillus lentimorbus, Bacillus stearothermophilus vào hồ nuôi thủy sản tập trung có tác dụng làm tăng sản lượng cá

đến 25%

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Các chủng Bacillus, và Vibrio được lấy từ bộ sưu tập chủng của Phòng thí

nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nha Trang được bảo quản trong 20% glycerol ở – 700C Các chủng Bacillus bao gồm 4 chủng B 3.7.1, B 3.7.4, B 3.10.1, B3.10.2, và 2 chủng Vibrio đối kháng là V1.1 và V3.3

2.1.2 Môi trường hóa chất chuyên dụng

Môi trường nuôi vi khuẩn

Yeast extract 5 g

Hòa tan vào trong 800 ml nước cất, điều chỉnh pH= 7.5 sau đó cho đủ thể tích là

1 lít

 Môi trường khảo sát nguồn carbon và nitơ thay thế

 Môi trường bột đậu nành

Hòa tan 2 g Crystal violet với 20 ml rượu ethylic để được dung dịch A

0.8 g Ammol oxalate trộn với 80 ml nước cất được dung dịch B

Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau ta được dung dịch thuốc nhuộm Violet, bảo quản trong lọ sẫm màu

 Dung dịch Iodine

Hòa tan 1 g Iodine trong 3 ~ 5 ml nước cất, thêm 2 g KI khuấy cho tan

hoàn toàn, thêm nước cất cho đủ 300 ml Bảo quản trong lọ sẫm màu

 Dung dịch nước muối sinh lý

Hòa tan 8.5 g NaCl trong 1 lít nước cất Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút,

để nguội và sử dụng

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng

 Hệ thống lên men BIO FLO 110 (Bioreacter), dung tích tối đa 10 lít, là hệ thống lên men có khả năng cài đặt tự động các thông số về nhiệt độ, giá trị pH, tốc độ khuấy, phá bọt Máy được thiết kế phù hợp và tối ưu cho việc nuôi cấy các loại tế bào động vật cũng như thực vật vì khả năng tự động điều chỉnh theo thống số cài đặt của người sử dụng

 Máy UV-VIS CARY 100 BIO dùng để xác định mật độ tế bào của dịch nuôi (Giá trị OD của dịch nuôi)

 Kính hiển vi điện tử Motic moticam 2300 dùng để soi tế bào vi khuẩn sau khi nhuộm Gram

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật

o Nuôi cấy chủng

Chủng được hoạt hóa sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh bằng cách, cho vào môi trường TSB, nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng 180 vòng/ phút Sau khi hoạt hóa qua đêm, tiến hành cấy chuyển để tiến hành thí nghiệm, chủng sẽ được đo nồng độ tế bào trong dịch nuôi bằng máy đo UV- VIS ở bước sóng 540 nm, để xác định được giá trị OD của dịch hoạt hóa Giá trị OD chính là độ đục của dịch nuôi hay khả năng hấp thụ của dịch nuôi tại một bước sóng nhất định nào đó, giá trị này thể hiện khả năng sinh trưởng của

vi sinh vật khi nuôi sau một khoảng thời gian nào đó Vi khuẩn càng phát triển mạnh