Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối từ cây đơn nem (Maesa Balansae Mez.)

Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối từ cây đơn nem thuộc xã Mỹ Yên, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.

26(2): 41-46 6-2004 Tạp chí Sinh học nghiên cứu điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối từ Đơn Nem (Maesa balansae Mez.) quách thị liên, nguyễn đức thành Viện Công nghệ sinh học Cây đơn nem - Maesa balansae Mez thuộc họ Cơm nguội (Myrsinaceae) thuốc đợc sử dụng nhiều y học dân gian Việt Nam Trung Quốc Cây đợc sử dụng nh loại thuốc chữa ghẻ lở, mụn nhọt, ngứa mề đay, đặc biệt bệnh da ngời dân sống vùng ngập lũ Ngoài ra, đợc dùng để tẩy giun sán, chống say rợu, chữa đau dày [1-3] Gần đây, đơn nem đợc phát có tác dụng chữa số bệnh hiểm nghèo Germonprez cs [7] phát đợc hợp chất antiprotozoal saponin đơn nem cã t¸c dơng kh¸ng ký sinh trïng Leishmania, nÊm Eizma có hiệu điều trị bệnh AIDS, Eizma Một vấn đề đặt đơn nem rừng sống hoang dại, phân tán nên việc cung cấp nguồn nguyên liệu số lợng chất lợng bị hạn chế Do vậy, việc nghiên cứu nhân nhanh đơn nem vào trồng trọt quy mô công nghiệp nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cần thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đ mở tiềm lớn công tác chọn, tạo nhân nhanh giống trồng Đồng thời mở triển vọng sử dụng kỹ thuật để nuôi sinh khối lớn có khả tổng hợp hoạt chất sinh học để thu nhận hoạt chất quy mô công nghiệp Trong báo này, trình bày số kết nghiên cứu điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối từ đơn nem I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Cây đơn nem đợc thu từ vùng đồi núi thuộc x Mỹ Yên, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên Phơng pháp Phơng pháp nuôi cấy tạo mô sẹo: mẫu đợc khử trùng, cắt thành miếng nhỏ có độ dài 0,5 cm; mảnh có kích thớc 0,5 ì 0,5 cm cấy lên môi trờng tạo mô sĐo: m«i tr−êng MS + 3% sucroza, 10% n−íc dõa, 0,8% agar bổ sung chất kích thích sinh trởng (auxin) với nồng độ khác Bình đựng mẫu nuôi cấy để phòng tối Nuôi cấy mô sẹo để thu nhận sinh khối: mô sẹo đợc tách thành miếng nhỏ có kích thớc 0,5 ì 0,5 ì 0,5 cm, cấy môi trờng nuôi cấy mô MS + 0,2% sucroza, 10% n−íc dõa, 0,8% agar vµ bỉ sung thªm mét sè chÊt nh− 2,4-D (2,4- axÝt dichlorophenoxyaxêtic), IAA (axít indol axêtic), casein, inositol với nồng độ khác Mỗi môi trờng tiến hành theo dõi 10 bình tam giác tích 250 ml Nuôi cấy phòng tối Sau 100 ngày nuôi cấy, dùng panh cấy gắp hết mô khỏi bình, cân trọng lợng mô thu đợc Phơng pháp định tính saponin: định tính saponin mô sẹo phơng pháp sắc ký lớp mỏng II Kết thảo luận Nghiên cứu ảnh hởng auxin lên trình tạo mô sẹo Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, auxin đóng vai trò trình hình thành mô sẹo thí nghiệm này, tiến hành nghiên cứu ảnh hởng auxin đến trình hình thành mô sẹo Mẫu đơn nem sau khử trùng đợc cấy 41 lên môi trờng MS + 3% sucroza + 10% n−íc dõa + 0,1% agar vµ bỉ sung auxin 2,4-D, NAA với nồng độ khác nhau: 1, 2, 3, mg/l Các bình nuôi cấy mẫu đợc đặt buồng tối nhiệt độ 252oC Thời gian tạo mô đợc tính từ cấy mẫu đến mô sẹo bắt đầu hình thành Hình thái mô sẹo: mô sẹo bắt đầu hình thành có màu trắng từ vùng bị tổn thơng (chỗ cắt) mẫu, không đồng miếng mẫu thờng tập trung chỗ; mô dạng hạt, nhỏ ly ty, trắng tuyết Sau mô sẹo lan dần ra, hình thành kín bề mặt miếng mẫu chuyển dần sang màu trắng vàng trắng đục xám (tùy thuộc môi trờng nghiên cứu khác nhau) Kết đợc trình bày bảng Bảng ảnh hởng auxin đến khả tạo mô sẹo đơn nem 12ngày 40 73,33 80 53,33 86,67 93,33 MT3 73,33 100 100 MT4 60 86,67 100 MT5 33,33 73,33 73,33 55,33 86,67 86,67 73,33 100 100 66,67 93,33 100 Auxin MT1 MT2 MT6 MT7 MT8 2,4-D NAA Kết thu đợc bảng cho thấy: nhìn chung, sau 12 ngày nuôi cấy, công thức cho tỷ lệ tạo mô cao 73,33%, nh loại auxin 2,4-D NAA có tác dụng tốt đến khả tạo mô sẹo từ mẫu đơn nem Tuy nhiên, chất khác (2,4-D NAA), nồng độ chất khác thời gian tạo mô sẹo khác tỷ lệ tạo mô khác Đối với 2,4-D, tăng nồng độ từ lên mg/l tỷ lệ tạo mô tăng từ 40 lên 55,53 73,33% sau ngày nuôi cấy từ 73,33 lên 86,67 100% sau ngày nuôi cấy Khi tăng nồng độ 2,4-D lên tới mg/l, kết thời gian tạo mô sẹo chậm hơn, sau 12 ngày đạt 100% tỷ lệ tạo mô giảm rõ rệt: sau ngày từ 73,33 xuèng 60% vµ sau ngµy tõ 100% xuèng 86,67% Từ kết trên, nhận thấy tăng nồng độ 2,4-D lên cao tới mg/l đ làm giảm trình tạo mô sẹo Đối với NAA, tăng nồng độ từ lên mg/l tỷ lệ tạo mô tăng: sau ngày cấy từ 42 Tỷ lệ tạo mô sẹo % Nồng độ (mg/l) Công thức 33,33 lên 57,33 73,33%, sau ngày cấy từ 73,33 lên 86,67 100% Công thức MT7 chứa mg/l NAA tạo mô sẹo sớm có tỷ lệ tạo mô sẹo cao Khi tăng nồng độ NAA lên tới mg/l (ở công thức MT8) tỷ lệ tạo mô sẹo giảm nhng giảm không đáng kể (so với công thức MT7); sau ngày nuôi cấy giảm từ 73,33% xuống 66,67%, sau ngày nuôi cấy giảm từ 100% xuống 93,33%, nhiên sau 12 ngày nuôi cấy đạt 100% Nh vậy, ngỡng nồng độ NAA mg/l, đ bắt đầu gây ức chế hình thành mô sẹo Nh vậy, đơn nem, 2,4-D NAA có tác dụng tốt đến trình hình thành mô sẹo Công thức MT3 chứa mg/l 2,4D công thức MT7 chứa mg/l NAA tốt nhất, cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao thời gian tạo mô sớm Kết hoàn toàn phù hợp với kết Ikenaga T cs [4] sử dụng 2,4 D NAA để tạo mô sẹo từ Solanum aculeatissimum Jacq., sau hai tuần hầu hết mẫu sống đ tạo mô sẹo Nghiên cứu ảnh hởng chất kích thích sinh trởng lên khả sinh trởng phát triển mô sẹo Trong thí nghiệm này, nghiên cứu sinh trởng phát triển mô sẹo môi tr−êng nu«i cÊy MS + 2% sucroza + 0,8% agar + 10% n−íc dõa + 0,4 g/l casein + 0,2 g/l inositol cã bỉ sung auxin, xytokinin ë c¸c nång độ khác Trên hầu hết môi trờng nuôi cấy, mô sẹo sinh trởng tốt, nhanh, mạnh; mô có hàm lợng nớc cao, xốp, cho lợng sinh khối lớn Dựa vào hình thái mô sẹo, chia làm loại: - Loại 1: mô sẹo thu đợc sau nuôi cấy môi trờng SK7, SK8 mô sẹo sinh trởng chậm, rắn chắc, liền khối; khối mô, xuất mô xanh (lục hóa), bề mặt mô sẹo sau phủ lớp mô sẹo trắng tuyết Nhìn toàn khối mô sáng xanh, đẹp - Loại 2: mô sẹo thu đợc sau nuôi cấy môi trờng SK1, SK2, SK3, SK4 (có nồng độ 2,4-D mg/l tổ hợp với chất xytokinin (kinetin, BAP) nồng độ khác nhau) mô sẹo sinh trởng phát triển nhanh, mô xốp, rời rạc, có hàm lợng nớc cao; mô vàng, trắng, phần phần dới chân mô - Loại 3: mô sẹo thu đợc sau nuôi cấy môi trờng SK5, SK6 mô sẹo sinh trởng phát triển mạnh, mô xốp, nhng không rời rạc; thời gian nuôi cấy dài, màu sắc mô thay đổi Phần đế mô màu xẫm dần, mặt màu sáng hơn, điểm vài chỗ mô trắng sáng môi trờng 2,4-D, mµ cã NAA mg/l, 0,5 mg/l BAP vµ tỉ hợp với kinetin nồng độ mg/l mg/l Kết hợp việc theo dõi hình thái mô sẹo môi trờng nghiên cứu, tiến hành thu nhận sinh khối mô môi trờng Cân đo trọng lợng mô ớt thu đợc Sau đó, thổi khô khối lợng mô ớt thu đợc bàn cấy vô trùng đến trọng lợng không đổi Cân đo trọng lợng mẫu khô, đánh giá hàm lợng nớc có mẫu mô nuôi cấy Kết đợc trình bày bảng Hình ảnh hởng môi trờng đến phân hóa hình thái mô sẹo Ghi chú: bên phải: mô môi trờng SK7; bên trái: mô môi trờng SK2; giữa: mô môi trờng SK6 43 Bảng ảnh hởng môi trờng nuôi cấy đến thu nhận sinh khối Công thức 2,4-D (mg/l) NAA Kinetin BAP (mg/l) (mg/l) (mg/l) SK1 _ 0,5 SK2 _ 0,5 M− (g/b×nh) 20,61 19,89 SK2 SK4 SK5 SK6 SK7 1 _ _ _ _ _ 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 SK8 - 0,5 Kết bảng cho thấy: Hầu hết trọng lợng mô ớt thu đợc môi trờng nuôi cấy cao, từ 17,09 20,61 g/bình Riêng hai môi trờng SK7, SK8 với tổ hợp NAA/BAP 1/2, 1/4, có bổ sung thêm 0,5 mg/l kinetin, thu đợc trọng lợng mô ớt thấp hơn, đạt 13,35 g/bình 11,67 g/bình Tuy nhiên, trọng lợng mô khô thu đợc (sau thổi khô đến trọng lợng không đổi) môi trờng nuôi cấy lại cho kết Sau 100 ngày nuôi cấy Mk Hàm lợng Hàm lợng (g/bình) nớc (%) chất khô(%) 93,90 6,10 1,257 93,48 6,52 19,03 17,78 18,27 17,09 13,35 1,303 1,050 1,045 1,096 1,160 1,316 94,44 94,13 94,00 93,21 90,14 5,52 5,58 6,00 6,79 9,86 11,67 1,82 84,30 15,70 ngợc lại Trên môi trờng SK1, SK2, SK3, SK4, SK5, SK6 thu đợc trọng lợng mô khô thấp, đạt 5,22 - 6,79% trọng lợng mô ớt thu đợc; điều có nghĩa hàm lợng nớc mô môi trờng cao 93,21% 94,44% Nh vậy, môi trờng có bổ sung 2,4-D mg/l môi tr−êng bỉ sung NAA mg/l tỉ hỵp víi kinetin mg/l, mg/l cho sinh tr−ëng m« tèt nh−ng hàm lợng nớc mô cao nên thu đợc trọng lợng mô khô thấp, đạt 5,42 - 6,79% trọng lợng mô ớt Hình Mô sẹo môi trờng SK7 44 Trên môi trờng SK7, SK8, thu đợc trọng lợng mô ớt thấp (11,67 g/bình, 13,35 g/bình) nhng sau thổi khô thu đợc trọng lợng mô khô cao, cao môi trờng Trên môi trờng SK8 trọng lợng khô đạt 15,6% môi trờng SK7 đạt 9,86% trọng lợng mô ớt Hàm lợng nớc mô thu đợc từ hai môi trờng SK7, SK8 cao nhng so với mô từ môi trờng khác đ thấp nhiều, 90,14% 84,30% Khi so sánh trọng lợng mô thu đợc môi trờng SK5, SK6, SK7, SK8 có nồng độ NAA mg/l tổ hợp auxin/cytokinin khác nhau, thấy: hai môi trờng SK5 SK6 (tổ hợp với kinetin nồng độ mg/l), mô phát triển nhanh, sinh khối mô ớt thu đợc cao nhng hàm lợng nớc mô cao nên thu đợc trọng lợng mô khô thấp Trên hai môi trờng SK7 SK8 (tổ hợp với BAP nồng độ mg/l) ngợc lại, mô sinh trởng phát triển chậm, trọng lợng mô ớt thấp nhng hàm lợng chất khô thu đợc cao Từ kết thu đợc, có nhận xét môi trờng nuôi cấy có tổ hợp auxin/cytokinin khác sinh trởng phát triển mô khác phát triển sinh khối mô khác Zong JJ cs [8] khả sinh trởng mô tế bào, tổng hợp hoạt chất sinh học suất hoạt chất đạt đợc thay đổi nuôi cấy Panax quinquefolium môi trờng có chất auxin khác tổ hợp auxin/xytokinin khác Jayakumaran N A cs [5] nuôi cấy Coscinium fenestratum môi trờng có bổ sung auxin khác nh 2,4D NAA có kết luận sinh trởng mô tế bào, tổng hợp hoạt chất sinh học (becberin) khác Tác giả kết luận dùng NAA thay cho 2,4 D kết hợp với BAP hoạt chất sinh học thu đợc tăng từ 1,97% đến 4,07% sinh khối thu đợc Tuy nhiên, xét trọng lợng mô thu đợc loại môi trờng nuôi cấy loại cho trọng lợng mô khô cao Hai môi trờng SK7 SK8 cho hàm lợng chất khô cao; nhng hai môi trờng SK1 SK2 cho sinh khối mô thu đợc cao, Mk đạt 1,257 g/bình 1,303 g/bình Nh vậy, với mục đích nghiên cứu nuôi cấy mô để thu nhận sinh khối hai môi trờng SK7 SK8 với tổ hợp NAA/BAP 1/2, 1/4, có bổ sung 0,5 mg/l kinetin, tốt Ngoài ra, hai môi trờng SK1 SK2 cho sinh khối mô cao Định tính saponin mô nuôi cấy Sau nghiên cứu ảnh hởng điều kiện nuôi cấy lên trình sinh trởng phát triển mô sẹo, thu nhận sinh khối mô, tiến hành đánh giá ảnh hởng môi trờng nuôi cấy mô sẹo lên tổng hợp tích lũy saponin phơng pháp sắc ký lớp mỏng Phơng pháp cho phép xác định nhanh có hiệu diện saponin Mẫu mô sẹo thu đợc từ môi trờng trình bày phần đợc đánh số thứ tự ký hiÖu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, theo bảng Mẫu hợp chất saponin chuẩn ký hiệu C Trong trình chiết xuất cô cạn dịch chiết, nhận thấy: tất mẫu mô trình cô cạn chân không tạo bọt, chất kết tủa màu trắng dung môi nh etanol, metanol Khi hòa chất kết tủa nớc thấy tan Các tính chất vật lý chứng tỏ có saponin dịch chiết mẫu mô Sơ đồ kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn thể hình Hình Kết sắc ký líp máng mÉu m« nu«i cÊy in vitro Ghi chó: C: mÉu hỵp chÊt chn, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: hợp chất thu đợc từ mẫu mô nuôi cấy môi trờng thứ tự lµ SK1, SK2, SK3, SK4, SK5, SK6, SK7, SK8 45 Từ kết sắc ký thu đợc, có nhận xét sau: sắc ký đồ phân đoạn có vạch cha xác định đợc chất Nhng sở so sánh với mẫu chuẩn sắc ký đồ, khẳng định mẫu mô đơn nem thu đợc có chứa hợp chất có chất saponin III Kết luận Từ kết thu đợc, rút số kết luận sau: Đối với mẫu đơn nem, công thức MT3 (MS +3 mg/l 2,4-D) công thức MT7 (MS + mg/l NAA) lµ tèt nhÊt cho trình hình thành mô sẹo, cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao thời gian tạo mô sớm Các môi trờng nghiên cứu cho thu nhận sinh khối mô cao có khả tổng hợp, tích lũy nhóm chất saponin; môi trờng cho trọng lợng mô khô cao SK7 (MS + mg/l NAA + mg/l BAP) vµ SK8 (MS + mg/l NAA + mg/l BAP); mẫu mô có chứa hợp chất có chất saponin Tài liệu tham khảo Võ Văn Chi, 1997: Từ điển thuốc Việt Nam Nxb Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hồ, 1999: Cây cỏ Việt Nam, 1: 674-675 Nxb Trẻ Đỗ Tất Lợi, 1999: Những thuốc vị thuốc Việt Nam: 129-130, Nxb Y học, Hà Nội Ikenaga T., Hadayani R., Oyama T., 2000: Plant Cell Report, 19: 1240-1244 Jayakumaran N A et al., 1992: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 29: 7-10 Murashige T., Skoog F., 1962: Physiol Plant, 15: 473-497 Nils Germonprez et al., 2000), Valorisation of the Biodiversity: development of a new antileishmania drug from the medicinal plant Maesa balansae Mez Inter application pullic under the Patent Co (PCT) A61K35/78 CO7C Zhong J J., Bai Y., Wang S J., 1997: Journal of Biotechnology, 45: 227-234 Study on tissue culture conditions of maesa balansae Mez for mass production Quach thi lien, nguyen duc summary Maesa balansae Mez is a valuable herb, which has been used in traditional vietnamese medicine A mixture of antiprotozoal saponins was isolated from the leaves of Maesa balansae Mez In this paper, we report the results of the study on tissue culture conditions for this plant The Maesa tissue culture was carried out in MS medium, supplemented with auxin and cytokinine in different concentrations and combinations All of the investigated culture media were suitable for mass production of Maesa and its bioactive components However, the SK7 medium (MS + mg/l NAA + mg/l BAP) and the SK8 medium (MS + mg/l NAA + mg/l BAP) were the most efficient Ngµy nhËn bµi: 30-12-2002 46 ... mô sẹo sinh trởng chậm, rắn chắc, liền khối; khối mô, xuất mô xanh (lục hóa), bề mặt mô sẹo sau phủ lớp mô sẹo trắng tuyết Nhìn toàn khối mô sáng xanh, đẹp - Loại 2: mô sẹo thu đợc sau nuôi cấy. .. môi trờng nuôi cấy, mô sẹo sinh trởng tốt, nhanh, mạnh; mô có hàm lợng nớc cao, xốp, cho lợng sinh khối lớn Dựa vào hình thái mô sẹo, chia làm loại: - Loại 1: mô sẹo thu đợc sau nuôi cấy môi trờng... Ngoài ra, hai môi trờng SK1 SK2 cho sinh khối mô cao Định tính saponin mô nuôi cấy Sau nghiên cứu ảnh hởng điều kiện nuôi cấy lên trình sinh trởng phát triĨn cđa m« sĐo, thu nhËn sinh khèi m«,