Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn biển HP411

Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Phương Nhuệ, Th.S. Phạm Thanh Huyền , Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức, tài liệu quý không chỉ trong quá trình học tập, nghiên cứu mà trong cả cuộc sống trong gần một năm nay. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã khuyến khích và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Em cũng xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ, Viện Đại học Mở Hà Nội có những nhận xét quý báu cho khóa luận này, và đã tạo mọi điều kiện cho em được học tập, làm việc trong môi trường chuyên biệt, định hướng nghề nghiệp cho sinh viên trong khoa nói chung và bản thân em nói riêng. Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè, những người thân yêu nhất của tôi đã luôn đồng hành, động viên, chia sẻ, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong cuộc sống và học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Thảo Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 1 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ CKS Chất kháng sinh CNSH Công nghệ sinh học DNA Deoxyribose Nucleic Acid ĐKVVK Đường kính vòng vô khuẩn KTCC Khuẩn ti cơ chất KTKS Khuẩn ti khí sinh MT Môi trường NXB Nhà xuất bản RNA Ribonucleoic Acid TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene VSV Vi sinh vật Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 3 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 4 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Kháng sinh là loại thuốc thiết yếu dùng để phòng chống bệnh nhiễm trùng cho con người. Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nước nhập khẩu thuốc nhiều nhất trên thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD. Do vậy, định hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết. Chất kháng sinh có thể được thu nhận ở nhiều sinh vật khác nhau: động vật, thực vật và vi sinh vật, trong đó chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật chiếm hơn 98% các thuốc kháng sinh đang lưu hành hiện nay. Theo thống kê thì trong khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới có trên 80% là do xạ khuẩn sản sinh ra (Berdy 2005; Goodfellow 1988). Ngày nay, do sự phổ biến của hiện tượng đa kháng thuốc, việc tìm ra một nguồn kháng sinh mới có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc bảo vệ con người chống lại bệnh tật và nâng cao sức khỏe của cộng đồng. Để tìm ra kháng sinh mới, thì việc lựa chọn các chủng xạ khuẩn sống trong điều kiện môi trường đặc biệt như: độ mặn cao, pH lớn, nhiệt độ cao hoặc ở các môi trường có sự canh tranh cao là các ưu tiên hàng đầu. Môi trường biển là một trong những môi trường có thể đáp ứng đầy đủ các yếu tố đó. Việt Nam có một vùng biển đặc quyền kinh tế khoảng 1.000.000 km 2 của vùng Biển Đông, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa cũng tạo cho nước ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật. Đây là nơi chứa đựng đầy hứa hẹn các hợp chất kháng sinh mới trong tương lai. Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật biển sinh kháng sinh, xác định thành phần môi trường lên men, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men trong phòng thí nghiệm là cơ sở bước đầu cho việc lên men sản xuất thuốc kháng sinh sau này. Với những mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn biển HP411” với các nội dung chính như sau: Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 5 Khóa luận tốt nghiệp 1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn HP411. 2. Lựa chọn một số điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn HP411. 3. Sơ bộ nghiên cứu một số điều kiện tách chiết chất kháng sinh thô từ dịch lên men chủng xạ khuẩn HP411. Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 6 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CHẤT KHÁNG SINH 1.1.1. Sơ lược về chất kháng sinh Năm 1942, A.A Waksman người đoạt giải Nobel với công trình phát minh ra streptomycin, lần đầu tiên đưa ra thuật ngữ “antibiotic” hay kháng sinh. “Kháng sinh là một chất do vi sinh vật sản sinh ra có khả năng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác”. Ngày nay, thuật ngữ kháng sinh được hiểu theo nghĩa rộng hơn: “Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật” [9, 19]. Cho đến nay, các nhà khoa học công bố đã phát minh được hơn 10.000 chất kháng sinh tự nhiên, trong số này khoảng 100 chất thực vật do thực vật tạo ra, còn khoảng hơn 7000 chất do các loài vi sinh vật tổng hợp, trong số này khoảng 100 chất đã được ứng dụng trong y học và một số lĩnh vực khác. Mặt khác, từ những kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng ngàn dẫn chất mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này khoảng 50 chất cũng đã được đưa vào sử dụng. Đồng thời có 2 kháng sinh được sản xuất hoàn toàn bằng tổng hợp hóa học đó là cloramphenicol và pyrrolnitrin [2]. Nồng độ thấp nhất của một chất kháng sinh có khả năng ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của một hoặc một vài chủng vi sinh vật xác định, được gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC). chất kháng sinh có giá trị nồng độ ức chế tối thiểu với vi sinh vật nào mà thấp thì hoạt tính kháng sinh cao đối với vi sinh vật ấy [2, 9]. Các chất kháng sinh có phổ tác dụng khác nhau, ví dụ: Cloramphenicol và tetraxyclin có tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nên được xếp vào loại có phổ tác dụng rộng, một số kháng sinh khác chỉ có tác dụng trên một hoặc một số loại vi khuẩn nên được xếp vào loại KS có phổ tác dụng hẹp. Có chất kháng sinh chỉ ức chế vi khuẩn Gram (+), có loại chỉ ức chế vi khuẩn Gram (-), có loại ức chế cả nấm men, nấm mốc nên phổ kháng khuẩn của chúng rộng hẹp khác nhau. Phổ kháng khuẩn cũng được xem như là một chỉ tiêu để phân loạichất kháng sinh [9]. Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 7 Khóa luận tốt nghiệp Độ lớn giá trị hoạt tính kháng sinh trong 1ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1mg chế phẩm (đơn vị/mg) thường được thể hiện bằng đơn vị kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể tích môi trường xác định (mcg/ml), có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định, trong thời gian xác định [8]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6mcg, còn 1 UI Streptomycin = 1,0mcg [9, 18]. Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chất kháng sinh, cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật và điều kiện biểu hiện chúng. Các chất kháng sinh tác dụng cơ bản đến tế bào thông qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật để tạo ra các phản ứng làm thay đổi quá trình trao đổi chất [2, 9, 18]. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc vi nấm: thành tế bào,màng sinh chất, quá trình sao chép, phiên mã, dịch mã và trao đổi chất trung gian (Hình 1.1). Ghi chú: PABA: paraminobenzoic acid; DHFA: dihydrofolic acid;THFA: tetrahydrofolic acid Hình 1.1. Cơ chế tác động của kháng sinh 1.1.2. Chất kháng sinh từ vi sinh vật biển Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 8 Khóa luận tốt nghiệp Hệ sinh thái biển có một số tính năng đặc biệt khiến nó khác biệt với các hệ sinh thái thủy sinh khác, yếu tố đó chính là do sự hiện diện của các hợp chất hòa tan trong nước biển,đặc biệt là natriclorua (NaCl). Môi trường biển là một hệ sinh thái rộng lớn chưa được khám phá hết, thách thức các nhà khoa học tìm kiếm các loại kháng sinh mới. Đã có trên 1000 loại thuốc có nguồn gốc từ vi sinh vật trên cạn nhưng tiềm năng này đã giảm đi từ gần 10 năm trở lại đây. Các nhà dược học đã tìm kiếm các loài vi sinh vật trên cạn có khả năng tạo ra thuốc nhưng kết quả thu được rất khiêm tốn [11]. Trong những năm gần đây, một số loài vi sinh vật ưa mặn có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp đã được mô tả. Một chủng vi khuẩn ưa mặn là Bacillus licheniformis 603 được các nhà khoa học Nga tìm thấy ở vùng nước nóng ở độ sâu 2100m, chủng này có thể sinh trưởng được ở nồng độ muối 15%, nhiệt độ 15-55 0 C, pH 5,1-9,8 và sinh ra chất antiadhesin. Gần đây, một chất kháng sinh mới là 7-O-Malonyl Macrolactin thuộc nhóm macrolactin mới được phát hiện từ chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus kháng methicillin, cầu khuẩn đường ruột kháng vancomycin và một biến thể khuẩn lạc nhỏ của B. Cepacia [23]. Đây là những phát hiện có ý nghĩa góp phần ngăn chặn hiện tượng kháng kháng sinh ở các chủng sinh vật gây bệnh. Tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, với hàng loạt các chất kháng sinh mới được tìm ra, nhất là các chất kháng sinh có nguồn gốc từ các vi sinh vật biển. 1.1.2.1. Nhóm chất kháng sinh polyketides Polyketides là một họ các chất chuyển hóa bậc hai được hình thành bởi sự xúc tác của enzyme polyketides synthases (PKSs). Khung Cacbon của polyketide được khử và biến đổi bởi những khu vực khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme ketoreductase, dehydratase và enoylreductase. Có 3 loại PKSs khác nhau đã được biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng. PKSs loại II là phức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs loại III [14]. Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 9 Khóa luận tốt nghiệp Abyssomicin C (Riedlinger J, Reicke A; 2004) là kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển Verrucosispora sp. Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi khuẩn G+, bao gồm cả những vi khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin như Staphylococus aureus [14, 22]. Daryamides (Asolkar et al., 2006) là polyketides gây độc cho tế bào được phân lập từ dịch nuôi cấy của xạ khuẩn Streptomyces sp. chủng CNQ-085. Chất này có khả năng gây độc cho tế bào ung thư biểu mô ở người, dòng HCT-116 và có khả năng kháng nấm Candida albicans [19, 22]. Trioxacarcin lần đầu tiên được phân lập vào năm 1981 từ Streptomyces bottropensis DO-45. Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thư khác nhau, có hoạt tính kháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét. Trioxacarcin A có khả năng tạo liên kết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14]. Hình 1.2. Cấu trúc của Abyssomicin C, Daryamides và Trioxacacins 1.1.2.2. Nhóm kháng sinh non-ribosomal peptide Proximicins là kháng sinh được tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp. MG37 và Verrucosispora maris AB-18-032, chúng được phân lập từ các mẫu trầm tích dưới độ sâu 250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản độ sâu 289m. Proximicins (A, B, C) có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào ung thư biểu mô dạ dày và ung thư biểu mô gan [14]. Nguyễn Thị Phương Thảo_KSCNSH 0904 10 [...]... Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 28-30 0C Mỗi loại xạ khuẩn có một khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh Có chủng sinh kháng sinh cao ở nhiệt độ 18 0C, có chủng lại sinh kháng sinh ở 280C [9] pH: pH thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là trung tính Tuy nhiên, pH cho phép sinh trưởng thường... griseus Janibacter limosus Kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thư Kháng khuẩn Kháng khuẩn Chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển rất phong phú và đa dạng (Bảng 1.1), nguyên nhân là một loại kháng sinh có thể do nhiều loài khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi một loài vi sinh vật tổng hợp ra nhiều loại kháng sinh khác nhau Ví dụ có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể tổng hợp được kháng sinh oxytetracyclin, hay... Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường được hình thành ở cuối pha sinh trưởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử, đó là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Trong số 8000 chất kháng sinh đã biết đến trên thế giới thì hơn 45% là do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh. .. được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm xạ khuẩn, với 500 loài đã được miêu tả, chi này có nhiều loài có khả năng sinh chất kháng sinh, một trong những loại kháng sinh rất quan trọng là streptomycin do Streptomyces griseus sinh ra Khả năng sinh kháng sinh là kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn [4] Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn, ... trình tổng hợp để tạo thành sản phẩm Tùy vào từng chủng xạ khuẩn mà sử dụng nguồn nitơ vô cơ khác nhau như các muối amoni, các muối nitrate: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3… hay các nguồn nitơ hữu cơ: cao ngô, cao nấm men, bột đậu tương… [4, 15, 31] Nguồn photpho vô cơ là yếu tố điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn chất kháng sinh. .. tới sinh tổng hợp chất kháng sinh do nguồn cacbon tham gia vào cấu tạo tế bào và tham gia vào quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm Trong nghiên cứu lên men sản xuất chất kháng sinh từ vi sinh vật, người ta nhận thấy glucose là nguồn cacbon thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn nhưng lại là yếu tố cản trở sự sinh kháng sinh [8, 25] Các polysaccaride và oligosaccaride lại tốt hơn cho sự sinh. .. so với pH tối ưu cho sự tổng hợp chất kháng sinh [4, 9, 31] Độ thông khí: là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh kháng sinh của xạ khuẩn Nếu độ thông khí bị hạn chế sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và khả năng tích lũy chất dinh dưỡng, làm thay đổi hình thái của khuẩn ty và giảm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh [4, 6] Giống: sinh tổng hợp kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bào... lên men chất kháng sinh trong điều kiện không vô trùng còn gọi là “ lên men phòng ngừa” Chất kháng sinh lên men trên môi trường xốp làm thức ăn bổ sung cho động vật nuôi [4] 1.2.6 Tình hình nghiên cứu về VSV biển sinh kháng sinh trong và ngoài nước Hiện nay, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nước trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất. .. lượng kháng sinh được tổng hợp ra.Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả nhất là từ 2-10%, tuổi giống thường là 24 giờ [16] Công nghệ lên men: Trong sinh tổng hợp chất kháng sinh, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Có các hình thức lên men: lên men bề mặt, lên men trên môi trường xốp, lên men chìm Herold và ctv (1956) đã phát triển công nghệ lên. .. Các polysaccaride và oligosaccaride lại tốt hơn cho sự sinh tổng hợp kháng sinh Như vậy, tùy thuộc vào yêu cầu sử dụng của từng giai đoạn mà lựa chọn thành phần cacbon trong môi trường lên men cho phù hợp Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn cần cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ lại có ảnh hưởng khá . nghiệp 1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn HP411. 2. Lựa chọn một số điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn HP411. 3 những mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn biển HP411 với các nội dung chính như sau: Nguyễn Thị. clavulanic. Xạ khuẩn biển là nguồn cung cấp kháng sinh đầy hứa hẹn, dưới đây là bảng tóm tắt giới thiệu các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển. Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Nguyễn