- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Độ hấp phụ (OD260) phụ thuộc vào nồng độ của ARN. Khi có mặt, RNase sẽ thuỷ phân ARN thành các oligonucleotide làm mật độ quang học tăng lên. Dựa vào sự
thay đổi OD260 ta đo được hoạt tính enzym.
- Một đơn vị (đv) hoạt tính RNase là lượng RNase xúc tác phản ứng thuỷ phân ARN tổng số trong những điều kiện tiêu chuẩn xác định làm tăng
mật độ quang học của dịch phản ứng (OD260) lên 0,01 đv OD sau thời gian phản ứng là 60 giây.
OD260 được đo trực tiếp trên máy quang phổ IMPLEN nanophotometer
P330 và hoạt tính RNase được tính theo công thức:
A = OD260 (E+S)tại 60s x 100 (đv hoạt tính)
Mẫu dùng để Blank chính là hỗn hợp phản ứng enzym + cơ chất tại thời điểm 0 giây.
Hoạt tính riêng của enzym (A0) được xác định bằng số đơn vị hoạt tính
của enzym/µg protein [1]. Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng phương pháp Bradford.
Trước khi đo hoạt tính RNase cần phải khảo sát sơ bộ động học của
enzym để xác định khoảng tuyến tính của OD260 (nghĩa là phải thỏa mãn điều
kiện giá trị OD260 tăng dần đều trong khoảng thời gian 60 giây kể từ khi trộn
dung dịch cơ chất với dung dịch enzym). Ưu điểm của thiết bị quang phổ IMPLEN nanophotometer P330 là có thể đo mẫu với thể tích cực nhỏ với ứng dụng NanoVolume Applications (cỡ 1µl đến 2µl mẫu khi sử dụng Lid 10, 1mm), trả kết quả cực nhanh với độ chính xác rất cao. Ngoài ra với ứng dụng Kinetic cài sẵn cho phép khảo sát sơ bộ động học của enzym. Các bước thực hiện như sau:
- Pha dung dịch cơ chất ARN:
Pha dung dịch ARN mẹ có nồng độ 10mg/ml: cân 10mg ARN nấm men, hòa tan vào 1ml nước UltraPure Distilled, ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ các thành phần không tan do trong quá trình sản xuất tạo ra. Từ dung dịch ARN mẹ nồng độ 10mg/ml tiến hành pha loãng 10 lần để được nồng độ 1mg/ml.
- Xác định tỷ lệ thể tích cơ chất ARN nồng độ 1mg/ml và thể tích mẫu (chứa RNase) cho vào tham gia phản ứng bằng cách khảo sát dãy tỷ lệ thể tích cơ chất/enzym sau đây với tổng thể tích tham gia phản ứng là 100 µl:
VARN 99 µl 90 µl 80 µl 70 µl 60 µl 50 µl 40µl 30µl 20µl 10µl VMẫu 1 µl 10 µl 20 µl 30 µl 40 µl 50 µl 60µl 70µl 80µl 90µl
Cài đặt các thông số để khảo sát động học enzym như sau: Truy cập vào ứng dụng Kinetic; chọn Lid 10; chọn OD 260; chọn tự động đo OD liên tục, đặt mỗi lần đo cách nhau 5 giây; đặt tổng thời gian khảo sát là 60 giây.
Hút thể tích cơ chất ARN và mẫu chứa RNase theo dãy tỷ lệ trên vào ống
eppendorf 200µl, trộn đều, hút ngay 2µl hỗn hợp phản ứng để Blank, đồng thời
giữ nguyên bấm nút để đo OD. Máy sẽ tự động đo giá trị OD260 liên tục theo các
thông số đã cài đặt, đồng thời vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị OD260 theo thời gian thực. Chọn mẫu có giá trị OD260 tăng đều trong khoảng giới hạn của phép đo (máy chỉ có thể đo được OD260 ≤ 2,5) trong thời gian 60 giây.
Kết quả khảo sát chúng tôi thấy với tỷ lệ thể tích cơ chất/thể tích enzym = 9:1 là phù hợp với khoảng tuyến tính của sự tăng OD260, đồng thời nằm trong khoảng giới hạn của phép đo và cũng là để tiết kiệm mẫu enzym.