Tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat là một phương pháp rất phổ biến trong tách chiết tinh sạch để nghiên cứu tính chất của protein. Khả năng kết tủa của một protein phụ thuộc nhiều vào hình dạng và kích thước phân tử của nó. Muối amoni sulfat là một muối trung tính vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử keo làm cho phân tử protein kết tụ lại.
Để tìm vùng nồng độ muối tối ưu để tủa RNase từ dịch chiết trứng cóc nhà/ếch đồng chúng tôi tiến hành phương pháp tủa phân đoạn protein ở các
vùng nồng độ muối amoni sulfat bão hòa khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% và dịch chiết còn lại sau tủa 80%.
Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33] (Tính cho 5ml thể tích dịch chiết mô)
% nồng độ amoni sulfat bão hòa
Khối lượng amoni sulfat khan thêm vào
10% 0,280 g 20% 0,285 g 30% 0,295 g 40% 0,310 g 50% 0,315 g 60% 0,330 g 70% 0,345 g 80% 0,360 g Các bước tiến hành:
- Bổ sung rất từ từ amoni sulfat khan vào mẫu dịch, có khuấy từ nhẹ trên nước đá đang tan
- Để tiếp dịch trên đá trong 20 phút (không khuấy từ)
- Ly tâm lạnh ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, mẫu dịch
tách thành 2 phần dịch nổi và tủa. Rót phần dịch nổi vào ống Falcon sạch, phần tủa bảo quản lạnh.
- Bổ sung tiếp lượng muối theo nồng độ ở bảng trên vào dịch nổi và tiến hành các bước tương tự tới nồng độ muối cuối cùng
- Tủa ở các nồng độ muối khác nhau được hòa trở lại trong 1ml đệm PBS pH 7,4 (đối với trường hợp dùng đệm PBS để chiết rút) hoặc 1ml dung
dịch H2SO4 0,25N (đối với trường hợp dùng H2SO4 để chiết rút). Tất cả các
mẫu dịch này được mang đi thẩm tích loại muối. Đo hoạt tính các phân đoạn