Nguyên lý:
Dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và trọng lượng phân tử của các chất trong hỗn hợp sẽ có mức độ di chuyển khác nhau trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký. Sephadex là chế phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose. Trọng lượng phân tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu. Loại hạt Sephadex G25 có trọng lượng phân tử từ 100 đến 5000 thường sử dụng cho mục đích loại muối. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kết 1,6. Dextran tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử". Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều thì kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. Khi cho hỗn hợp protein có lẫn muối đi qua cột, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ.
Các bước thực hiện theo quy trình sau: - Chuẩn bị mẫu:
Sau khi lựa chọn được các phân đoạn protein tối ưu đối với từng loại dịch chiết bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat ở bước 2.2.3, hút 1ml/mẫu vào ống eppendorf 1,5ml để tiến hành loại muối.
- Rửa cột bằng 5ml dH2O
- Hút 500µl mẫu vào cột, dùng ống eppendorf 1,5ml thu 500µl mẫu F1
- Hút 500 µl dH2O vào cột, thu 500µl mẫu E1
- Hút 500 µl dH2O vào cột, thu 500µl mẫu E2
- Hút 500 µl dH2O vào cột, thu 500µl mẫu E3
- Hút 500 µl dH2O vào cột, thu 500µl mẫu E4
- Hút 500 µl dH2O vào cột, thu 500µl mẫu E5
Tiếp tục thực hiện lặp lại các bước theo quy trình như trên. Sau khi thực
hiện xong một quy trình, dùng 5ml dH2O để rửa cột, dùng xong bảo quản cột bằng
3ml ethanol 20%.
Tiến hành định tính hoạt tính RNase trong các mẫu thu được bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose để chọn mẫu tối ưu nhất.