Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose
a) Điện di protein không biến tính
Các phân đoạn protein thu được sau khi tủa bằng muối amoni sulfat được mang đi điện di protein không biến tính. Quy trình thực hiện như sau:
Công thức pha gel polyacrylamid không có SDS (tính cho 01 bản): - Gel tách (16%): + Tris HCl pH 8,8: 1,125ml + Glycerol 50%: 0,9ml + Acrylamid 30%: 2,4ml + H2O: 45µl + APS 10%: 30µl + Temed: 3µl
- Gel cô (5%): + Tris HCl pH 6,8: 0,25ml + Acrylamid 30%: 0,175ml + H2O: 0,655ml + APS 10%: 10µl + Temed: 1µl
- Chuẩn bị mẫu: Từ mỗi loại dịch chiết hút 50 µl mỗi phân đoạn vào ống eppendorf 0,2ml; bổ sung thêm 10µl glycerol 100% vào mỗi ống, trộn đều, spin 8000 vòng/phút.
- Hút 10µl/mẫu vào các giếng (dùng lược 10 giếng) theo thứ tự:
Tủa 10% -> Tủa 20% -> Tủa 30% -> Tủa 40% -> Marker màu -> Tủa 50% -> Tủa 60% -> Tủa 70% -> Tủa 80% -> Dịch còn lại sau tủa 80%
- Lắp đặt điện cực, cài đặt theo thông số: 22 mA giai đoạn chạy gel cô, 42mA giai đoạn chạy gel tách (khi chạy 02 bản gel cùng một lúc).
Chạy đến khi vạch xanh lá cây của marker màu gần chạm mép dưới cùng của bản gel thì dừng lại. Thảo bản gel ra mang đi ép lên gel agarose.
b) Ép gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%:
Đun chảy gel agarose 0,8%, dùng ống falcon lấy ra 25ml, chờ cho gel nguội bớt, bổ sung thêm 150µl dung dịch ARN nồng độ 10mg/ml, trộn đều và đổ vào khuôn. Chờ khoảng 20 phút cho gel đông lại hoàn toàn. Lấy bản gel ra khỏi khuôn cho vào đĩa petri.
- Ép gel agarose:
Đặt bản gel polyacrylamid lên trên gel agarose, dùng dao cắt gel
agarose sao cho vừa bằng với gel polyacrylamid, ủ ở 370C trong 30 phút. Lấy
bản gel polyacrylamid ra, gel agarose mang đi nhuộm ethidium bromid trong 7 phút, rửa qua bằng nước deion, đặt lên bàn soi đèn tử ngoại. Đặt lại gel polyacrylamid lên trên agarose, bật đèn tử ngoại để xác định băng RNase
(RNase từ gel polyacrylamid sẽ khuếch tán vào gel agarose và thủy phân cơ chất ARN có trong gel agarose nên sẽ không bắt màu với ethidium bromid). Sau đó gel polyacrylamid được mang đi nhuộm coomassie trong 30 phút. Rửa sạch coomassie bằng dung dịch Destaining. Đem soi, kết hợp với gel agarose để xác định vị trí băng RNase, từ đó sơ bộ xác định được kích thước RNase.