Các protein là các ion lưỡng tính, vì vậy tùy vào pH của môi trường có thể tích điện âm hay dương, dựa vào đặc điểm này sắc ký trao đổi ion có thể được áp dụng để tinh sạch protein. Trên hệ sắc ký pha tĩnh là gel trao đổi ion, có hai loại: gel trao đổi ion âm (các chất có các nhóm mang điện tích âm sẽ tương tác với gel mang điện tích dương) và gel trao đổi ion dương (các chất có các nhóm mang điện tích dương sẽ tương tác với gel mang điện tích âm). Các phân tử protein trong dung dịch sẽ liên kết trao đổi ion thuận nghịch với giá thể, protein không bám sẽ ra trước trong dung dịch đệm còn các protein có liên kết ion sẽ bám lại trên giá thể. Sau đó chúng sẽ được rửa giải bằng dung dịch đệm với các gradient nồng độ muối hoặc gradient pH tăng dần. Tùy theo mức độ tích điện của protein (sự tương tác mạnh hay yếu giữa protein và giá thể) mà protein được đẩy ra trước hay sau trong quá trình rửa giải. Các protein có điện tích cao sẽ được đẩy ra sau.
Để tách các phân tử lớn như peptide, protein, nucleic acid, polysaccharid người ta thường sử dụng chất trao đổi ion dạng sợi ít chứa liên kết ngang
(dextran và acrylic) cho phép phân tử có kích thước lớn dễ dàng trao đổi ion với chất hấp thụ trao đổi ion.
- Cơ sở: phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng tương tác tính điện ion - ion giữa protein - enzym tan trong dung dịch đệm loãng với nhựa trao đổi ion (chất mang). Nguyên tắc của phương pháp là tách các phân tử dựa trên điện tích, cụ thể trong trường hợp này là tách các phân tử protein dựa trên điểm đẳng điện của chúng.
Sắc ký trao đổi ion được tiến hành trên hệ thống FPLC AKTA của hãng Amersham pharmacia biotech. Chất mang được cân bằng với dung dịch đệm Natri phosphat 20mM pH 6 và sắc ký cũng được tiến hành trong đệm này.
* Các bước tiến hành thí nghiệm:
- Chuẩn bị cột: Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột sắc ký trao đổi cation Hitrap SP XL 1ml nhồi sẵn do hãng GE Healthcare cung cấp. Gốc trao đổi ion dương trong cột là SP (sulfopropyl).
Như đã trình bày ở trên, điểm đẳng điện của RNase vào khoảng 8,4 nên chúng tôi sử dụng loại cột với chất trao đổi cation. Cột Hitrap SP XL được thiết kế phù hợp cho sắc ký sinh học với hiệu quả phân tách cao, tốc độ nhanh đối với các phân tử sinh học bao gồm protein, peptide và polynucleotide.
Thông số của cột Hitrap SP XL 1ml: + Thể tích cột: 0,962 ml
+ Khoảng load mẫu: 10 - 130 mg + Tốc độ dòng mặc định: 1ml/phút + Tốc độ dòng tối đa: 4ml/phút + Kích thướt cột: 7x25 mm + Áp suất tối đa: 0.3 Mpa - Chuẩn bị các dung dịch đệm:
Dung dịch A: Đệm Natri phosphat 20 mM pH 6 gồm 2 thành phần
1M + 88 ml NaH2PO4 1M được 100 ml đệm Natri phosphat 1M. Chỉnh lại pH 6 bằng tinh thể Na2HPO4 hoặc NaH2PO4. Pha loãng 50 lần được đệm Natri phosphat 20 mM pH 6.
Dung dịch B: dung dịch A bổ sung thêm lượng muối NaCl 1M. Công thức pha dung dịch B: 20 ml đệm Natri phosphat 1M + 200 ml NaCl 5M + 780 ml dH2O.
Các dung dịch đệm phải được lọc bởi màng lọc 0,2 - 0,45 µm trở lên và khử bọt khí ít nhất 15 phút trước khi đưa vào máy.
- Chuẩn bị mẫu:
Mẫu sau khi loại muối ở bước 2.2.10 được lọc qua màng lọc 0,2 - 0,45 µm để làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng cột, khi bơm mẫu nên tránh bọt khí vì sẽ ảnh hưởng đến sự phân tách của cột. Hút 1ml/mẫu vào ống eppendorf 1,5ml để chuẩn bị load mẫu lên cột.
- Thiết lập quy trình các bước cho máy thực hiện:
Muốn thiết kế một thí nghiệm tinh sạch protein trên hệ thống FPLC AKTA thì phải thiết lập được quy trình các bước cho máy thực hiện ổn định và có độ lặp lại cao. Phần quy trình cụ thể cho thí nghiệm tinh sạch RNase chúng tôi trình bày ở phần kết quả và bàn luận.
Lập quy trình các bước cho máy thực hiện như sau:
Bước đầu tiên của quy trình là dùng 20 CV dung dịch A để cân bằng cột, tiếp theo load 1ml mẫu lên cột, sau đó dùng 4 CV dung dịch A để rửa những phân tử protein không bám lên cột ra khỏi cột (thu các phân đoạn trước gradien nồng độ NaCl để kiểm tra). Tiếp theo chạy gradien nồng độ NaCl từ 0 đến 1 M với thể tích 50 CV và thu mỗi phân đoạn 1 ml (thu các phân đoạn có xuất hiện Peak). Sau gradient nồng độ NaCl dùng 10 CV dung dịch B để loại tất cả những gì còn bám lại trong cột ra khỏi cột. Cuối cùng cân bằng lại cột bằng 5 CV dung dịch A.
Sau khi kết nối các bộ phận của hệ thống và thiết lập quy trình xong, hệ thống sẽ thực hiện quá trình tinh sạch, vẽ sắc ký đồ trên màn hình theo dõi, tiến hành thu mẫu tự động bằng fraction collector. Kết thúc quy trình ghi nhận được tất cả các thông số về các peak tách ra được trên màn hình như là: độ dẫn điện; phần trăm dung dịch B; thời điểm xuất hiện các peak.
Tốc độ dòng chảy qua cột được duy trì ở giá trị 1 ml/phút.
Sau khi kết thúc sắc ký, gom các ống theo từng peak để xác định hoạt tính RNase và xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford trong tất cả các phân đoạn thu được.