RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học. Ngoài chức năng tiêu hoá và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun…
Các nghiên cứu y - sinh học cho thấy luôn tồn tại mối quan hệ giữa nồng độ và cả hoạt tính của các RNase trong các dịch bào và dịch cơ thể với các trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: nồng độ enzym tăng là kết quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật. Đôi khi chính RNase lại là tác
nhân gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể [39]. Trong một số bệnh lý thấy có liên quan đến nồng độ RNase trong máu như bệnh tăng bạch cầu tuỷ mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên đã phát hiện thấy lượng RNase 1 tăng lên trong các tế bào máu ngoại vi; nồng độ RNase huyết thanh tăng khi sử dụng prednison, giảm khi sử dụng steroid dị hoá. Vì vậy tăng lượng RNase trong máu có thể là marker (dấu hiệu) về trạng thái dinh dưỡng nghèo [1].
Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho người và vật nuôi đã được tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỉ trước [23]. Trong liệu pháp người ta có thể sử dụng các chất hoạt hoá (activator) hoặc các chất ức chế (inhibitor) của RNase, thậm chí cả những RNase và dạng hợp thể của RNase để trị bệnh [39]. Ức chế hoạt tính RNase là cần thiết trong điều trị dị ứng và các hội chứng ngộ độc thần kinh. Chất ức chế RNase của người làm giảm hiệu ứng gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính RNase ở một số loại thực vật.
Các activator của RNase có thể được sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng virus. Hoạt hoá RNase L cần thiết để ức chế sinh sản của nhiều virus trong tế bào. Các chất đồng đẳng phosphothoiat của 2’,5’-oligoadenylat (hoạt hoá hiệu quả RNase L) ngăn chặn phát triển nhiễm trùng virus. Các inhibitor của RNase L đang được thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng, các chế phẩm hoạt hoá RNase L như oragen và poli-I.poli-(C12U), bảo vệ tế bào khỏi nhiễm trùng virus. Oragen ức chế quá trình nhân đôi ADN virus trong các đại thực bào màng bụng in vitro và trong gan chuột nhiễm virus viêm gan chuột (MHV)-in vivo. Sau liệu pháp bằng poly-I.poli-(C12U) thói quen nhận biết của bệnh nhân với hội chứng mệt mỏi kinh niên được cải thiện tốt lên [39].
RNase cũng như các hợp thể của chúng là các chế phẩm thuốc. Ví dụ: sử dụng RNase tụy chữa viêm não do ve. Các RNase có hoạt tính cytotoxicity như ONC, Amph – các enzym có hoạt tính thấp, nhưng xâm nhập vào các tế bào ung thư rất hiệu quả và làm tổn thương các rARN. Một số thông tin cho
biết RNase trong nước tiểu của phụ nữ đang mang thai có hoạt tính chống ưng thư. Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các chế phẩm thuốc là hợp phần của RNase có khả năng nhận biết các mạch nucleotide trải dài trong một phạm vi và có tính đặc hiệu với một tuýp ARN nhất định. Các RNase tự chúng có tính đặc hiệu rất thấp. Người ta còn sử dụng RNase H thuỷ phân ARN. Nhờ tác động của enzym này có thể hướng vào những trình tự nhất định nhờ các oligonucleotide bổ trợ tương ứng.
Những năm gần đây, ngoài việc tìm được một số RNase nguồn gốc tự nhiên có nhiều đặc tính quí báu (như ONC, Amph, BS-RNase) các nhà khoa học còn tập trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư nhờ việc vận dụng thành công các kĩ thuật và phương pháp công nghệ sinh học hiện đại ở mức độ phân tử. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hay vài gốc amino acid cần cho tương tác protein-enzym hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự nhạy cảm với chất ức chế hay các protease trong tế bào. Các biến thể của RNase cũng được tạo ra bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase những phân tử protein liên kết đặc hiệu với những tế bào nhất định cho phép tạo ra những toxin chọn lọc hiệu quả [28, 42].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hoá chất
2.1.1. Nguyên liệu
- Trứng Cóc nhà (Duttaphrynus melanostictus)
- Trứng ếch đồng (Rana rugulosa)
Cóc nhà và ếch đồng mua ở các chợ thuộc khu vực Quận Hoàng Mai - TP Hà Nội, sau đó mang về mổ bụng tách riêng lấy trứng, cho vào các ống
Falcon sạch mỗi ống 10g trứng, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ - 200C.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Pipetman các loại (0,5-10μl; 10-100μl; 100-1000μl) - Đầu col các loại (0,5-10μl; 10-100μl; 100-1000μl) - Ống Falcon Corning các loại (15ml; 50ml)
- Ống Eppendorf các loại (0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml) - Cân phân tích 4 số Precisa XT 220A
- Máy nghiền đồng thể
- Máy đo pH210 Microprocessor pH Meter của hãng Hanna Instruments - Máy khuấy từ KIKA LABORTECHNIK RCT basic
- Màng thẩm tích Catalog D306 của hãng BioDesign, Mỹ
- Cột loại muối Sephadex G25 của hãng Amersham Pharmacia Biotech - Máy đo quang phổ IMPLEN nanophotometer P330
- Máy PCR PTC-100 Peltier Thermal Cycler - Máy ly tâm lạnh Sorvall Legend RT
- Máy ly tâm lạnh Biofuge fresco Heraeus
- Máy biến tính protein Techne Dri-blook DB 1M
- Hệ thống sắc ký tinh sạch protein FPLC AKTA của hãng Amersham pharmacia biotech.
- Thiết bị điện di đứng Mini Trans-Blot cell của hãng Bio-Rad - Thiết bị điện di ADN Mupid-2 Plus của hãng Advance
- Máy soi ADN - UV - Transilluminator
2.1.3. Hóa chất
- Cơ chất ARN nấm men tuýp VI của hãng Sigma Aldrich.
- Các hóa chất dùng để chiết rút RNase: H2SO4 0,25N; đệm PBS 0,1M pH 7,4
- Hóa chất dùng để tủa phân đoạn protein: (NH4)2SO4 của hãng Merck
- Nước UltraPure Distilled Water của hãng Invitrogen (free RNase, DNase). - Dung dịch RNase A nồng độ 10mg/ml
- Các hóa chất dùng định lượng protein theo phương pháp Bradford: Bradford Reagent của hãng Sigma (Coomassie brilliant blue G250, Ethanol,
H3PO4), dung dịch BSA 10mg/ml của hãng Merck
- Các hóa chất dùng chạy điện di SDS-page:
+ Các hóa chất pha gel cô và gel tách: Acrylamid 30%; Tris- HCl pH 8,8; Tris-HCl pH 6,8; Glycerol 50%; SDS 10%; APS 10%; TEMED của hãng Bio-rad
+ Sample buffer (Tris-HCl, Glycerol, SDS, 2-Mecaptoethanol, Bromophenol blue)
+ Marker Unstained protein MW #SM0431 của hãng Fermentas
+ Marker PageRuler Prestained protein #SM0671 của hãng Fermentas
+ Coomassie (Methanol, acetic acid, comassie brilliant blue, dH2O)
+ Dung dịch đệm Running buffer (Tris-HCl, Glycin, SDS, dH2O)
+ Dung dịch Destaining (Methanol, acid acetic, dH2O)
- Các hóa chất dùng chạy điện di ADN trên gel Agarose: Agarose 0,8%; đệm TAE (Tris-HCl, Acid acetic, EDTA); Loading dye; giấy parafilm; dung dịch Ethidium bromide.
- Các hóa chất dùng tinh sạch RNase bằng sắc ký trao đổi ion: Đệm amonium acetat 0,05 M pH 5,0; NaCl của hãng Merck
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết rút enzym
Môi trường chiết rút enzym có thể là: các dung dịch đệm Tris-HCl có pH trong vùng trung tính, đệm Citrat, dung dich H2SO4, các dung dịch saccaroza đẳng trương, ưu trương hay nhược trương. Tuỳ từng mục đích mà sử dụng môi trường chiết rút thích hợp [22].
Trong phạm vi của nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch H2SO4
0,25N và dung dịch đệm PBS 0,1M pH 7,4 để chiết rút RNase từ trứng cóc nhà/trứng ếch đồng. Dung dịch H2SO4 0,25N có tác dụng vô hiệu hoá các enzym thuỷ phân có trong lizosom (bào quan giàu enzym trong các tế bào động vật). Theo nhiều tài liệu thì dung dịch acid này đã được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để nghiền mô của động vật nhằm tách nhiều enzym trong đó có RNase [1, 22]. Dung dịch đệm PBS 0,1M có pH và thành phần ion (chứa K+, Na+) gần giống với điều kiện trong tế bào.
Trứng cóc nhà/trứng ếch đồng (10g) được nghiền bằng máy nghiền đồng
thể với 50 ml dung dịch H2SO4 0,25N (có pH 1,2) hoặc 50 ml dung dịch đệm
PBS 0,1M pH 7,4. Sau đó dịch nghiền được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C để loại cặn và thu dịch nổi, gọi là dịch chiết mô.
Dịch chiết trứng cóc nhà/ trứng ếch đồng trong dung dịch H2SO4 được
ký hiệu là DCTCa/DCTEa . Dịch chiết trứng cóc nhà/ trứng ếch đồng trong
dung dịch đệm PBS được ký hiệu là DCTCb/DCTEb.
2.2.2. Phương pháp thử tính bền nhiệt của RNase
Xử lý nhiệt là một phương pháp biến tính chọn lọc để loại bỏ những protein tạp kém bền nhiệt và giữ lại các protein bền nhiệt hơn bằng cách ly tâm. Đây là một trong những phương pháp làm sạch nhanh enzym rất hiệu quả trong trường hợp các enzym bền nhiệt, vì vậy nghiên cứu tính bền nhiệt của enzym không chỉ cho phép đánh giá khả năng sử dụng xử lý nhiệt để làm
sạch enzym, mà còn giúp cho việc thao tác với enzym trong quá trình thực nghiệm được thuận tiện.
Quá trình xử lý nhiệt được tiến hành như sau: Chuẩn bị 07 ống eppendorf 0,5ml chứa cùng một lượng thể tích 200 µl dịch chiết mô. Đem xử lý nhiệt các mẫu trên bằng cách sử dụng máy PCR để gia nhiệt trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C và 1000C. Sau đó các mẫu dịch được làm lạnh ngay bằng nước đá đang tan rồi ly tâm ở
tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ cặn, thu dịch ly tâm và
mang đi kiểm tra hoạt tính RNase còn lại bằng các phương pháp: - Định tính hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose
- Định lượng hoạt tính bằng đo OD260
Từ kết quả ta chọn được ống có hoạt tính tối ưu nhất (loại được nhiều protein tạp nhất nhưng vẫn giữ được hoạt tính).
Mẫu enzym ở 250C (t0 phòng) được dùng làm mẫu đối chứng để so sánh, hoạt tính của mẫu này được coi là 100%.
Từ các kết quả xử lý nhiệt có thể kết luận được tính bền với nhiệt của dịch chiết RNase trong acid và trong đệm PBS. Từ đó chọn được điều kiện nhiệt độ tối ưu để xử lý protein tạp đối với từng loại dịch chiết.
2.2.3. Phương pháp tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat
Tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat là một phương pháp rất phổ biến trong tách chiết tinh sạch để nghiên cứu tính chất của protein. Khả năng kết tủa của một protein phụ thuộc nhiều vào hình dạng và kích thước phân tử của nó. Muối amoni sulfat là một muối trung tính vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử keo làm cho phân tử protein kết tụ lại.
Để tìm vùng nồng độ muối tối ưu để tủa RNase từ dịch chiết trứng cóc nhà/ếch đồng chúng tôi tiến hành phương pháp tủa phân đoạn protein ở các
vùng nồng độ muối amoni sulfat bão hòa khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% và dịch chiết còn lại sau tủa 80%.
Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33] (Tính cho 5ml thể tích dịch chiết mô)
% nồng độ amoni sulfat bão hòa
Khối lượng amoni sulfat khan thêm vào
10% 0,280 g 20% 0,285 g 30% 0,295 g 40% 0,310 g 50% 0,315 g 60% 0,330 g 70% 0,345 g 80% 0,360 g Các bước tiến hành:
- Bổ sung rất từ từ amoni sulfat khan vào mẫu dịch, có khuấy từ nhẹ trên nước đá đang tan
- Để tiếp dịch trên đá trong 20 phút (không khuấy từ)
- Ly tâm lạnh ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, mẫu dịch
tách thành 2 phần dịch nổi và tủa. Rót phần dịch nổi vào ống Falcon sạch, phần tủa bảo quản lạnh.
- Bổ sung tiếp lượng muối theo nồng độ ở bảng trên vào dịch nổi và tiến hành các bước tương tự tới nồng độ muối cuối cùng
- Tủa ở các nồng độ muối khác nhau được hòa trở lại trong 1ml đệm PBS pH 7,4 (đối với trường hợp dùng đệm PBS để chiết rút) hoặc 1ml dung
dịch H2SO4 0,25N (đối với trường hợp dùng H2SO4 để chiết rút). Tất cả các
mẫu dịch này được mang đi thẩm tích loại muối. Đo hoạt tính các phân đoạn
hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ gel agarose, định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford). Từ đó chọn được phân đoạn protein có hoạt tính tốt nhất.
2.2.4. Định tính hoạt tính của RNase bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose gel agarose
Chuẩn bị gel Agarose 0,8%: Cân 0,8g Agarose, hòa tan bằng 100ml đệm TAE 1X (đun sôi). Dùng ống Falcon lấy ra 10ml gel Agarose nóng chảy, bổ sung thêm 50µl dung dịch ARN nồng độ 10mg/ml, trộn đều. Đổ gel Agarose đã trộn với ARN vào khuôn. Để khoảng 20 phút cho gel đông lại. Dùng ống hút đã khử trùng đục lỗ trên bản gel.
Bơm 10µl/mẫu vào các lỗ đã đục theo thứ tự đã đánh dấu trước.
• • • • • • • • • •
Hình 2.1. Thứ tự các lỗ đục trên gel Agarose
- Đối chứng (-): dung dịch H2SO4 0,25N hoặc đệm PBS 0,1M pH 7,4
tương ứng với từng loại mẫu
- Đối chứng (+): dung dịch RNase A nồng độ 0,1mg/ml
Ủ bản gel ở 370C trong 30 phút. Lấy bản gel ra nhuộm Ethidium bromid trong 7 phút, đem soi dưới ánh sáng tử ngoại.
2.2.5. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford
Nguyên tắc của phương pháp Bradford: các protein (có chứa các acid amin vòng thơm như tyrosin, tryptophan, phenylalanin) khi phản ứng với
250C 600C 500C 700C 400C 900C 1000C (-) 800C (+)
coomassie (coomassie brilliant blue - CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài mg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
- Xây dựng đường chuẩn albumin:
Từ dung dịch BSA gốc nồng độ 10 mg/ml pha loãng thành dãy nồng độ: 100µg/ml, 80µg/ml, 60µg/ml, 40µg/ml, 20µg/ml. Hút 100µl mỗi loại nồng độ BSA trộn đều với 1ml dung dịch thuốc nhuộm Bradford Reagent. Thiết bị đo quang phổ IMPLEN nanophotometer P330 cho phép tự động xây dựng đường chuẩn với chương trình Bradford cài sẵn. Phương trình đường
chuẩn có dạng: y = ax + b, giá trị độ lệch chuẩn R2 ≥ 0,96 cho phép kết quả
đo đạt độ chính xác từ 96% trở lên. - Đo mẫu:
Qua khảo sát, chúng tôi nhận thấy phải pha loãng mẫu cần đo 300 lần để có nồng độ protein tổng số nằm trong giới hạn cho phép của phép đo (mẫu phải có nồng độ protein tổng số ≤ 100µg/ml).
Hút 100µl/mẫu đã pha loãng trộn đều với 1ml dung dịch thuốc nhuộm Bradford Reagent. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất nên đo trong khoảng thời gian từ 2 đến 60 phút sau khi trộn mẫu với thuốc nhuộm Bradford Reagent để có kết quả chính xác nhất.
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính RNase
- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Độ hấp phụ (OD260) phụ thuộc vào nồng độ của ARN. Khi có mặt, RNase sẽ thuỷ phân ARN thành các oligonucleotide làm mật độ quang học tăng lên. Dựa vào sự
thay đổi OD260 ta đo được hoạt tính enzym.
- Một đơn vị (đv) hoạt tính RNase là lượng RNase xúc tác phản ứng thuỷ phân ARN tổng số trong những điều kiện tiêu chuẩn xác định làm tăng
mật độ quang học của dịch phản ứng (OD260) lên 0,01 đv OD sau thời gian phản ứng là 60 giây.
OD260 được đo trực tiếp trên máy quang phổ IMPLEN nanophotometer
P330 và hoạt tính RNase được tính theo công thức:
A = OD260 (E+S)tại 60s x 100 (đv hoạt tính)
Mẫu dùng để Blank chính là hỗn hợp phản ứng enzym + cơ chất tại thời điểm 0 giây.
Hoạt tính riêng của enzym (A0) được xác định bằng số đơn vị hoạt tính
của enzym/µg protein [1]. Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng phương pháp Bradford.
Trước khi đo hoạt tính RNase cần phải khảo sát sơ bộ động học của
enzym để xác định khoảng tuyến tính của OD260 (nghĩa là phải thỏa mãn điều
kiện giá trị OD260 tăng dần đều trong khoảng thời gian 60 giây kể từ khi trộn
dung dịch cơ chất với dung dịch enzym). Ưu điểm của thiết bị quang phổ