Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC’’ với các mục tiêu s

HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Vững - Viện Pháp y Quốc gia, TS Nguyễn Thị Thuận - giảng viên bộ môn Hóa dược- Trường ĐH Dược Hà Nội và ThS Vũ Đức Lợi- khoa Y Dược, ĐHQGHN, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Dược Trường Đại học Quốc gia

Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại trường

Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận Cám ơn các thầy cô trường Đại học Dược

Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lương Thị Phấn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Hợp chất strychnin……… 3

1.1.1 Công thức cấu tạo……… 3

1.1.2 Tính chất……… 3

1.1.3 Dược động học……… 3

1.1.4 Tác dụng……… 4

1.2 Hợp chất brucin……… 4

1.2.1 Công thức cấu tạo……… 4

1.2.2 Tính chất……… 4

1.2.3 Dược động học……… 4

1.2.4 Tác dụng……… 5

1.3 Nguồn gốc của strychnin và brucin……… 5

1.3.1 Tên khoa học……… 5

1.3.2 Thành phần hóa học……… 5

1.3.3 Công dụng của mã tiền……… 5

1.4 Phương pháp định lượng strychnin và brucin……… 6

1.5 Phương pháp HPLC……… 9

1.5.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao……… 9

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký……… 10

1.5.3 Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký……… 10

1.5.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký……… 10

1.5.5 Ứng dụng của phương pháp HPLC……… 11

1.6 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương……… 12

1.6.1 Tủa protein……… 12

1.6.2 Chiết lỏng- lỏng……… 12

1.6.3 Chiết pha rắn……… 13

1.7 Thẩm định phương pháp định lượng……… 13

1.7.1 Tính thích hợp hệ thống……… 13

1.7.2 Độ chọn lọc……… 13

1.7.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……… 13

1.7.4 Giới hạn định lượng dưới……… 14

1.7.5 Độ đúng……… 14

1.7.6 Độ chính xác……… 14

1.7.7 Hiệu suất chiết……… 14

1.7.8 Độ ổn định……… 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị……… 15

2.1.1 Nguyên vật liệu……… 15

2.1.2 Trang thiết bị , dụng cụ……… 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 15

2.2.1 Chuẩn bị các mẫu huyết tương……… 15

2.2.2 Xác định điều kiện sắc ký……… 17

2.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương……… 18

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích……… 19

2.2.5 Phương pháp xử lý kết quả……… 22

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 23

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC………

23 3.1.1 Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp 23

3.1.2 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương……… 26

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích……… 28

3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống……… 28

3.2.2 Độ đặc hiệu- chọn lọc……… 29

3.2.3 Đường chuẩn- khoảng tuyến tính……… 31

3.2.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……… 33

3.2.5 Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày……… 34

3.2.6 Hiệu suất chiết……… 37

3.2.7 Độ ổn định của mẫu huyết tương……… 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 42

1 Kết luận……… 42

2 Kiến nghị……… 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHƯ VIẾT TẮT

Spectrometry)

Chromatography)

HPLC/DAD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector diod array (High Performance

Liquid Chromatography/Diode Array Detection)

Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)

Liquid Chromatography/Ultraviolet)

Spectrometry)

MeOH : Methanol

r : Hệ số tương quan

RP-HPLC : Ngược pha sắc ký lỏng hiệu năng cao (Reversed Phase- High

Performance Liquid Chromatography)

Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin 6

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 28

Bảng 3.2a: Sự tương quan giữa nồng độ strychnin trong HT và tỷ lệ

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết IS (900ng/ml) 37

Bảng 3.7a: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ST 38

Bảng 3.7b: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết BR 39

Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ

đông-rã

39

Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu HT thời gian ngắn 40

Bảng 3.10: Kết quả ổn định mẫu huyết tương thời gian dài 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1: Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch ST và BR 1000 ng/ml

trong dung môi ACN:Đệm pH9 (38:62)

23

Hình 3.2: SKĐ với tỷ lệ pha động ACN: Đệm pH9 (38:62) 24

Hình 3.3: SKĐ dung dịch chuẩn nội ibuprofen trong pha động 25

Hình 3.4: SKĐ dug dịch chuẩn nội cloramphenicol trong pha động 25

Hình 3.5: SKĐ dung dịch chuẩn nội cafein trong pha động 25

Hình 3.6: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng MeOH 26

Hình 3.7: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng ACN 26

Hình 3.8: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng acid

Hình 3.12a: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ

ST trong HT và tỷ lệ diện tích pic ST/IS

31

Hình 3.12b: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ

BR trong HT và tỷ lệ diện tích pic BR/IS

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mã tiền (Semen Strychni) là một vị thuốc quý được sử dụng từ lâu trong cả đông

y và tây y Vị thuốc này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như: Dược điển Trung Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980… Mã tiền được

chế từ hạt chín phơi hay sấy khô của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica)

Vị thuốc này đã được y học dân gian Trung Quốc sử dụng hiệu quả trong giảm bớt tình trạng viêm, đau khớp, triệu chứng dị ứng và điều trị các bệnh thần kinh Tuy nhiên do độc tính của hạt rất cao nên không được phép sử dụng trực tiếp mà phải qua chế biến Alcaloid được biết đến là thành phần thể hiện hoạt tính sinh học của loài cây này, trong đó strychnin và brucin là hai alcaloid có nhiều nhất trong hạt mã tiền và có ảnh hưởng quan trọng đến tác dụng cũng như độc tính của hạt Một mặt, Strychnin và brucin có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư, nhưng bên cạnh đó chúng có thể dẫn tới các rối loại vận động, tăng trương lực cơ, tăng hoạt động cảm giác, ở liều cao có thể gây co giật hệ thống thần kinh trung ương và dẫn đến tử vong do liệt hô hấp, liệt cột sống hoặc ngừng tim Ngoài ra, strychnin còn được sử dụng làm thuốc diệt chuột và một số loài động vật gặm nhấm Nó cũng được biết đến là một trong những chất đầu tiên được sử dụng để nâng cao hiệu suất trong thể thao Strychnin tác dụng chọn lọc và đối kháng cạnh tranh với glycin trên receptor glycin ở tủy sống Liều cao tác động cả lên receptor glycin ở não Ngộ độc strychnin có thể gây tử vong cho người

và động vật [12][30][23]

Brucin cũng là một alcaloid mà từ lâu được sử dụng như một loại thuốc truyền thống

để điều trị ung thư biểu mô tế bào gan Nó còn được chứng minh có hiệu quả giảm đau

và chống viêm Độ độc của brucin thấp hơn strychnin nhưng cũng có thể gây co giật hệ thống thần kinh ngoại biên Do có độc tính mạnh như vậy nên phạm vi sử dụng hai chất này bị giới hạn đáng kể và được kiểm soát chặt chẽ bởi pháp luật ở nhiều nước

trên thế giới Mặc dù vậy vẫn có những trường hợp ngộ độc strychnin được phát hiện,

nguyên nhân có thể do bị nhầm lẫn, đầu độc hoặc tự sát [41] [35]

Đây là hai thành phần có độc tính rất mạnh, chỉ với một liều lượng nhỏ cũng có thể gây nguy hiểm đến tính mạng con người Do vậy để giúp cho việc chẩn đoán, phát hiện nhanh nguyên nhân gây độc và có biện pháp cấp cứu kịp thời, nâng cao hiệu quả cứu chữa nạn nhân cũng như phục vụ cho công tác pháp y thì đòi hỏi phải có phương pháp phân tích nhanh các mẫu bệnh phẩm Vì vậy việc xác định hai alcaloid này là vô cùng quan trọng trong giám định độc chất

Trong những năm gần đây, trên thế giới có nhiều phương pháp được đề xuất để xác định strychnin và brucin trong dịch sinh học như: HPLC/DAD[14], HPLC/MS[32], LS-ESI-MS[42], HPLC-UV[15], UPLC-MS/MS[41]… Tuy nhiên những phương pháp này chưa phù hợp với tình hình thực tế tại Việt Nam Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC’’ với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương chuột bằng HPLC

2 Thẩm định phương pháp định lượng strychnin và brucin vừa xây dựng

Một vài phút sau khi uống, strychnin được bài tiết không đổi trong nước tiểu, và chiếm khoảng 5% một liều gây chết trong vòng hơn 6 giờ Thuốc được thải trừ chủ yếu qua thận và gần như hoàn toàn trong 48 đến 72 giờ [13][26][28]

1.1.4 Tác dụng

Đối với thần kinh trung ương và ngoại vi có tác dụng kích thích với liều nhỏ, và tác dụng co giật với liều cao Làm tăng biên độ và tần số hô hấp, tăng tuần hoàn khi các trung tâm này bị ức chế Liều độc kích thích mạnh tủy sống làm tăng phản xạ và gây cơn co giật giống như co giật do uốn ván [10][12]

1.2.3 Dược động học

Thí nghiệm trên chuột cho thấy: sau khi uống brucin được hấp thu nhanh (Tmax

< 0,5h) Sự gia tăng AUC cho thấy tỷ lệ thuận với sự gia tăng liều Sinh khả dụng đường uống (F) không thay đổi theo liều Giá trị Cmax được tính toán là 0,73±0,23

µg/ml.[16][17][27]

1.2.4 Tác dụng

Brucin có tác dụng tương tự strychnin nhưng yếu hơn Nó gây liệt dây thần kinh ngoại biên và tạo ra cơn co giật dữ dội Brucin có thể gây buồn nôn, nôn, phấn khích, co giật và co giật với liều lượng lớn Ngoài ra brucin còn có tác dụng giảm đau, chống viêm và chống ung thư [29][40]

1.3 Nguồn gốc của strychnin và brucin

Strychnin và brucin là hai thành phần alcaloid trong hạt Mã tiền có độc tính và tác dụng sinh học mạnh

* Một số đặc điểm của cây Mã tiền

1.3.3 Công dụng của mã tiền

Trừ phong thấp, hoạt lạc, thông kinh, giảm đau, dùng trong các bệnh phong thấp hoặc mạn tính Mạnh gân cốt, dùng trong các trường hợp gân và cơ tê đau, cơ thể suy nhược, đau nhức thần kinh ngoại biên Khứ phong chỉ kinh, dùng trong các bệnh kinh giản, co quắp, chân tay bị quyết lạnh Tán ứ, tiêu thũng, dùng trong các bệnh ung độc hoặc chấn thương cơ nhục sưng tấy [11]

1.4 Phương pháp định lượng strychnin và brucin

Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định lượng strychnin và brucin trong dịch sinh học cũng như trong dược liệu Qua tham khảo một

số tài liệu, chúng tôi thấy có các phương pháp định lượng như sau:

Bảng 1.4.1: Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin

ThermoHyper-mm ×4,6 ThermoHyper-mm i.d, 5µm)

-Pha động: acetonitril trong đệm phosphat 20 mM pH 3,8

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Nhiệt độ cột: 358°C

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

- Thể tích tiêm: 100 µl -Chất chuẩn nội: Chloroquin -Phương pháp xử lý mẫu: chiết lỏng-lỏng

2 32 Dịch

chiết từ côn trùng

HPLC/

MS

Phenomenex Luna C18 (150 mm×2,0 mm, 5µm)

-Pha động: MeOH 10% : acid acetic 90%

-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút -Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

- Bước sóng phát hiện: 254 nm -Thể tích tiêm: 10µl

3 43 Bột dược

liệu

ESI/MS

HPLC-Zorbax Bonus

RP (150 mm×2,1 mm, 5µm)

-Pha động: acetonitril- amoni acetat

20 mM thay đổi từ 30-70% đến

70-30 % trong 70-30 phút -Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút -Nhiệt độ cột: 40°C -Bước sóng phát hiện: 254 nm

-Thể tích tiêm: 5µl

4 42 Huyết

tương chuột

LC-ESI-MS

Waters SymmetryTM

C18 (100 mm×4,6 mm, 5µm)

-Pha động: methanol-amoni format 20mM- acid formic (32:68:0,68, v:v:v)

-Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

- Nhiệt độ cột: 30°C -Thể tích tiêm: 10µl -Chất chuẩn nội: tacrin -Phương pháp xử lý mẫu: chiết lỏng-lỏng

mm, 5µm)

-Pha động: 24% acetonitril- 76% đệm (hỗn hợp đẳng cực của 0,01 mol/l natri sulfonat heptan và 0,02 mol/l kali dihydrogen phosphat giá trị pH 2,8 bằng acid phosphoric 10

%) -Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút -Nhiệt độ cột: 35°C -Bước sóng phát hiện: 264 nm -Chuất chuẩn nội: hyperzin A -Phương pháp xử lý mẫu: chiết lỏng-lỏng

-Thể tích tiêm: 20µl

6 41 Huyết

tương chuột

MS/MS

UPLC-BEH C18 (50 mm×2,1 mm i.d, 1,7 µm)

-Pha động: methanol: acid formic 0,1 % (25:75, v/v)

-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút -Nhiệt độ cột: 40°C

-Thể tích tiêm: 2 µl

- Chất chuẩn nội: moclobemide

-Pha động: acetonitril và acid acetic

1 % trong nước

-Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm: 50 µl -Chất chuẩn nội: nalorphin -Phương pháp xử lý mẫu: chiết lỏng-lỏng

(12,5m×0,2m

m i.d, 0,33µm film thickness)

GC -Phun: chia tiêm (1:10) -Khí mang: Helium (1ml/phút) -Nhiệt độ phun: 250°C

-Nhiệt độ giao diện MS: 280°C -Nhiệt độ lò: 170°C

MSD -Chế độ ion hóa: EI (70ev) -Nhân điện tử: 2000 V

9 30 Máu và

nước tiểu

ESI-MRM

HPLC-XBridgeTMShield RP 18 (250 mm×3,0

mm i.d, 5µm)

-Pha động: acetonitril và amoni bicarbonat 10mmol/l (dung dịch nước ammoniac được dùng để điều chỉnh pH 10,5)

-Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút -Nhiệt độ: 35°C

-Bước sóng phát hiện: 235 nm -Thể tích tiêm: 10µl

-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha rắn

10 38 Máu RP- HPLC XTerra TM RP

18 (150mm×4,6m

-Pha động: 10mM amoni bicarbonat (điều chỉnh pH 10 với amoni hydroxid)/acetonitril (70:30,

m, 5µm) v:v)

-Tốc độ dòng: 1 ml/phút -Nhiệt độ: 30°C

-Thể tích tiêm: 10µl -Bước sóng phát hiện: 254 nm -Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha rắn

-Chất chuẩn nội: gelsemine

11 35 Máu,

nước tiểu, gan, não

MS/MS

LC-Phenomenex Luna (50mm×4,6

mm, 5µm)

-Pha động: amoni acetat 10 mM và acid acetic 0,1% (pH 3,2) và hỗn hợp của nước/methanol (95:5, v:v) -Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha rắn

12 18 Máu,

nước tiểu

ESI-MS/MS

HPLC-BDS HYPERSIL C18 (150mm×2,1m

m , 2,4 µm)

-Pha động: 10 mmol/l amoni format trong nước với acid formic 0,1% -Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút -Nhiệt độ: 40°C

Nhận xét: Phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương

bằng GC/MS, UPLC-MS, HPLC-ESI, LC-ESI-MS, khá phức tạp, tốn kém và chưa phù hợp với đa số phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vây, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC/UV đơn giản, có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm của Việt Nam hiện nay

1.5 Phương pháp HPLC

1.5.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp Sắc ký lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học ở bề mặt [1] [2]

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc

ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây

là tổng các tương tác:

- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1)

- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2)

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3)

Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [1], [2]

1.5.3 Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký

- Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường kính

cỡ hạt từ 3-10 µm

Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và chính xác tốt, cỡ hạt phải đồng nhất

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) Pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và được sử dụng nhiều nhất

1.5.4.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc

ký của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phân tích định lượng: thường dựa vào chiều cao hay diện tích píc và dựa trên

cơ sở của phương pháp chuẩn ngoại hoặc chuẩn nội, hoặc thêm chuẩn

• Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó so sánh trực tiếp chiều cao hay diện tích píc của mẫu thử với mẫu chuẩn

• Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội

• Phương pháp thêm chuẩn: Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ và độ tăng của diện tích Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm chuẩn [1][2][6]

1.6 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương

1.6.1 Tủa protein

Tủa protein được sử dụng rộng rãi trong xử lý các mẫu sinh học, loại bỏ các tạp protein trong huyết tương khỏi các thành phần chất tan khác Cơ chế của tủa protein là thay đổi sự solvate hóa của dung môi làm giảm khả năng tan trong huyết tương của các protein Có thể gây tủa protein cho huyết tương bằng nhiều cách:

 Tủa protein bằng muối: thường là muối trung tính như amoni sulfat

 Tủa protein tại điểm đẳng điện (pI)

 Tủa protein với dung môi hữu cơ: như methanol hoặc ethanol

 Ngoài ra còn có thể tủa protein bằng các cách khác như: dùng các polymer ưa nước không ion hóa như dextran, polyethylene glycol, tủa bằng các ion kim loại đa hóa trị như Fe2+…[3]

1.6.2 Chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction)

Chiết lỏng-lỏng là phương pháp tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chất tan trong hai chất lỏng không thể hòa trộn vào nhau, thường là nước và một dung

môi hữu cơ Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết lỏng-lỏng, có thể sử dụng các thông số sau:

 Hệ số phân bố

 Hệ số tách

 Hệ số khử tạp [3]

1.6.3 Chiết pha rắn (solid – phase extraction)

Chiết pha rắn là phương pháp tách các chất dựa vào ái lực của chất tan với pha động khi cho pha động chạy qua pha tĩnh Pha tĩnh trong chiết pha rắn thường gồm silica gắn với một nhóm chức đặc biệt [3]

Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp chiết như trên.Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không kinh tế nên chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein và chiết lỏng-lỏng

để xử lý mẫu huyết tương

1.7.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều

cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất có đáp ứng tuyến tính.[8]

1.7.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn định lượng dưới của một quy trình phân tích là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp [36][21]

1.7.7 Hiệu suất chiết

Là tỷ lệ thu hồi hoạt chất sau khi mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách [36][21]

1.7.8 Độ ổn định

Các nghiên cứu độ ổn định bắt buộc phải có đối với một quá trình, phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học bao gồm:

- Độ ổn định 3 chu kỳ đông-rã đông

- Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

- Độ ổn định sau khi xử lý mẫu, chiết tách hoạt chất

- Độ ổn định dài ngày.[8]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chất chuẩn strychnin hàm lượng 99,2%

- Chuất chuẩn brucin hàm lượng 98,9%

- Huyết tương chuột nhắt trắng, Bộ môn Dược lý- Đại học Y Hà Nội cung cấp

2.1.1.2 Hóa chất

- Methanol, acetonitril dùng cho HPLC, acid percloric, ethylacetat, cloroform (hãng grade- Merck), acid H3PO4, KOH, K2HPO4, ibuprofen, cafein, cloramphenicol đạt tiêu chuẩn PA (Merck)

- Nước cất 2 lần

2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX Ultimate 3000- detector Diode Array

- Máy quang phổ UV- VIS Cary 60

- Máy siêu âm Utrasonic cleaner- MRC

- Máy đo pH AL 20 pH- Aqualitic

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC

- Máy lắc xoay điện Velp- Zx3

- Cân phân tích AUW 220

- Máy khuấy từ: RO15 POWER- KiKa- Werke

- Tủ lạnh âm sâu Biomedical Freezer MDF- U334

- Bình định mức, cốc có mỏ, pipet, micro pipet, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45 µm, bơm tiêm, lọ đựng mẫu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị các mẫu huyết tương

- Mẫu huyết tương trắng: Huyết tương không chứa ST và BR, để bảo quản trong tủ lạnh sâu (-20°) Để rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Dung dịch gốc strychnin (SST): Cân chính xác khoảng 20mg ST, hòa tan trong MeOH sau đó cho vào bình định mức 100 ml và thêm MeOH đến vạch, được dung dịch ST trong MeOH có nồng độ khoảng 0,2mg/ml, để bảo quản trong tủ lạnh sâu (-20°C) Để

rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Dung dịch gốc brucin (SBR): Cân chính xác khoảng 20mg BR, hòa tan trong MeOH sau đó cho vào bình định mức 100 ml và thêm MeOH đến vạch, được dung dịch BR trong MeOH có nồng độ khoảng 0,2mg/ml, để bảo quản trong tụ lạnh sâu (-20°C) Để

rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Từ 2 dung dịch gốc này ta pha thành các dung dịch sau:

- Mẫu ST và BR chuẩn trong huyết tương có nồng độ ST và BR lần lượt là 3600ng/ml

và 3600ng/ml, để bảo quản trong tủ lạnh sâu (-20°C) Để rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Mẫu huyết tương tự tạo chứa ST và BR: Từ dung dịch huyết tương chuẩn ST và BR trên, thêm huyết tương trắng, lắc đều được các mẫu ST và BR trong huyết tương có nồng độ khoảng từ 40- 1800ng/ml (tương ứng với khoảng nồng độ ST và BR từ 1/30- 1/20 Cmax đến 2-3 Cmax)

- Dung dịch chuẩn nội: cân chính xác khoảng 20mg chất chuẩn nội cho vào bình định mức 100ml, thêm MeOH đến vạch, lắc đều được dung dịch nồng độ 0,2mg/ml, để bảo quản trong tủ lạnh sâu (-20°C) Để rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn nội gốc nồng độ 45µg/ml

- Mẫu kiểm chứng (QC): Chuẩn bị tương tự mẫu chuẩn nhưng từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu chuẩn Mẫu QC gồm 3 loại:

+ Mẫu LQC có nồng độ ≤ 3 lần nồng độ LLOQ

+ Mẫu MQC có nồng độ gần điểm giữa của đường chuẩn

+ Mẫu HQC có nồng độ bằng 75- 80% ULOQ

2.2.2 Xác định điều kiện sắc ký

Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống sắc ký DIONEX sử dụng cột C18 với các pha động có thành phần có tỷ lệ khác nhau Từ kết quả khảo sát lựa chọn những điều kiện sắc ký phù hợp để có thể tiến hành định lượng strychnin và brucin trong huyết tương chuột bằng HPLC với detector Diode Array

 Bước sóng

Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện strychnin và brucin, chúng tôi tiến hành quét phổ UV trên máy quang phổ UV-VIS Cary 60 dung dịch strychnin và brucin chuẩn có nồng độ khoảng 1000 ng/ml Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này với dải sóng từ 200-500 nm, cuvet thạch anh dày 1cm, mẫu trắng là dung môi pha động

 Pha động:

Trong phương pháp HPLC pha động hay dùng nhất là methanol, acetonitril, nước hay hỗn hợp của chúng Chúng tôi tiến hành sắc ký mẫu strychnin và brucin chuẩn với một số hệ dung môi như sau:

lý mẫu, người ta thường thêm chất nội vào mẫu chuẩn và mẫu thử Dựa trên yêu cầu chung của chất chuẩn nội và tham khảo các tài liệu cùng kinh nghiệm thực tiễn, chúng