- Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy xác định bằng phần mềm Microsolf Excel 2013.
- Nồng độ ST và BR trong huyết tương được xác định dựa vảo phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa điện tích pic và nồng độ ST và BR trong mẫu chuẩn được xây dựng trong mỗi ngày phân tích.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC
3.1.1. Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp
Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của strychnin và brucin, kết hợp với các tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC pha đảo, sử dụng cột sắc ký Acclaim C18 (4,6x150mm; 5µm). Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như: lựa chọn bước sóng, pha động, pH của hệ đệm, tốc độ dòng, chất chuẩn nội.
3.1.1.1. Lựa chọn bước sóng thích hợp
Sau khi quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch với dải sóng từ 200-500 nm, kết quả thu được ghi ở hình 3.1.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch ST và BR 1000 ng/ml trong dung môi ACN:Đệm pH9 (38:62).
Nhận xét: Phổ hấp thụ của dung dịch ST và BR chuẩn 1000ng/ml cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 260 nm trong hệ dung môi pha động ACN: Đệm K2HPO4 1M pH9 (38:62). Vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 260nm để khảo sát định lượng 2 chất này.
3.1.1.2. Khảo sát chọn thành phần pha động
Sau khi chạy sắc ký với các hệ pha động như trên, kết quả ở hình 3.2 cho thấy hệ dung môi ACN: Đệm pH9 (38:62) là hệ dung môi cho thời gian lưu thích hợp, pic cân xứng
nhất, đáp ứng pic tốt và thời gian lưu của ST và BR lần lượt là 5,56 và 4,23 phút. Do đó chúng tôi chọn hệ dung môi này trong các nghiên cứu tiếp theo.
Để có cơ sở tốt hơn khi lựa chọn pH của đệm, chúng tôi chạy sắc ký mẫu ST và BR chuẩn trong pha động trên với các pH đệm là: pH5, pH9, pH10 cho kết quả với đệm pH9 cho đáp ứng pic tốt nhất và pic cân đối (AF= 1,4), thời gian lưu phù hợp, với đệm pH5 đáp ứng pic kém hơn và pic doãng hơn (hệ số bất đối AF=2,1), với hệ đệm pH 10 pic bị doãng (AF= 1,9). Vậy chúng tôi chọn hệ đệm pH9.
Hình 3.2: SKĐ với tỷ lệ pha động ACN: Đệm pH9 (38:62). 3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Qua kết quả thực nghiệm, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký với tốc độ dòng 0,6 ml/phút, 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút và nhận thấy: Với tốc độ dỏng 0,6 ml/phút pic bị kéo đuôi. Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút pic xuất hiện sớm, dễ bị trùng với các tạp trong huyết tương. Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút cho pic gọn, khá cân đối, thời gian lưu thích hợp nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn tốc độ dòng là 0,8 ml/phút để tiến hành sắc ký.
3.1.1.4. Khảo sát chất chuẩn nội (IS)
Sau khi tiến hành khảo sát chọn chuẩn nội với các chất là: Ibuprofen, cafein, cloramphenicol, thu được kết quả như sau:
BR
Hình 3.3: SKĐ dung dịch chuẩn nội ibuprofen trong pha động
Hình 3.4: SKĐ dung dịch chuẩn nội cloramphenicol trong pha động
Hình 3.5: SKĐ dung dịch chuẩn nội cafein trong pha động
Qua kết quả trên cho thấy thời gian lưu của ibuprofen là 3,12 phút, của cloramphenicol là 2,20 phút, của cafein là 2,61 phút. Mặt khác pic của cả 3 chất đều cân xứng, đáp ứng pic tốt. Tuy nhiên với mẫu huyết tương thường có pic tạp chất ra ở khoảng 0- 3 phút, đồng thời ibuprofen đáp ứng các yêu cầu chung của chuẩn nội. Do vậy chúng tôi quyết định chọn ibuprofen làm chuẩn nội để khảo sát tiếp.
Từ kết quả khảo sát, chúng tôi sơ bộ lựa chọn điều kiện sắc ký như sau để tiếp tục nghiên cứu xây dựng phương pháp xử lý, chiết tách ST và BR trong mẫu huyết tương: - Cột sắc ký C18: Acclaim C18 (4,6×150mm; 5µm).
- Pha động: ACN: Đệm kali hydrophosphat 1M( điều chỉnh về pH= 9) tỷ lệ 38:62 v/v. - Thể tích tiêm: 20 µl.
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm. - Chất chuẩn nội: ibuprofen.
3.1.2. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương
Tiến hành khảo sát mẫu huyết tương theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.3, kết quả thu được như sau:
So sánh giữa mẫu huyết tương có kiềm hóa bằng NaOH 1M và mẫu không được kiềm hóa thì mẫu huyết tương không kiềm hóa cho đáp ứng pic của strychnin và brucin không cân xứng, diện tích pic nhỏ.
Trong khi với mẫu huyết tương có kiềm hóa thì đáp ứng pic cân xứng, diện tích, chiều cao pic lớn hơn. Do vậy quy trình xử lý mẫu huyết tương cần phải kiềm hóa.
Hình 3.6: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng MeOH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.7: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng ACN
IS IS BR BR ST ST
Hình 3.8: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng acid percloric
Hình 3.9: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã được chiết lỏng- lỏng bằng chloroform
Hình 3.10: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã chiết lỏng –lỏng bằng ethylacetat
Kết quả khảo sát các quy trình xử lý mẫu huyết tương trên mẫu huyết tương tự tạo cho thấy: Tác nhân gây tủa là MeOH hoặc ACN phải cần một lượng dung môi gấp 1,5 lần thể tích huyết tương mới có thể tủa được lượng protein có trong 2ml mẫu nên làm giảm giá trị phát hiện và định lượng của phương pháp. Tác nhân gây tủa acid percloric do chỉ cần một lượng nhỏ (400µl) để gây tủa lượng protein có trong huyết tương nên mẫu không bị pha loãng, quá trình được tiến hành nhanh, đơn giản, kết quả sắc ký đồ vẫn đảm bảo các chất tách hoàn toàn, hình dạng pic cân xứng, chiều cao, diện tích pic và thời gian lưu của ST, BR, IS phù hợp. Khi sử dụng dung môi chiết là chloroform và ethylacetat cho kết quả: pic còn lẫn nhiều tạp, diện tích pic nhỏ, đường
IS IS IS BR BR BR ST ST ST
nền nhiễu, tiến hành phức tạp. Do đó chúng tôi lựa chọn phương pháp tủa protein bằng ạcid percloric để xử lý mẫu.
Như vậy, chúng tôi đã lựa chọn được quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký có khả năng tách riêng pic của ST, BR và IS khỏi các pic tạp có trong mẫu huyết tương như sau:
- Quy trình xử lý mẫu:
Lấy chính xác 2,0ml huyết tương + 50µl dung dịch chuẩn nội gốc 45µg/ml + 400µl acid percloric 1N + 50µl dung dịch NaOH 1M (kiềm hóa). Lắc xoáy trong 15 giây. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút. Lọc toàn bộ dịch qua màng lọc 0,45 µm, đem phân tích HPLC.
- Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký Acclaim C18 (4,6×150mm; 5µm)
- Detector Diode Array: λ = 260 nm
- Pha động: ACN: Đệm kali hydrophosphat 1M (điều chỉnh về pH = 9,0 bằng KOH 2M hoặc H3PO4 1M) tỷ lệ 38:62 v/v.
- Thể tích tiêm: 100 µl. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng. - Nội chuẩn: ibuprofen nồng độ 900ng/ml.
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống
Tiêm 6 lần mẫu chuẩn pha trong pha động vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
Lần tiêm tr ST tr BR tr IS SST/IS SBR/IS
1 5,56 4,23 3,12 1,786 0,902
2 5,52 4,21 3,06 1,779 0,908
4 5,53 4,19 3,14 1,790 0,906
5 5,56 4,25 3,15 1,802 0,923
6 5,55 4,18 3,11 1,768 0,915
TB 5,548 4,21 3,11 1,789 0,911
RSD% 0,35 0,62 1,11 0,85 0,81
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic ST và BR đều nhỏ hơn 2%, các giá trị của hệ số bất đối xứng nằm trong khoảng cho phép. Điều này chứng tỏ hệ thống HPLC này phù hợp cho phép phân tích định lượng strychnin và brucin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2. Độ đặc hiệu- chọn lọc
Tiến hành phân tích các mẫu HT trắng, (mẫu HT ST, BR gần giới hạn định lượng), mẫu HT chứa IS nồng độ 900ng/ml, mẫu HT chứa ST, BR và IS theo phương pháp đã xây dựng. SKĐ mẫu HT trắng, mẫu HT chứa IS, mẫu HT chứa ST, mẫu HT chứa BR và IS được trình bày ở hình 3.11a, 3.11b, 3.11c và 3.11d, 3.11 e.
Hình 3.11a: SKĐ mẫu HT trắng
Hình 3.11b: SKĐ mẫu HT có IS
Hình 3.11c: SKĐ mẫu HT có ST
Hình 3.11d: SKĐ mẫu HT có BR
Hình 3.11 e: SKĐ mẫu HT có ST, BR và IS
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy mẫu HT có IS xuất hiện pic tại thời gian lưu là 3,1 phút; mẫu HT có ST có pic xuất hiện tại thời gian lưu là 5,5 phút; mẫu HT có BR xuất hiện pic tại thời gian lưu là 4,2 phút; trong khi đó thì mẫu HT trắng tại các thời gian lưu trên không thấy xuất hiện pic. Mặt khác trên sắc ký đồ mẫu HT chứa đồng thời IS, BR và ST thì thấy xuất hiện 3 pic tách khỏi các thành phần tạp trong mẫu và có thời gian lưu là 3,1; 4,2 và 5,5 phút trùng với thời gian lưu của IS, BR và ST trong các mẫu HT chứa riêng từng thành phần này. Do đó phương pháp có tính đặc hiệu- chọn lọc đối với ST và BR.
ST
BR
3.2.3. Đường chuẩn- Khoảng tuyến tính (40-1800ng/ml)
Tiến hành phân tích các mẫu HT chuẩn chứa ST và BR có nồng độ từ 40-1800 ng/ml theo phương pháp đã xây dựng. Thiết lập mối quan hệ tương quan giữa nồng độ ST với tỷ lệ đáp ứng pic ST/IS, giữa nồng độ BR với tỷ lệ đáp ứng pic BR/IS, xác định phương trình hồi quy, hệ số tương quan r. Tính lại các nồng độ theo đường chuẩn xây dựng được để xác định độ đúng của nồng độ tìm lại. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.2a và 3.2b.
Bảng 3.2a: Sự tương quan giữa nồng độ strychnin trong HT và tỷ lệ đáp ứng pic strychnin/IS (Nồng độ HT ST chuẩn 3620ng/ml để pha thành các dd HT tự tạo; BR 3628 ng/ml)
C ng/ml
S (mAU.min) C xác định từ đường chuẩn
ST IS ST/IS ng/ml So với giá trị
thực (%) 45,2 0,623 6,863 0,091 46,188 102,2 90,5 1,203 6,924 0,174 87,672 96,9 181,0 2,385 6,903 0,346 173,55 95,9 452,5 6,301 6,805 0,926 463,77 102,5 905,0 12,389 6,910 1,793 897,25 99,1 1810,0 24,863 6,897 3,605 1803,3 99,6 .
Hình 3.12a: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ ST trong HT và tỷ lệ diện tích pic ST/IS
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ ST từ 45,2 đến 1810,0ng/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ ST và tỷ lệ diện tích pic ST/IS (phương trình hồi quy tuyến tính có hệ số tương quan gần bằng 1). Độ đúng của các nồng độ tìm lại nằm trong khoảng 85-115%. Như vậy, đường chuẩn và khoảng tuyến tính thích hợp để định lượng ST trong mẫu huyết tương.
Bảng 3.2b. Sự tương quan giữa nồng độ brucin trong HT và tỷ lệ đáp ứng pic brucin/IS
C ng/ml
S (mAU.min) C xác định từ đường chuẩn
BR IS BR/IS ng/ml So với giá trị
thực (%) 45,3 0,238 6,863 0,035 53,9 118,9 90,7 0,574 6,924 0,083 102,1 112,6 181,4 1,249 6,903 0,181 200,1 110,3 453,5 3,018 6,805 0,444 462,7 102,2 907,0 6,228 6,910 0,901 920,5 101,5 1814,0 13,056 6,897 1,893 1912,2 105,4
Hình 3.12b: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ BR trong HT và tỷ lệ diện tích pic BR/IS.
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ ST từ 45,3 đến 1814,0ng/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ BR và tỷ lệ diện tích pic BR/IS (phương trình hồi quy có hệ số tương quan gần bằng 1). Độ đúng của các nồng độ tìm lại nằm trong khoảng từ 85-
115%. Độ đúng của điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn nằm trong khoảng 80- 120%. Như vậy đường chuẩn và khoảng tuyến tính thích hợp để định lượng BR trong mẫu huyết tương.
3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Phân tích các mẫu HT trắng và các mẫu HT có nồng độ ST và BR thấp nhất trong khoảng tuyến tính (ST: 45,2ng/ml, BR: 45,3ng/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 3.3a và 3.3b.
Bảng 3.3a. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của strychnin (LLOQ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT HT trắng Diện tích (mAU*min) Mẫu HT chuẩn ST (mAU*min) IS (mAC*min) Nồng độ tìm thấy (ng/ml) Độ đúng (%) Đạt/ Không đạt 1 0,002 0,623 6,863 46,2 102,2 Đạt 2 0,003 0,605 6,858 44,9 99,4 Đạt 3 0,005 0,614 6,814 45,9 101,4 Đạt 4 0,004 0,621 6,806 46,4 102,7 Đạt 5 0,007 0,617 6,836 45,9 101,6 Đạt 6 0,002 0,609 6,843 45,3 100,2 Đạt TB 101,3 Đạt RSD (%) 1,2 Đạt
Bảng 3.3b. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của brucin (LLOQ)
STT HT trắng Diện tích (mAU*min) Mẫu HT chuẩn BR (mAU*min) IS (mAC*min) Nồng độ tìm thấy (ng/ml) Độ đúng (%) Đạt/ Không đạt 1 0,002 0,210 6,863 49,8 109,9 Đạt 2 0,003 0,207 6,854 49,4 109,1 Đạt 3 0,005 0,201 6,839 48,6 107,3 Đạt 4 0,004 0,203 6,805 49,0 108,2 Đạt 5 0,007 0,195 6,826 47,8 105,5 Đạt 6 0,002 0,190 6,835 47,0 103,8 Đạt TB 107,3 Đạt RSD (%) 2,3 Đạt
Nhận xét: Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ST, BR và IS nhỏ hơn 5% đáp ứng của các pic này trong mẫu LLOQ (bảng 3.3a và bảng 3.3b) và độ đúng khi tính lại theo đường chuẩn phân tích trong ngày đều nằm trong khoảng từ 80-120% với RSD < 20%. Do vậy giới hạn định lượng dưới của phương pháp đối với ST là 45,2ng/ml và BR là 45,3ng/ml.
3.2.5. Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày
* Thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày:
Phân tích các mẫu huyết tương LQC, MQC, HQC theo phương pháp đã được xác định. Ghi lại kết quả đáp ứng tại mỗi nồng độ (mỗi mẫu QC tiến hành đo 6 lần để xác định độ đúng và độ chính xác). Dựa vào đáp ứng pic của strychnin, brucin và IS, tính tỉ lệ đáp ứng ST/IS, BR/IS, từ đó xác định nồng độ thực của ST và BR theo đường chuẩn đã xây dựng ở trên. Từ nồng độ tính được, xác định độ đúng, độ chính xác tương ứng. Kết quả về độ đúng, độ chính xác trong ngày được trình bày trong bảng 3.4a và 3.4b.
Bảng 3.4a: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của Strychnin
Mẫu LQC (139,2ng/ml) MQC (905,0ng/ml) HQC (1448,0ng/ml) Tỷ số diện tích pic ST/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) Tỷ số diện tích pic ST/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) Tỷ số diện tích pic ST/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) 1 0,284 142,8 102,6 1,805 903,3 99,8 2,895 1448,3 100,0 2 0,272 136,8 98,3 1,810 905,8 100,1 2,887 1444,3 99,7 3 0,279 140,3 100,8 1,779 890,3 98,4 2,845 1423,3 98,3 4 0,285 143,3 102,9 1,792 896,8 99,1 2,869 1435,3 99,1 5 0,279 140,3 100,8 1,814 907,8 100,3 2,894 1447,8 100,0 6 0,279 140,3 100,8 1,798 899,8 99,4 2,872 1436,8 99,2 TB 101,0 99,5 99,4 RSD (%) 1,6 0,7 0,7
(a): tính từ phương trình hồi qui (b): % so với nồng độ thực Kết quả ở bảng 3.4a cho thấy:
- Mẫu HT MQC có độ đúng từ 98,4 % đến 100,3% với RSD = 0,7%.
- Mẫu HT HQC có độ đúng từ 98,3% đến 100,0% với RSD = 0,7%.
Như vậy các mẫu HT QC đều có độ đúng nằm trong khoảng 85-115% với độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 15%.
Bảng 3.4b. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của brucin
Mẫu LQC (140,0ng/ml) MQC (907,0ng/ml) HQC (1451,2ng/ml) Tỷ số diện tích pic BR/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) Tỷ số diện tích pic BR/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) Tỷ số diện tích pic BR/IS Nồng độ(a) (ng/ml) Độ đúng(b) (%) 1 0,124 143,2 102,3 0,891 910,2 100,4 1,413 1432,2 98,7 2 0,131 150,2 107,3 0,898 917,2 101,1 1,409 1428,2 98,4