Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, tiến hành trên các mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu QC, đánh giá các chỉ tiêu sau:
2.2.4.1. Độ thích hợp của hệ thống
Nguyên tắc: Tiến hành tiêm chính xác 6 lần cùng một dung dịch chuẩn ST và BR vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic.
Tiến hành: Tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của pic tạo bởi ST và BR.
2.2.4.2. Độ chọn lọc
Xử lý mẫu HT theo quy trình đã lựa chọn, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xác định các mẫu: mẫu HT trắng, (mẫu HT ST, BR gần giới hạn định lượng) mẫu HT chứa IS, mẫu HT chứa ST, mẫu HT chứa BR và mẫu HT chứa ST, BR và IS. Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của hoạt chất. Phương pháp được coi là có tính chọn lọc khi:
Pic của ST và BR phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp, các pic của các dược chất dùng đồng thời và chất chuyển hóa.
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ST và BR không được vượt quá 20% đáp ứng của ST và BR ở nồng độ LLOQ.
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của IS.
2.2.4.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn gồm ít nhất 6 nồng độ của ST và BR trong huyết tương trắng với các nồng độ trong khoảng 40-1800ng/ml.Tiến hành phân tích các mẫu. Từ đáp ứng pic của ST và BR tại các nồng độ tương ứng, xác định sự tương quan giữa đáp ứng pic và nồng độ đã pha. Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Tính lại nồng độ theo phương trình hồi quy đã xây dựng, xác định độ đúng với từng nồng độ. Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85% đến 115%. Độ đúng của điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn được phép từ 80-120%. - Có ít nhất 75% số điểm trong dãy đường chuẩn/khoảng tuyến tính (bao gồm cả
2 điểm có nồng độ thấp nhất và cao nhất) đạt được tiêu chuẩn trên. - Khoảng tuyến tính: Có hệ số r ≥ 0,98.
2.2.4.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành sắc ký 6 mẫu huyết tương chuẩn có nồng độ trong khoảng 1/30-1/20 Cmax. Ghi lại đáp ứng pic của mẫu huyết tương chuẩn. Tính lại nồng độ của các mẫu khảo sát dựa vào đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện. Xác định độ chính xác bằng cách tính độ lệch RSD% giữa kết quả 6 lần phân tích.
Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/20 Cmax) được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn:
- Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng.
- Độ đúng phải đạt từ 80-120% so với nồng độ thực. - Độ chính xác với giá trị RSD phải nhỏ hơn 20%.
Tiến hành chạy sắc ký các lô mẫu HT bao gồm LQC (của ST là 139,2ng/ml và BR là 140,0ng/ml), MQC (của ST là 905,0ng/ml và BR là 907,0ng/ml), HQC (của ST là 1448,0ng/ml và BR là 1451,2ng/ml). Mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện. So sánh giá trị trung bình các lần định lượng tại mỗi nồng độ với giá trị thực.
2.2.4.6. Độ chính xác
- Độ chính xác trong ngày: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần định lượng của của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng 1 ngày.
- Độ chính xác khác ngày: tiến hành tương tự như xác định độ chính xác trong ngày, sắc ký các mẫu QC. Tính giá trị RSD của kết quả định lượng cho mỗi nồng độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau.
Yêu cầu với mỗi nồng độ:
Độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85-115% nồng độ thực đã pha. Độ lặp lại trong ngày: Giá trị RSD phải ≤ 15%.
Độ lặp lại giữa các ngày: Giá trị RSD phải ≤ 15%.
2.2.4.7. Hiệu suất chiết
Tiến hành sắc ký các lô mẫu HT QC bao gồm LQC, MQC, HQC theo quy trình đã xây dựng, mỗi lô mẫu HT gồm 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Song song tiến hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua giai đoạn chiết tách, có nồng độ tương ứng với các mẫu QC. So sánh kết quả đáp ứng của ST và BR trong mẫu QC pha trong huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của ST và BR trong mẫu tương ứng pha trong dung môi (không qua chiết tách).
2.2.4.8. Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương
- Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông-rã: Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông-rã, thực hiện trên mẫu HT ở 2 nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20°C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau 3 chu kỳ đông-rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ ST và BR trong mẫu huyết tương. So sánh với kết quả xác định nồng độ ST và BR
có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ ST và BR trong mẫu sau 3 chu kỳ đông-rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
- Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (4 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ ST và BR trong HT được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu HT xử lý ngay không quá 15% và giá trị RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Độ ổn định của huyết tương trong thời gian dài: Khoảng thời gian thử nghiệm độ ổn định dài ngày tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu huyết tương và phân tích hết số mẫu huyết tương. Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ - 20°C, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định (7, 14, 21 ngày…). So sánh nồng độ của mẫu HT sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ ST và BR trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.