XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN

Theo [18], Ari Ivaska and Fredrik Nordström đã xác định Cephalexin bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực làm việc Glassy Cacbon và điện cực so sánh là cực Ag/AgCl, tại pH =

MỞ ĐẦU

Ngày nay, loài người thường xuyên phải đối mặt với nhiều dịch bệnh nguy hiểm có sức tàn phá dữ dội và có qui mô rộng lớn Đặc biệt ở các nước đang phát triển và kém phát triển, do điều kiện vệ sinh còn kém nên vấn đề dịch bệnh lại xảy ra thường xuyên hơn Nhưng, nhờ có sự phát triển của khoa học kỹ thuật, mà con người đã tìm kiếm và tổng hợp được nhiều loại thuốc mới, giúp con người chống lại các dịch bệnh nguy hiểm đó Một trong số các loại thuốc quan trọng mà con người đã tổng hợp được, đó là các thuốc kháng sinh họβ-Lactam

Trong y học hiện đại, các β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng nhất chữa bệnh cho con người và động vật Nhờ các thuốc kháng sinh này mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như: dịch hạch,

tả, thương hàn và điều trị nhiều bệnh gây ra bởi các vi khuẩn

Hiện nay nhu cầu dùng kháng sinh trên thế giới ngày càng tăng Trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, người bệnh và thầy thuốc đứng trước hàng ngàn loại thuốc kháng sinh và mỗi thứ lại có các dạng bào chế khác nhau để tiêm hoặc uống Chính vì vậy, nhiều tổ chức, cá nhân đã cho ra đời nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng gây nguy hại về sức khỏe và kinh

tế cho con người Đại diện tổ chức Y tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vực châu Á chiếm 50% Các mẫu thuốc giả được phát hiện chủ yếu là các loại kháng sinh như Ampicillin, Amoxicillin,…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp nên công tác kiểm tra ngày một khó khăn hơn

Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn

là một vấn đề rất quan trọng Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định

hàm lượng kháng sinh đạt hiệu quả cao như phương pháp HPLC, các phương pháp quang học hay nhóm các phương pháp điện hóa Von-ampe hòa tan là phương pháp phân tích lượng vết có độ nhạy cao mà quy trình phân tích đơn

giản Chính vì vậy tôi đã chọn đề tài: “Xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp von-ampe hòa tan” làm nội dung nghiên cứu

cho luận văn tốt nghiệp của mình

Trong điều kiện khả thi cho phép và tài liệu tham khảo được, trong luận văn này tôi tập trung nghiên cứu quy trình phân tích cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan, từ đó áp dụng phân tích một số mẫu thuốc có trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Cephalexin

Kháng sinh Lactam là các chất kháng sinh mà phân tử chứa vòng lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

β-Cephalexin là kháng sinh cephalosporin thế hệ I được chiết từ môi

trường nuôi cấy Cephalosporium aeremonium hoặc bán tổng hợp từ các

kháng sinh thiên nhiên

Cephalexin có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vỏ tế bào

vi khuẩn Nó là kháng sinh uống, có phổ kháng khuẩn như cephalosporin thế

hệ I

Cephalexin bền vững với pennicilinase của Staphylococcus, do đó có tác dụng với các chủng Staphylococcus aureus tiết penicilinase kháng penicillin (hay ampicilin) Cephalexin có tác dụng invitro trên các vi khuẩn sau: Streptococcus beta tan máu: Staphylococcus, gồm các chủng tiết coagulase (+), coagulase (-) và penicilinase; Streptococcus pneumoniae; một

số Escherichia coli; Proteus mirabilis; một số Klebsiella spp Branhamella catarhalis; Shigella Haemophilus influenzae thường giảm nhạy cảm

Cephalexin cũng có tác dụng trên đa số E Coli kháng ampicillin

Hầu hết các chủng Enterrococcus và một ít chủng Staphylococcus kháng cephalexin Proteus indol dương tính, một số Enterobacter spp, pseudomonas aeruginosa, Bacteroides spp, cũng thấy có kháng thuốc

Theo số liệu ASTS 1997, cephalexin có tác dụng với Staphylococcus aureus, salmonella, E.coli có tỉ lệ kháng cephalexin khoảng 50%; Proteus có tỉ

lệ kháng 25%; Enterobacter có tỉ lệ kháng 23%; Pseudomonas areuginosa có

tỉ lệ có tỉ lệ kháng khoảng 20%

1.1.3 Dược động học [2, 29]

Cephalexin dường như được hấp thu hoàn toàn ở đường tiêu hóa và đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương vào khoảng 9 và 18 µg/ml sau một giờ với liều uống tương ứng 250 và 500mg; liều gấp đôi đạt nồng độ đỉnh gấp đôi Uống cephalexin cùng với thức ăn có thể làm chậm khả năng hấp thu nhưng không làm ảnh hưởng tới tổng lượng hấp thu Có tới 15% liều Cephalexin gắn kết với protein huyết tương Nửa đời trong huyết tương ở người lớn có chức năng thận bình thường là 0,5-1,2 giờ, nhưng ở trẻ sơ sinh dài hơn (5 giờ); và tăng khi chức năng thận suy giảm Cephalexin phân bố rộng khắp cơ thể, nhưng lượng trong dịch não tủy không đáng kể Cephalexin qua được nhau thai và bài tiết vào sữa mẹ với nồng độ thấp Cephalexin không bị chuyển

hóa Thể tích phân bố của cephalexin là 18lit/1,78m2 diện tích cơ thể Khoảng 80% liều dùng thải trừ ra nước tiểu ở dạng không đổi trong 6 giờ đầu qua lọc cầu thận và bài tiết ở ống thận Với liều 500mg nồng độ cephalexin trong nước tiểu cao hơn 1mg/ml Probenecid làm chậm bài tiết cephalexin trong nước tiểu Có thể tìm thấy cephalexin ở nồng độ có tác dụng trị liệu trong mặt

và một ít cephalexin có thể thải trừ qua đường này Cephalexin được thải trừ qua lọc máu và thẩm phân màng bụng từ 20 đến 50%

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng Cephalexin

1.2.1 Các phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định cephalexin, đặc biệt trong dược phẩm

Wei Liu và cộng sự [35], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với

hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp đã phân tích Cephalexin đạt độ nhạy là 3.10-7M

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương

tự chất phân tích việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều

trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.2.2 Các phương pháp điện hóa

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu các kháng sinh bằng phương pháp điện hóa nhưng không nhiều Các phương pháp điện hóa thường

có thời gian phân tích nhanh, phương pháp có độ chọn lọc cao và có khả năng phân tích với nồng độ nhỏ

Theo [18], Ari Ivaska and Fredrik Nordström đã xác định Cephalexin bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực làm việc Glassy Cacbon và điện cực so sánh là cực Ag/AgCl, tại pH = 7,3 pic anot oxi hóa của cephalexin xuất hiện tại +0,8V và tuyến tính trong khoảng nồng độ 10-3M đến 5.10-7M

Theo [6] các tác giả đã nghiên cứu định lượng cephalexin trong chế phẩm thuốc bột bằng cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm đã thu được kết quả tương đương với phương pháp HPLC Với nghiên cứu này các tác giả đã tìm ra điều kiện đo cephalexin bằng phương pháp cực phổ sóng vuông là: phải thủy phân Cephalexin trong NaOH 0,1M, đo trong môi trường

có pH = 7, quét thế theo chiều âm, thế sóng thu được trong khoảng -600mV đến -800mV, E1/2= -709mV Trong khoảng nồng độ 1,2.10-4 đến 7,2.10-6M nồng độ cephalexin có độ tuyến tính cao với chiều cao pic Phương pháp có

độ chính xác và độ lệch chuẩn nhỏ (R2 = 0,9996 và RSD=0,45%) , độ đúng đạt 99,7%

Theo [20], các tác giả khẳng định cephalexin có thể xác định được bằng phương pháp điện hóa trong cả môi trường axit và bazơ Trong môi trường HCl 0,1M cephalexin được đo bằng phương pháp DPP có Epic = -1V, giới hạn phát hiện LOD = 2,88.10-7M Trong môi trường kiềm ở pH = 8,3 cephalexin

được đo bằng phương pháp DPP có Epic = -0,72V, tuyến tính trong khoảng 10

-7

đến 10-5M, giới hạn phát hiện đạt 2.10-7M

Theo [30] các tác giả xử lí các kháng sinh cephalosporin trước khi đo bằng cách cho tạo phức với các ion Cu (II), Pd(II) và Zn(II) sau đó đo von-ampe sóng vuông thì thu được pic cao và rõ nét hơn rất nhiều Giới hạn phát hiện LOD có thể đạt 7.10-10M

Theo [32], tác giả Qilong Li and Shouai Chen đã nghiên cứu xác định cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan và đã thu được kết quả như sau: Cephalexin phải được thủy phân trong môi trường NaOH 0,1M ở 1000C sau 20 phút, sau đó tiến hành đo với thời gian điện phân là 60 giây thu được

Epic = -0,8V, giới hạn phát hiện có thể lên tới 5.10-10M

Như vậy, các phương pháp điện hóa có thể phân tích được cephalexin trong các chế phẩm thuốc hay trong các mẫu phẩm sinh học đều đạt được giới hạn phát hiện rất nhỏ, thời gian phân tích tương đối nhanh và có thể phân tích đồng thời nhiều chất

1.2.3 Các phương pháp sắc ký

1.2.3.1 Sắc ký bản mỏng TLC

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song một lúc rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng Tuy nhiên, như trong [1, 2, 15] thì phương pháp này chủ yếu dùng để định tính các β-lactam

1.2.3.2 Sắc ký điện di CE

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt

về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp

đã được ứng dụng để tách và xác định kháng sinh Cephalexin trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Theo [36], Yahya Mrestani và các cộng sự đã sử dụng phương pháp CZE để xác định Cephalexin trong nước tiểu và trong mật Quá trình xác định được tiến hành một cách trực tiếp mà không cần xử lý mẫu, các mẫu chỉ việc pha loãng trong hệ đệm có pH = 6 và bơm trực tiếp vào máy Các tác giả đã

sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định cephalexin và thu được độ chính xác cao

1.2.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định Cephalexin trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác

vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này, đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp

Theo [11, 12] các tác giả đã xây dựng được quy trình phân tích Cephalexin trong huyết tương người tình nguyện bằng HPLC đạt giới hạn định lượng LOQ = 1,7.10-6M và giới hạn phát hiện LOD = 5,5.10-7M Hiệu xuất ≈100% và độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (RSD < 3%) chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao đáp ứng nhu cầu của phân tích sinh học

1.3 Giới thiệu về phương pháp Von-ampe hòa tan (SV) [3,14,16]

1.3.1 Nguyên tắc chung của phương pháp Von-ampe hòa tan

Quy trình chung của phương pháp Von-ampe hòa tan gồm 2 giai đoạn chính:

- Giai đoạn làm giàu: Chất phân tích được tập trung lên bề mặt điện cực (dưới dạng kim loại hay hợp chất khó tan) Điện cực làm việc thường là điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE), cực rắn đĩa quay bằng vật liệu trơ (than thuỷ tinh, than nhão tinh khiết) hoặc cực màng thuỷ ngân trên bề mặt cực rắn trơ (MFE)

- Giai đoạn hòa tan: hòa tan chất phân tích khỏi bề mặt điện cực làm việc bằng cách quét thế theo chiều xác định (anot hoặc catot) đồng thời ghi đường Von-ampe hòa tan bằng kỹ thuật điện hóa nào đó Nếu quá trình hòa tan là quá trình anot, thì lúc này phương pháp được gọi là Von-ampe hòa tan anot (ASV) và ngược lại nếu quá trình hòa tan là quá trình catot thì phương pháp được gọi là Von-ampe hòa tan catot (CSV)

Các phản ứng làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực rất phong phú, nhìn chung gồm ba loại chính:

Làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực dưới dạng kết tủa kim loại:

Quá trình catot Quá trình catot

Quá trình anot Quá trình anot

phải chọn âm hơn so với E1/2 nếu quá trình là hòa tan anot hoặc dương hơn nếu là hòa tan catot

Làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực dưới dạng hợp chất khó tan hoặc hợp chất với ion kim loại dùng làm điện cực hay ion nào đó trong dung dịch

Phương pháp này áp dụng cho cả anion và cation Trong phương pháp này, Edp được chọn dương hơn so với E1/2 và nếu phân tích kim loại mà hợp chất của nó với thuốc thử nào đó có thể kết tủa trên bề mặt điện cực làm việc, chẳng hạn cực rắn trơ thì các phản ứng xảy ra như sau:

Giai đoạn làm giàu: giữ Edp không đổi:

Giai đoạn hòa tan: quét thế catot

MRn+m↓ + me Mn+ + (n+m)R (R có thể là chất hữu cơ hoặc OH-, )

Phương pháp von-ampe hòa tan catot còn cho phép xác định các chất hữu cơ hoặc các anion tạo được kết tủa với Hg(I) hoặc là Hg(II) khi dùng điện cực làm việc là HMDE Các phản ứng xảy ra như sau:

Giai đoạn làm giàu: giữ Edp không đổi

pHg (HMDE) + qX - ne HgpXq (HMDE) Giai đoạn hòa tan : quét thế catot

HgpXq (HMDE) + ne pHg (HMDE) + qX (X có thể là chất hữu cơ hoặc ion vô cơ như halogenua, S2-, MoO42-,

VO32-, PO43-…)

Làm giàu chất phân tích lên bề mặt dưới dạng phức hấp phụ

Theo phương pháp này, chất cần phân tích tạo phức với một phối tử nào đó trong dung dịch và được hấp phụ lên bề mặt điện cực Phản ứng có thể tóm tắt như sau:

Quá trình anot

Quá trình catot

Quá trình anot

Quá trình catot

Giai đoạn làm giàu: giữ Edp không đổi

Trong trường hợp đơn giản nhất, Men+ phản ứng với L theo phản ứng dưới, phản ứng này xảy ra trong dung dịch và đây là giai đoạn hóa học của quá trình:

Mn+ + nL ‡ ˆ ˆˆ ˆ † MLnn+(dd); dung dịch Tiếp theo, phức hình thành hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc

MLnn+ ‡ ˆ ˆˆ ˆ † MLnn+ (hp); hấp phụ

Sự hấp phụ phối tử L xảy ra trước khi tạo thành phức

nL (dd) ‡ ˆ ˆˆ ˆ † nL (hp) Sau đó, phối tử đã hấp phụ phản ứng với Mn+ (giai đoạn hoá học):

Mn+ + nL (hp) ‡ ˆ ˆˆ ˆ † MLnn+ (hp) Giai đoạn hòa tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo phản ứng sau:

MLnn+ (hp) + ne → M + nL Đường von-ampe hòa tan thu được có dạng peak Thế đỉnh (Ep) và cường độ dòng hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: nền điện ly, pH, chất tạo phức, bản chất điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan

Trong những điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dựa vào Ep có thể phân tích định tính Ip tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch theo phương trình:

Ip = kC Trong đó k là hệ số tỷ lệ

Như vậy qua việc đo cường độ dòng ta có thể xác định được nồng độ chất cần phân tích nếu biết chính xác giá trị của k

* Ưu điểm của phương pháp von-ampe hòa tan

So sánh các phương pháp phân tích vết khác, phương pháp von-ampe hòa tan có những ưu điểm sau:

-Phương pháp von-ampe hòa tan có khả năng xác định đồng thời nhiều kim loại ở những nồng độ cỡ vết và siêu vết

-Thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan không đắt, nhỏ gọn So với các phương pháp khác, phương pháp von-ampe hòa tan rẻ nhất về mặt chi phí đầu tư cho thiết bị Mặt khác, thiết bị của phương pháp von-ampe hòa tan

dễ thiết kế để phân tích tự động, phân tích tại hiện trường và ghép nối làm detector cho các phương pháp phân tích khác

-Phương pháp von-ampe hòa tan có quy trình phân tích đơn giản: không có giai đoạn tách, chiết hoặc trao đổi ion nên tránh được sự nhiễm bẩn mẫu hoặc làm mất chất phân tích do vậy giảm thiểu sai số Mặt khác, có thể giảm thiểu ảnh hưởng của các nguyên tố cản trở bằng cách chọn điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thế điện phân làm giàu, thời gian làm giàu, thành phần nền, pH

-Khi phân tích theo phương pháp von-ampe hòa tan anot không cần đốt mẫu nên phương pháp von-ampe hòa tan thường được dùng để kiểm tra chéo các phương pháp AAS và ICP-AES khi có những đòi hỏi cao về tính pháp lý của kết quả phân tích

-Trong những nghiên cứu về động học và môi trường, phương pháp von-ampe hòa tan có thể xác định dạng tồn tại của các chất trong môi trường, trong khi đó các phương pháp khác như AAS, ICP-AES, NAA không làm được điều đó

* Phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ

Phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ là phương pháp bổ xung cho phương pháp von-ampe hoà tan anot, và phương pháp này ngày càng được

đẩy mạnh và ứng dụng rộng rãi vì nó có thể xác định lượng vết và siêu vết các chất vô cơ và hữu cơ mà phương pháp von-ampe hoà tan anot không thể hoặc khó xác định về cơ sở lý thuyết, phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ khác biệt cơ bản với phương pháp von-ampe hoà tan anot ở cơ chế của phản ứng làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất lên bề mặt điện cực làm việc) Nói chung nó bao gồm ba giai đoạn: Giai đoạn tạo thành, giai đoạn hấp phụ và giai đoạn khử hoạt động bề mặt của kim loại Cơ chế tổng quát của giai đoạn làm giàu trong phương pháp AdSV như sau: Trước hết phức của ion kim loại với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi thêm phối tử vào dung dịch phân tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp phụ lên ranh giới tiếp xúc dung dịch- điện cực làm việc Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm việc được giữ không đổi Hầu hết các nghiên cứu áp dụng phương pháp AdSV đều dùng điện cực làm việc là điện cực HMDE

Trong phương pháp AdSV, khi ghi dòng von-ampe hoà tan, có thể sử dụng tất cả các kỹ thuật ghi đã được biết đến (DPP, SqW, von-ampe bậc thang, von-ampe dòng xoay chiều hoà tan bậc một, ) Tín hiệu đỉnh trên đường von-ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV Theo Pihlar, Valenta và Nurnberg tín hiệu von-ampe hoà tan tỉ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp thụ lên bề mặt điện cực làm việc theo phương trình:

C0 (mol/Cm2) là nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên bề mặt điện cực

Với tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh Ip tỉ lệ thuận với Q, nên Ip tỉ lệ với S và C0 Vì vậy C0 tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C), nên Ip tỉ lệ với S và C: Ip ~ S.C Như vậy để nâng cao độ nhạy, có thể tăng diện tích bề mặt hoặc tăng thời gian hấp phụ là giàu

Do có những điểm khác biệt về bản chất của phương pháp nên ngoài những ưu điểm giống như phương pháp von-ampe hoà tan, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng như:

- Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp ASV và CSV: Từ những hiểu bíêt về hoá học phức chất, có thể lựa chọn được thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với các kim loại cần phân tích và như vậy có thể sử dụng nhiều thuốc thử tạo phức khác nhau để xác định rất nhiều kim loại

- Có thể xác định được tổng kim loại hoà tan trong nước và thươngf đạt LOD thấp hơn so với phương pháp ASV và CSV: Bằng cách chọn thuóc thử tạo phức rất bền với kim loại cần phân tích sẽ xác định được tổng kim loại hoà tan mà không cần xử lí mẫu Điều này tránh được sự nhiễm bẩn mẫu và

-Cực phụ trợ (cực đối): thường dùng cực Pt hay cực Cacbon

-Cực làm việc thường dùng các điện cực dưới đây:

1.3.2.1 Điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE)

Cực HMDE là loại điện cực dùng phổ biến nhất trong phương pháp

SV Nó là một giọt thuỷ ngân hình cầu có kích thước nhỏ được treo ở cuối của một mao quản có đường kính trong 0,05-0,07mm Sau mỗi phép đo, giọt thuỷ ngân bị cưỡng bức rơi khỏi mao quản và nó được thay thế bằng giọt mới tương tự

Một kiểu điện cực giống với cực HMDE là cực giọt thuỷ ngân tĩnh SMDE Cực HMDE và cực SMDE có ưu điểm là có quá thế hydro lớn: khoảng -1,5V trong môi trường kiềm và trung tính, -1,2V trong môi trường axit, nên khoảng điện hoạt rộng và do đó cho phép nghiên cứu phân tích được nhiều chất Mặt khác, cực HMDE và SMDE cho các kết quả có độ chính xác

và độ lặp lại cao Chúng được ứng dụng rộng rãi để xác định hàng chục kim loại cũng như á kim Cd,Cu, Pb, Zn, In, Bi, Sb, Se, các halogenua và nhiều hợp chất hữu cơ theo phương pháp ASV hay CSV Điểm hạn chế của điện cực HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra giọt thuỷ ngân có kích thước lặp lại một cách hoàn hảo Ngoài ra chúng không xác định được những kim loại có thế âm hơn thủy ngân như Au, Ag

1.3.2.2 Điện cực màng thuỷ ngân (MFE)

Cực MFE là một màng mỏng thuỷ ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ (thường là cực rắn đĩa quay) có đường kính từ 2-4mm và làm bằng các vật liệu trơ như than thuỷ tinh (glassy carbon), graphit, than nhão (paste carbon), Cực MFE được chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch Hg(II) 10-3 - 10-4 M trên cực rắn đĩa ở thế thích hợp (khoảng –0,8 ÷ -1,3V so với cực Ag/AgCl/KClbh hoặc Hg/Hg2Cl2/KClbh) và trong thời gian thích hợp

(điển hình là 1-2 phút) Bằng cách như vậy, cực MFE có thể được hình thành theo hai kiểu: in situ và ex situ:

-Theo kiểu in situ, dung dịch Hg(II) được thêm vào dung dịch phân tích như vậy khi điện phân làm giàu, cực MFE được hình thành đồng thời với qua trình tập trung chất lên cực MFE

-Theo kiểu ex situ, cực MFE được tạo thành bằng cách điện phân dung dịch Hg(II) như trên, sau đó tia rửa cẩn thận bằng nước sạch, rồi nhúng cực vào dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu Cực MFE dạng ex situ thường có bề dày màng thuỷ ngân lớn hơn so với dạng in situ

Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là một vấn đề hấp dẫn các nhà nghiên cứu Khi khảo sát các cực MFE được tạo ra theo kiểu in situ và ex situ, H Ping Wu cho rằng: cực MFE như một màng mỏng gồm các giọt thuỷ ngân nhỏ li ti và liên tục trên cực rắn đĩa; kích thước các giọt thuỷ ngân phụ thuộc vào lượng thuỷ ngân trên bề mặt cực rắn đĩa và thường khoảng từ

<0,1µm đến 1µm

Ngoài những ưu điểm giống như đối với cực HMDE, cực MFE còn có một số ưu điểm khác: do nồng độ kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao hơn, tốc độ khuếch tán các kim loại ra khỏi cực MFE nhanh hơn và có đặc điểm của quá trình điện hóa lớp mỏng; mặt khác có thể sử dụng cực MFE quay, nên điều kiện đối lưu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực MFE có độ nhạy và độ phân giải cao hơn cực HMDE, đặc biệt khi phân tích các kim loại tan được trong thuỷ ngân tạo thành hỗn hống Do đó độ nhạy của phương pháp tăng lên và trong nhiều trường hợp tránh được sự tạo thành dung dịch rắn và hợp chất gian kim loại

Nhược điểm: độ lặp lại và độ phục hồi của các phép đo khi đi từ cực MFE này đến cực MFE khác thường kém hơn so với các cực HMDE và SMDE

1.3.3.Các kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan

1.3.3.1.Kỹ thuật Von-ampe hòa tan quét tuyến tính (Linear Scan Voltammetry)

Trong kỹ thuật này, thế được quét tuyến tính theo thời gian như trong phương pháp cực phổ cổ điển, nhưng tốc độ quét lớn hơn (khoảng từ 10-30 mV/s) Đồng thời ghi dòng là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc Khi dùng cực HMDE với tốc độ quét thế > 20mV/s, quá trình oxy hóa khử kim loại (khi phân tích theo phương pháp ASV) là thuận nghịch, thì theo Nicholson và Shain, Reinmuth dòng đỉnh hòa tan tuân theo phương trình:

C (mmol/L)- nồng độ ion kim loại trong dung dịch phân tích

Vries và Van Dalen cho rằng khi phân tích theo phương pháp ASV: cực MFE có độ nhạy và độ phân giải đỉnh cao hơn so với cực HMDE Roe và Toni cũng có kết luận tương tự và đưa ra phương trình dòng đỉnh trên cực MFE (nếu cực MFE có bề dày màng thuỷ ngân < 10μm và tốc độ quét thế < 1V/min):

Ip = n2.F2.S l.C.v

e

Trong đó, S (cm2) và l (cm) là diện tích và bề dày màng thuỷ ngân, e

là cơ số của logarit tự nhiên, F (C/mol) là hằng số Faraday, các đại lượng khác tương tự trên

Nghiên cứu phương pháp ASV trên cực rắn đĩa, Brainina đã thiết lập được các phương trình dòng đỉnh và thế đỉnh đối với hệ thuận nghịch và bất thuận nghịch Nhưng các phương trình đó rất phức tạp, nên khó sử dụng trong phân tích

Kỹ thuật von-ampe quét thế tuyến tính có nhược điểm là độ nhạy chưa cao, LOD còn lớn, do nó còn bị ảnh hưởng nhiều của dòng tụ điện

1.3.3.2 Kỹ thuật von-ampe xung vi phân DP(Differential Pulse Voltammetry)

Kỹ thuật DP là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau khoảng 10-100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30-100 ms được đặt chồng lên mỗi bước thế Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2), khoảng thời gian đo dòng thông thường là 10-30 ms Dòng thu được là hiệu giá trị của hai dòng và I được ghi là hàm của thế đặt lên cực làm việc

Hình 1.2: Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe xung vi phân

Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng dòng Faraday (If) và dòng tụ điện (Ic) Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với dòng Faraday vì Ic ~ e-1/RC* và If ~ t-1/2, ở đây t là thời gian, R là điện trở, C* là điện dung vi phân lớp kép Theo cách ghi dòng như trên, dòng

tụ điện được ghi trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung là gần như nhau

và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là dòng Faraday Như vậy, kỹ thuật

DP cho phép loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tự điện, dẫn đến LOD thấp hơn khoảng 1000 lần khi dùng cực HMDE Mặt khác, với kỹ thuật DP cực MFE đạt được LOD thấp hơn khoảng 3-5 lần so với cực HMDE

1.3.3.3.Kỹ thuật von-ampe sóng vuông SqW (Square Wave voltammetry)

Kỹ thuật này được Barker đề ra từ năm 1958, theo kỹ thuật này điện cực giọt thuỷ ngân được phân cực bởi một điện áp một chiều biến thiên đều theo thời gian có cộng thêm một điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số khoảng 200Hz và biên độ có thể thay đổi từ 1-50 mV Trong mỗi chu kỳ xung dòng được đo ở hai thời điểm: thời điểm 1 ứng với dòng dương I1, thời điểm 2 ứng với dòng âm I2 Dòng thu được là hiệu của hai dòng I1 và I2, theo cách ghi như vậy có thể loại trừ tối đa ảnh hưởng dòng tụ điện

Hình 1.3 Ghi dòng theo kỹ thuật von-ampe sóng vuông

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình phân tích định lượng cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan, từ đó áp dụng xác định hàm lượng Cephalexin trong một số mẫu thuốc trên thị trường Vì vậy nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Khảo sát các điều kiện thủy phân

2 Khảo sát các phương pháp ghi đường hòa tan

3 Khảo sát các điều kiện đo tối ưu

4 Khảo sát ảnh hưởng của các kháng sinh β-lactam khác

5 Xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp

6 Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất

2.2.1 Thiết bị

Thiết bị phân tích điện hoá đa năng μ-Autolap ghép nối với hệ 3 điện cực 663 của Metrohm Hệ điện cực gồm 3 điện cực sau:

- Điện cực so sánh là điện cực Ag/AgCl

- Điện cực làm việc là điện cực giọt thuỷ ngân treo HMDE

- Điện cực phù trợ là điện cực Cacbon

Máy đo pH của hãng Orion research

2.2.2 Dụng cụ

Pipet: 1ml; 2ml; 5ml

Bình định mức: 25ml; 50ml; 100ml; 500ml

Cốc nhỏ: 250ml

Ø Pha dung dịch đệm axetat

- Pha dung dịch CH3COOH 0,1M: Lấy 0,6ml axit axetic 98% định mức thành 100ml dung dịch bằng nước cất 2 lần

- Pha dung dịch CH3COONa 0,1M: Cân 1,3608gam muối

CH3COONa.3H2O hoà tan và định mức thành 100ml bằng nước cất 2 lần Dung dịch đệm axetat được pha bằng cách trộn hai dung dịch trên theo

tỉ lệ thích hợp để thu được pH tương ứng

Ø Pha dung dịch đệm vạn năng

- Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp ba axit H3PO4 ; H3BO3 và CH3COOH cùng ở nồng độ 0,04M

Lấy 2,24ml dung dịch H3PO4 98% + 2,4ml dung dịch CH3COOH 98% + 3,12gam H3BO3 rồi định mức thành 1lit

- Dung dịch B Là dung dịch NaOH 0,2M Lấy 4 gam NaOH rắn hoà tan vào nước cất rồi định mức thành 500ml

- Pha dung dịch đệm vạn năng bằng cách trộn hai dung dịch A và B theo tỉ

lệ thích hợp

Ø Pha dung dịch chất chuẩn 10 -2 M

- Cân 347,39mg cephalexin chuẩn, pha bằng nước hai lần cất rồi định mức thành 100ml

- Cân 367,8mg cephaclor chuẩn, pha bằng nước cất hai lần rồi định mức thành 100ml

- Cân 445,47mg cephotaxim chuẩn, pha bằng nước cất hai lần rồi định mức thành 100ml

Các dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày

Ø Pha dung dịch mẫu thực

- Lấy 5 viên nang cephalexin 500mg của công ty MKP trộn đều rồi đem cân lấy 347,39 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành 100ml ta thu được dung dịch gốc 10-2M Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

- Lấy 5 viên nang cephalexin 500mg của công ty GLM trộn đều rồi đem cân lấy 347,39 mg pha bằng nước cất 2 lần rồi định mức thành 100ml ta thu được dung dịch gốc 10-2M Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch gốc

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện thủy phân

3.1.1 Khảo sát sự xuất hiện pic của cephalexin

Về mặt lý thuyết, một chất muốn xác định được bằng phương pháp von-ampe hòa tan thì bản thân nó hoặc các sản phẩm trung gian hình thành từ chất đó phải có hoạt tính điện hóa

Theo các tài liệu tham khảo được, thì bản thân Cephalexin không có hoạt tính điện hóa nhưng sản phẩm của phản ứng thủy phân bằng dung dịch NaOH thì lại có hoạt tính điện hóa theo cơ chế sau:

Ban đầu khi thủy phân xảy ra quá trình mở vòng β-Lactam như sơ đồ sau:

AN là các bazơ như NaOH,… Sản phẩm mở vòng (gọi là X) sẽ kết hợp với Hg tạo sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực (anot) trong giai đoạn làm giàu

Hg -2e + X = HgX

Quá trình hòa tan sẽ là quá trình ngược lại và xẩy ra trên catot, vì vậy được gọi là hòa tan catot

Vì vậy, tôi tiến hành khảo sát trong hai trường hợp: Đo trực tiếp trong một số dung dịch chất nền và đo sau khi đã được thủy phân bằng dung dịch NaOH 0,1M

Khi đo trực tiếp Cephalexin trong nền đệm axetat và nền đệm vạn năng

ở các pH < 7 thì không thấy có pic xuất hiện

Khi đo trực tiếp trong nền đệm axetat và đệm vạn năng ở các pH > 7 và trong nền là dung dịch NaOH 0,1M đã có pic xuất hiện nhưng pic không cao

và không cân đối (hình 3.1)

-400m-500m-600m-700m-800m-900m-1.00

U (V)

-80.0n -60.0n -40.0n -20.0n

Hình 3.1 Phổ thu được khi đo trực tiếp trong nền có pH >7

(1) đệm axetat; (2) đệm vạn năng; (3) dung dịch NaOH

Như trên đã phân tích, trong môi trường kiềm cephalexin sẽ bị thủy phân Sự xuất hiện pic trên hình 3.1 có thể được lí giải là do sản phẩm thủy

1

phân của cephalexin đã có phản ứng điện hóa Do đó tôi tiến hành đo sau khi

đã được thủy phân bằng dung dịch NaOH 0,1M trong khoảng thời gian 30 phút, phổ thu được khi đo đã có pic xuất hiện và tương đối cao Sự xuất hiện pic sau khi đã được thủy phân càng chứng tỏ phản ứng điện hóa có được là do vòng β-Lactam đã được mở vòng Để kiểm tra pic xuất hiện có phải là pic của chất phân tích hay không, tôi cho thêm chất phân tích vào dung dịch đo, sau khi sự thủy phân xảy ra tôi đo thì thấy pic xuất hiện cao hơn và có cùng vị trí với pic ban đầu (hình 3.2)

U (V)

-150n -100n -50.0n 0

Hình 3.2 Phổ thu được khi đo trong dung dịch NaOH

Như vậy, píc xuất hiện chính là pic của sản phẩm thủy phân Cephalexin

trong môi trường NaOH Do đó, trong các lần đo sau tôi tiến hành đo trong

nền là dung dịch NaOH và đo sau khi đã được thủy phân

10-7

2.10-7

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH

Để có thể xác định được nồng độ NaOH phù hợp cho quá trình thủy phân Cephalexin và làm chất nền tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến chiều cao và vị trí pic

Kết quả trên hình 3.3 và bảng 3.1 cho thấy, khi thay đổi nồng độ NaOH thì vị trí và chiều cao pic cũng thay đổi Cụ thể là, khi nồng độ NaOH giảm dần thì Ep âm dần nhưng chiều cao pic tăng dần rồi lại giảm dần và cao nhất ở nồng độ 10-1M Điều này có thể được lí giải là khi nồng độ NaOH tăng thì sự thủy phân xảy ra nhiều hơn, nhưng khi nồng độ tăng quá cao thì sự có mặt của NaOH đã làm cho độ nhớt của dung dịch tăng do đó làm giảm chiều cao pic

thu được Do đó, tôi chọn nồng độ dung dịch NaOH là 10 -1 M cho sự thuỷ phân và làm nền cho các lần đo sau

3.1.3 Khảo sát thời gian thuỷ phân

Như kết quả khảo sát ở trên, muốn có pic xuất hiện thì chất phân tích phải được thuỷ phân và đo trong dung dịch NaOH 0,1M Nhưng thời gian thuỷ phân như thế nào là hợp lí thì chưa biết, vì vậy tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân

Điều kiện đo: - Đo trong nền NaOH 0,1M

- Thế hấp phụ là -0,3V

- Quét thế từ -0,3V đến -1,2V

- Nồng độ Cephalexin chuẩn là 5.10-7M Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến chiều cao pic

Thời gian thuỷ phân

Ipic (10-7A) 6,72 8,26 9,39 10,4 10,8 10,83 10,8

Thêi gian thuû ph©n (phót)

Hinh 3.4 Phổ thu được khi thay đổi

thời gian thuỷ phân

Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến chiều cao pic

Như vậy, khi thời gian thuỷ phân tăng thì chiều cao pic tăng nhanh cho

tới 20 phút thì tăng chậm và tới 25 phút thì không tăng nữa Do đó, trong các

lần đo sau tôi tiến hành đo sau khi đã thuỷ phân được 25 phút

3.2 Khảo sát phương pháp ghi đường hoà tan

3.2.1 Đường CV của cephalexin

Để tìm hiểu quá trình là hoà tan catot hay hoà tan anot tôi tiến hành ghi đường CV của chất phân tích

Điều kiện đo: - Đo trong nền NaOH 0,1M sau khi đã thủy phân 25 phút

- Thế hấp phụ là -0,3V

- Quét thế từ -0,3V đến -1,2V

- Nồng độ Cephalexin chuẩn là 5.10-7M Kết quả thu được như sau: