Bước đầu xác định một số hợp chất isoflavone có trong củ sắn dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC THƯỢNG THỊ KIM PHƯỢNG Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC Ngành đào tạo: Cử nhân Hố phân tích – Mơi trường Trình độ đào tạo: Đại học KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÀ NẴNG, NĂM 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC THƯỢNG THỊ KIM PHƯỢNG Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC Ngành đào tạo: Cử nhân Hố phân tích – Mơi trường Trình độ đào tạo: Đại học KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: TS BÙI XUÂN VỮNG ĐÀ NẴNG, NĂM 2019 LỜI CẢM ƠN Trải qua chặng đường nghiên cứu với nhiều khó khăn thử thách ngồi nổ lực thân chắn em khơng thể hồn thành khóa luận khơng bảo, động viên, giúp đỡ dù hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp thầy cơ, gia đình, bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS Bùi Xuân Vững, tận tình hướng dẫn em suốt trình viết báo cáo tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn quý thầy, khoa Hóa học, Trường Đại Học Sư PhạmĐại học Đà Nẵng tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn đến thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét khóa luận em.Trong q trình làm báo cáo khó tránh khỏi sai sót, mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để báo cáo em hoàn thiện Đà Nẵng, ngày….tháng ….năm 2019 Sinh viên thực DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) DMSO Dimethyl sulfoxit có cơng thức (CH3)2SO PTFE Polytetrafloetylen (nhựa teflon) Association of Official Analytical Chemists có AOAC CHD nghĩa Hiệp hội nhà hoá phân tích thống Coronary heart disease (bệnh động mạch vành ) MeCN Acetonitrile có cơng thức hóa học CH3CN EtOH Etanol, ancol etylic MeOH Metanol, ancol metylic CAN Acetonitrile có cơng thức hóa học CH3CN STD Standard có nghĩa dung dịch chuẩn SD Standard deviation (độ lệch chuẩn) Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương RSD đối) LOD Giới hạn phát (limit of detector) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU Bảng 1 Danh sách isoflavones 15 Bảng Lực rửa giải số dung môi 30 Bảng Nồng độ chất chuẩn làm việc (µg/ml) 39 Bảng Kết đo chuẩn STD1 42 Bảng Kết đo chuẩn STD 42 Bảng 3 Kết đo chuẩn STD3 Bảng Kết đo chuẩn STD4 42 Bảng Kết đo chuẩn STD5 Bảng Kết đo chuẩn STD0 43 Bảng Tóm tắt kết đường chuẩn hợp chất isoflavone 46 Bảng Độ lặp lại Daidzin Bảng Độ lặp lại Glycitin 47 Bảng 10 Độ lặp lại Genistin 47 Bảng 11Độ lặp lại Glycitein 47 Bảng 12 Độ lặp lại Glycitein Bảng 13 Độ lặp lại Genistein 48 Bảng 14 Kết LOD LOQ 49 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1 Cây sắn dây 10 Hình Hình ảnh quy trình trồng củ sắn dây( nguồn: tác giả) 12 Hình Cấu trúc hóa học íoflavones 13 Hình Cấu trúc hóa học aglucon 13 Hình Cấu trúc hóa học 𝛽- Glucozit 14 Hình Sơ đồ thể ảnh hưởng lực rửa giải 19 Hình Quá trình rửa giải tách peak chất A chất B 20 Hình Sắc ký đồ chất A chất B 21 Hình Ảnh hưởng độ chọn lọc đến hiệu tách peak hai chất A B 22 Hình 10 Cách tính hệ số khơng đối xứng peak 24 Hình 11 Các thiết bị hệ thống HPLC 25 Hình Thiết bị khuấy thiết bị li tâm 34 Hình 2 Thiết bị lọc chân khơng thiết bị cô quay chân không 34 Hình Máy lắc thiết bị sấy 34 Hình Tủ lạnh thiết bị cất nước 34 Hình Thiết bị HPLC Agilent 1200 35 Hình Sơ đồ quy trình chiết lắc isoflavone dạng cao chiết từ sắn dây 36 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 41 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 41 Hình 3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzin 43 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitin 44 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistin 44 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzein 45 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitein 45 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Genistein 46 Hình Đồ thị biểu diễn thay đổi thành phần pha động theo hệ 49 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu bột sắn dây 50 Hình 11 Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây tinh 50 Hình 12 Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây thô 51 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài: Đối tượng nghiên cứu Giới thiệu chung 3.1 Nội dung 3.2 Mục đích đề tài 3.3 Thời gian thực 3.4 Phạm vi thực CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SẮN DÂY 10 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm 10 1.1.2 Thành phần hóa học sắn dây 12 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE 12 1.2.1 Nguồn gốc Isoflavone 12 1.2.2 Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc isoflavone 13 1.2.3 Tác dụng isoflavone phòng điều trị bệnh 16 1.3 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 18 1.3.1 Khái niệm 19 1.3.2 Nguyên tắc trình sắc ký 19 1.3.3 Phân loại sắc ký hấp phụ 20 1.3.4 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 21 1.4.5 Hệ thống HPLC 24 1.4.6 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký 28 1.4.7 Các bước tiến hành sắc ký 31 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên liệu .33 2.2 Hóa chất dụng cụ, thiết bị 33 2.2.1 Hóa chất 33 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 33 2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích 35 2.4 Nội dung nghiên cứu 35 2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone 35 2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 37 2.4.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 41 3.2 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính theo hệ 42 3.2.1 Kết đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5 42 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 43 3.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo .47 3.4 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 48 3.5 Kết khảo sát mẫu củ sắn dây có isoflavone theo thành phần pha động hệ 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Kết luận .52 Đề xuất 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài: Sắn dây trồng phổ biến Việt Nam, rể củ sắn dây sử dụng lâu đời y học cổ truyền với tên gọi Cát Nhiều nghiên cứu hoạt chất nhóm isoflavone (puerarin, daidzin, daidzein,…) thành phần có tác dụng sinh học Isoflavone nhiều chức có lợi cho thể người, trì tuổi xuân cho phụ nữ, giảm ung thư vú, ung thư cổ tử cung, giảm hàm lượng cholesterol, phịng tránh bệnh tim mạch, lỗng xương, giảm triệu chứng mãn kinh bốc hỏa, đổ mồ hôi, trầm cảm Cho nên isoflavone bổ sung vào thực phẩm chức để cải thiện sức khỏe người Đối tượng nghiên cứu Isoflavone hợp chất polyphenolic, có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật Isoflavone hoạt chất có chế hoạt động chức gần giống nội tiết tố nữ estrogen người, nhà khoa học gọi estrogen thảo mộc (plant estrogen) Nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone phong phú hạt ngũ cốc, rau quả, sắn dây nguồn nguyên liệu chủ yếu hàm lượng isoflavone sắn dây cao đặc biệt củ sắn dây nảy mầm Cùng với hàng ngàn dược liệu quý có Việt Nam, sắn dây dược liệu quý, sắn dây biết đến thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao chứa hàm lượng protein cao loại nông sản Trong sắn dây cịn chứa nhiều khống chất, sinh tố B đặc biệt hóa chất thảo mộc có khả ngăn ngừa trị liệu bệnh tật Điều làm nhà khoa học say mê nghiên cứu khám phá hóa thảo mộc có sắn dây ứng dụng chúng lĩnh vực y khoa trị liệu, isoflavones loại hóa chất thảo mộc mang lại nhiều ứng dụng Đồng thời, với mong muốn đóng góp phần vào kho tư liệu nhà nước, mà em tiến hành thực đề tài: “Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15 Cân 56,12 g bột sắn dây cho vào bình cầu Sau thêm vào 800ml cồn 80o, lắp cánh khuấy Đun bếp cách thủy nhiệt độ 700C 60 phút Sau đem làm nguội 20 phút trước lọc chân không Sau lọc chân không thu dịch chiết (1444ml) Dịch chiết đem sấy thành cao.Bảo quản tủ lạnh đông sâu -180 C Pha methanol 700, lọc qua màng PTFE 0,2 µm đo HPLC b Xác định hàm lượng isoflavone Sau chuẩn bị mẫu tiến hành đo mẫu điều kiện sắc ký khảo sát Dựa vào thời gian lưu diện tích peak đo được, tơi tính tốn nồng độ hợp chất isoflavone dung dịch theo phương trình đường chuẩn Từ xác định hàm lượng isoflavone tổng số X (g/g) khối lượng chất khô mẫu nguyên liệu ban đầu 2.4.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngồi u cầu độ phương pháp, người ta ý đến độ lặp lại phương pháp Độ lặp lại hệ thống sắc ký khảo sát cách tiêm lặp lần mẫu chuẩn hỗn hợp isoflavone vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu khảo sát Kết đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thời gian lưu tR ∑𝑛𝑖=1 𝑥𝑖  Giá trị trung bình : 𝑥̅ =  Độ lệch chuẩn: SD = √  Độ lệch chuẩn tương đối: 𝑅𝑆𝐷(%) = × 100 𝑛 ∑𝑛 𝑖=1(𝑥𝑖 −𝑥̅ ) 𝑛−1 𝑆 𝑥̅ 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ thành phần pha động Kết khảo sát thời gian lưu độ phân giải isoflavone rửa giải chương trình gradient với tỷ lệ thành phần pha động khác thể hình 3.1, 3.2 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ Nhận xét : Kết khảo sát cho thấy hệ cho hiệu tách isoflavone mẫu chuẩn tốt nhất, sắc ký đồ có ba peak ba hợp chất isoflavone cần phân tích peak phân tách rõ ràng, không bị chồng peak lên Trong đó, hệ cho sắc ký đồ với peak không phân tách rõ ràng, xếp chồng lên nhau, có tượng che peak Do đó, tơi lựa chọn pha động theo hệ cho nghiên cứu 41 3.2 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính theo hệ 3.2.1 Kết đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5 Bảng Kết đo chuẩn STD1 STD Thời gian Bảng Kết đo chuẩn STD Diện tích STD Thời gian Diện tích lưu ( t lưu) peak (Speak) lưu ( t lưu) peak (Speak) Daidzin 15.276 1182.2 Daidzin 15.33 2230.1 Glycitin 16.132 1152.2 Glycitin 16.488 2146.7 Genistin 17.902 621 Genistin 18.303 2827.5 Daidzein 23.786 317.3 Daidzein 23.588 562.4 Glycitein 24.674 365.5 Glycitein 24.563 519.9 Genistein 26.183 896.6 Genistein 26.424 1094 Bảng 3 Kết đo chuẩn STD3 Bảng Kết đo chuẩn STD4 Thời gian Diện tích lưu ( t lưu) peak (Speak) Daidzin 15.378 6535.3 3323.7 Glycitin 16.221 8539.7 18.031 5352.7 Genistin 18.301 4808.2 Daidzein 23.638 981.3 Daidzein 23.685 1464.7 Glycitein 24.601 1274.8 Glycitein 24.622 1919.2 Genistein 26.448 1010.7 Genistein 26.459 1453.8 Thời gian Diện tích lưu ( t lưu) peak (Speak) Daidzin 15.682 4024.4 Glycitin 16.933 Genistin STD 42 STD Bảng Kết đo chuẩn STD5 Thời gian STD5 Bảng Kết đo chuẩn STD0 Diện tích STD Thời gian Diện tích lưu ( t lưu) peak (Speak) lưu ( t lưu) peak (Speak) Daidzin 15.506 9288.4 Daidzin 0.83 552 Glycitin 16.326 2464.3 Glycitin 3.01 566 Genistin 18.372 12581.4 Genistin 8.21 322 Daidzein 23.719 2103.7 Daidzein 1.27 178.7 Glycitein 24.654 2140 Glycitein 0.58 188.5 Genistein 26.479 6074.9 Genistein 0.96 698.6 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn  Đường chuẩn Daidzin Speak Đường chuẩn Daidzin 10000 y = 59,412x + 569,63 R² = 0,9924 9000 8000 7000 Mẫu Daidzin Diện tích chuẩn (µg/ml) peak (Speak) STD0 0.83 552 STD1 17.18 1182.2 STD2 25.77 2230.1 STD3 50.55 4024.4 STD4 99.23 6535.3 STD5 148.03 9288.4 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 100 150 200 Hình 3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzin 43  Đường chuẩn Glycitin Speak Đường chuẩn Glycitin 10000 y = 59,412x + 569,63 R² = 0,9924 9000 Mẫu Glycitin Diện tích peak chuẩn (µg/ml) (Speak) STD0 3.01 566 STD1 6.1 1152.2 STD2 9.15 2146.7 STD3 17.31 3323.7 STD4 33.56 4808.2 STD5 51.28 6074.9 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 50 100 150 200 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitin  Đường chuẩn Genistin Speak Đường chuẩn Genistin Diện tích Mẫu Genistin chuẩn (µg/ml) 14000 y = 87,184x - 6,0576 R² = 0,9809 peak (Speak) STD0 8.21 322 STD1 16.91 621 STD2 25.36 2827.5 4000 STD3 50.72 5352.7 2000 STD4 98.51 8539.7 STD5 147.61 12581.4 12000 10000 8000 6000 0 50 100 150 200 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistin  Đường chuẩn Daidzein 44 Mẫu Daidzein Diện tích chuẩn (µg/ml) peak (Speak) STD0 1.27 178.7 STD1 2.48 317.3 1500 STD2 3.71 562.4 1000 STD3 7.43 981.3 500 STD4 14.43 1464.7 STD5 21.63 2103.7 Speak Đường chuẩn Daidzein 2500 y = 91,853x + 154,7 R² = 0,9855 2000 0 10 15 20 25 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzein  Đường chuẩn Glycitein Speak Đường chuẩn Glycitein Mẫu Glycitein Diện tích chuẩn (µg/ml) peak (Speak) STD0 0.58 188.5 STD1 1.92 365.5 STD2 2.88 519.9 STD3 5.76 1010.7 STD4 11.18 1453.8 STD5 16.75 2140 2500 y = 118,25x + 176,39 R² = 0,9891 2000 1500 1000 500 0 10 15 20 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitein  Đường chuẩn Genistein 45 Đường chuẩn Genistein Mẫu Genistein Diện tích chuẩn (µg/ml) peak (Speak) STD0 0.96 698.6 2000 STD1 1.68 896.6 1500 STD2 2.52 1094 1000 STD3 5.03 1274.8 500 STD4 9.77 1919.2 STD5 14.64 2464.3 Speak 3000 y = 123,84x + 677,13 R² = 0,9898 2500 10 15 20 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Genistein Bảng Tóm tắt kết đường chuẩn hợp chất isoflavone Hệ số tương Khoảng nồng độ tuyến quan R2 tính (µg/ml) y = 59.412x + 569.63 0.9924 0.83- 150.03 Glycitin y = 59.412x + 569.63 0.9924 3.01- 53.28 Genistin y = 87.184x – 6.0576 0.9809 8.21- 147.61 Daidzein y = 91.853x + 154.7 0.9855 1.27- 21.63 Glycitein y = 118.25x + 176.39 0.9891 0.58- 16.75 Genistein y = 123.84x + 677.13 0.9898 0.96- 14.64 Hợp chất Phương trình hồi quy Daidzin Nhận xét: Qua kết phân tích cho thấy, diện tích peak nồng độ hợp chất isoflavone phụ thuộc tuyến tính với cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao Do đó, ta sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng isoflavone mẫu thực khoảng tuyến tính khảo sát 46 3.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo Bảng Độ lặp lại Daidzin Bảng Độ lặp lại Glycitin Daidzin STT Glycitin Thời gian Các thông số lưu thống kê 15.276 Giá trị trung STT Thời gian Các thơng số lưu thống kê 16.132 bình: bình: 15.33 Xtb= 15.4344 15.682 Độ lệch chuẩn: 16.488 15.378 16.933 16.221 15.506 16.326 RSD (%) =1.05% Bảng 10 Độ lặp lại Genistin Thời gian lưu tương đối RSD (%) =1.9239% Bảng 11Độ lặp lại Glycitein Genistin STT SD = 0.3159 Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn tương đối Xtb= 16.42 Độ lệch chuẩn: SD = 0.162 Giá trị trung Daidzein STT Các thông số thống kê Thời Các thông số thống gian lưu kê 17.902 Giá trị trung bình: 23.786 Giá trị trung bình: 18.303 Xtb= 18.182 23.588 Xtb= 23.683 18.031 Độ lệch chuẩn 23.638 Độ lệch chuẩn 18.301 23.685 SD = 0.2038 Độ lệch chuẩn tương 18.372 SD = 0.0758 Độ lệch chuẩn đối: RSD(%) = 1.1208% 23.719 tương đối: RSD(%) = 0.3199% 47 Bảng 12 Độ lặp lại Glycitein Bảng 13 Độ lặp lại Genistein Genistein Glycitein STT Thời gian lưu STT Các thông số thống kê Thời gian lưu Các thông số thống kê 24.674 Giá trị trung bình: 26.183 Giá trị trung bình: 24.563 Xtb= 24.6228 26.424 Xtb= 26.3986 24.601 26.448 26.459 26.479 Độ lệch chuẩn SD = 0.1221 SD = 0.0437 24.622 24.654 Độ lệch chuẩn tương Độ lệch chuẩn tương đối: Theo kết đối: RSD(%) = 0.4627% RSD(%) = 0.1776% Nhậnxét: Độ lệch chuẩn khảo sát nhận thấy độ lệch chuẩn tương đối chất nhỏ 1% Như vậy, hệ thống sắc ký HPLC có độ lặp lại tốt, quy trình phân tích ổn định áp dụng để phân tích mẫu thực 3.4 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát xem nồng độ thấp chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu 𝐋𝐎𝐃 = 𝟑 × 𝑺𝒀/𝑿 𝐚 Giới hạn định lượng xem nồng độ thấp (xQ) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu 𝐋𝐎𝐐= × LOD Trong đó:  a hệ số góc phương trình hồi quy 48  SY/X độ lệch chuẩn mẫu trắng, xác định theo hàm LINEST excel  Kết LOD LOQ trình bày bảng 3.13 Bảng 14 Kết LOD LOQ Phương trình hồi quy SY/X LOD (ppm) LOQ (ppm) Daidzin y = 59.412x + 569.63 314.418 15.877 47.630 Glycitin y = 59.412x + 569.63 536.960 27.114 81.341 Genistin y = 87.184x – 6.0576 744.060 25.603 76.809 Daidzein y = 91.853x + 154.7 99.692 3.256 9.768 Glycitein y = 118.25x + 176.39 87.159 2.211 6.634 Genistein y = 123.84x + 677.13 75.732 1.835 5.504 3.5 Kết khảo sát mẫu củ sắn dây có isoflavone theo thành phần pha động hệ Sau chọn pha động theo hệ 2, tiến hành khảo sát mẫu sắn dây có isoflavone theo hệ kết thể hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 Hình Đồ thị biểu diễn thay đổi thành phần pha động theo hệ 49  Mẫu bột sắn dây methanol 700 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu bột sắn dây Nhận xét: dựa vào đường chuẩn thời gian lưu chuẩn khảo sát ta đối chiếu so sánh thấy có gần tương đồng thời gian lưu peak chất, lặp lại phép đo nhiều lần đưa kết luận có xuất peak sau mẫu bột sắn dây theo thứ tự ở: - Phút 14.338 Daidzin - Phút 16.311 Glycitin - Phút 18.461 Genistin - Phút 22.546 Daidzein  Mẫu cao sắn dây tinh Hình 11 Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây tinh Nhận xét: dựa vào đường chuẩn thời gian lưu chuẩn khảo sát ta đối chiếu so sánh thấy có gần tương đồng thời gian lưu peak chất, lặp lại 50 phép đo nhiều lần đưa kết luận có xuất peak sau mẫu bột sắn dây theo thứ tự ở: - Phút 14.825 Daidzin - Phút 16.569 Glycitin - Phút 18.898 Genistin - Phút 22.595 Daidzein  Mẫu cao sắn dây thơ Hình 12 Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây thô Nhận xét: dựa vào đường chuẩn thời gian lưu chuẩn khảo sát ta đối chiếu so sánh thấy có gần tương đồng thời gian lưu peak chất, lặp lại phép đo nhiều lần đưa kết luận có xuất peak sau mẫu bột sắn dây theo thứ tự ở: - Phút 14.525 Daidzin - Phút 16.578 Glycitin - Phút 18.891 Genistin - Phút 23.904 Daidzein Kết luận : Kết khảo sát cho thấy mẫu sắn dây chạy theo hệ pha động chọn (hệ 2) cho kết peak phân tách rõ ràng, phát củ sắn dây chứa chất Daidzin, Glycitin, Genistin, Daidzein hợp chất isoflavon 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết đề tài “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC” cho kết luận sau: Chọn điều kiện phù hợp để tách xác định đồng thời sáu hợp chất isoflavone daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector UV/Vis Cột tách Đường kính 4,6mm Thể tích vịng mẫu 10 µl Bước sóng 260nm Pha tĩnh octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18) Thành phần pha động Pha động A : Nước khử ion chứa 0,05 % acid phosphoric Pha động B : Acetonitril Tốc độ dòng 1.5 ml/phút Trong cao sắn dây thô cao sắn dây tinh khảo sát phát chất có peak: daidzin, genistin, daidzein Có thể kết luận củ sắn dây phát 3 chất daidzin, genistin, daidzein hợp chất isoflavon nghiên cứu Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu đo HPLC– chiết chất tối ưu Cân 1.0619g mẫu bột củ sắn ẩm (tương đương 1g mẫu khơ) cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 8.5ml Acetonitril Đem siêu âm vịng 10 phút Sau đó, lắc 60 phút với tốc độ 140 vịng/ phút nhiệt độ phịng Chuyển tồn dung dịch vào ống ly tâm dùng 5ml nước cất để tráng bình (nước tráng cho vào ống ly tâm) Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút thời gian phút Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 25ml (bảo quản -180C) Lọc qua màng PTFE 0,2 µm đo HPLC Xác định LOD, LQD khoảng tuyến tính hợp chất isoflavone sau: 52 Khoảng LOD LOQ Phương trình hồi (µg/ml) (µg/ml) quy Daidzin 15.877 47.630 y = 59.412x + 569.63 0.9924 0.83- 150.03 Glycitin 27.114 81.341 y = 59.412x + 569.63 0.9924 3.01- 53.28 Genistin 25.603 76.809 y = 87.184x – 6.0576 0.9809 8.21- 147.61 Daidzein 3.256 9.768 y = 91.853x + 154.7 0.9855 1.27- 21.63 Glycitein 2.211 6.634 y = 118.25x + 176.39 0.9891 0.58- 16.75 Genistei 1.835 5.504 y = 123.84x + 677.13 0.9898 0.96- 14.64 Hợp chất R2 tuyến tính (µg/ml) n Đề xuất Như vậy, với kết thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc phân tích đồng thời ba hợp chất isoflavone mẫu sắn dây Em hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng phương pháp HPLC để xác định hợp chất isoflavone nói riêng hợp chất khác nói chung mẫu sắn dây mẫu hạt bã khác có chứa hợp chất isoflavone 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]“Comprasion of extraction solvents and techniques used for the assay of isoflavones from soybean” D.L Luthria et al./Food Chemistry 105 (2007) 325–33 [2] Báo cáo kết đề tài khoa học công nghệ “Bước đầu xác định hàm lượng daidzein, genistein 17 acid amin sắn dây sản phẩm chế biến”, 2007 [3] https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFn_d%C3%A2y [4] Bùi Xuân Vững, “Lý thuyết sắc kí lỏng hiệu cao, Khoa Hóa” - Trường Đại học Sư phạm, 2012 [5] Đỗ Thị Hoa Viên (2004) Quy trình chiết tách phytoestrogen từ đậu tương Báo cáo kết nghiên cứu Đề tài KC 04-17-2004 “Nghiên cứu giải pháp công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam”, 10-16 [6] Lena Jankowiak, Olivera Trifunovic, Remko M Room, Atze J van der Goot (2013), The potential of crude okara for isoflavone production [7] ”Determination of Total Soy Isoflavones in Dietary Supplements, Supplement Ingredients, and Soy Foods by High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection: Collaborative Study” Published in final edited form as: J AOAC Int 2008 ; 91(3): 489–500 [8] Lena Jankowiak, Olivera Trifunovic, Remko M Room, Atze J van der Goot (2013), The potential of crude okara for isoflavone production [9] “Solvent extraction selection in the determination of isoflavones in soy foods”, Journal of Chromatography B, 777 (2002) 129–138 [10] Kaufman PB, Duke JA, Brielmann H, Boik J, Hoyt JE (1997) “A comparative survey of leguminous plants as sources of the isoflavones genistein and daidzein: Implications for human nutrition and health” J Altern Compl Med 3:7-12 54 ... tài: ? ?Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC? ?? Giới thiệu chung 3.1 Nội dung ? ?Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp. .. ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC THƯỢNG THỊ KIM PHƯỢNG Bước đầu xác định số hợp chất isoflavone có củ sắn dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC Ngành đào tạo: Cử nhân Hố phân tích – Mơi trường... dây phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC? ?? 3.2 Mục đích đề tài  Khảo sát điều kiện tối ưu để xác định số hợp chất isoflavone từ dịch chiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao -HPLC  Khảo sát