Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Dựa vào khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [4], [30] nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, bằng hỗn hợp dung môi sau đây: CH3OH - HCl 2 N với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25 [4].
Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm rau củ dự kiến gồm các bước sau:
- Đồng nhất mẫu: Nghiền, xay mẫu.
- Cân chính xác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL.
- Thêm khoảng 35 mL dung môi chiết hỗn hợp CH3OH – HCl 2 N vào ống ly tâm.
- Lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thủy phân ở nhiệt độ 800C trong 150 phút.
- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút.
- Gạn lấy phần dịch trong, định mức 50 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 àm.
- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần).
3.2.1. Khảo sát thời gian thủy phân
Anthocyanin là chất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: oxi không khí, nhiệt độ, ánh sáng…do đó thời gian thủy phân trong quá trình xử lý mẫu là rất quan trọng đối với việc nghiên cứu này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian thủy phân mẫu thực rau trong 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150
phút và tiến hành chạy máy trong điều kiện xử lý dự kiến ở trên, sử dụng chương trình gradient 2 – hệ pha động 1 (bảng 3.2).
Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút).
Bảng 3.5: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân.
Thời gian (phút)
Lượng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (mL)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lượng Chất phân tích
(mg/100 g)
Del
60 10,6649 50 1 95159 2,76 1,29
90 10,6013 50 1 97173 2,82 1,33
120 10,9061 50 1 100223 2,90 1,33
150 10,2999 50 1 79734 2,31 1,12
Cya
60 10,6649 50 1 2302013 54,04 25,34
90 10,6013 50 1 2506867 58,85 27,76
120 10,9061 50 1 2863425 67,22 30,82
150 10,2999 50 1 2599353 61,02 29,62
Pel 60 10,6649 50 1 296886 2,45 1,15
90 10,6013 50 1 313625 2,58 1,22
0 5 10 15 20 25 30 35
1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35
60 90 120 150
C (mg/100 g) C (mg/100 g)
phút
delphinidin pelargonidin cyanidin
120 10,9061 50 1 326313 2,69 1,23
150 10,2999 50 1 291372 2,40 1,17
Như vậy theo kết quả thu được thì thủy phân trong 120 phút cho hàm lượng các chất là lớn nhất. Do đó chúng tôi sẽ chọn điều kiện thời gian thủy phân là 120 phút trong các khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân
Khảo sát nhiệt độ thủy phân theo quy trình dự kiến với thời gian thủy phân 120 phút tại các nhiệt độ: 500C, 600C, 700C, 800C; sử dụng chương trình gradient 2 – hệ pha động 1 (bảng 3.2).
Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau.
Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau.
Nhiệt độ (0C)
Lượng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (mL)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lượng Chất phân tích
(mg/100 g) Del
50 9,5522 50 1 22769 0,64 0,34
60 10,8217 50 1 27389 0,77 0,36
70 9,4100 50 1 20602 0,58 0,31
22 23 24 25 26 27 28 29 30
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
50 60 70 80
C (mg/100 g) C (mg/100 g)
t (oC)
delphinidin pelargonidin cyanidin
80 9,8620 50 1 26815 0,75 0,38
Cya
50 9,5522 50 1 2302013 54,04 28,29
60 10,8217 50 1 2693681 63,24 29,22
70 9,4100 50 1 1958794 45,98 24,43
80 9,8620 50 1 2362384 55,46 28,12
Pel
50 9,5522 50 1 250674 1,98 1,03
60 10,8217 50 1 281553 2,22 1,03
70 9,4100 50 1 236790 1,87 0,99
80 9,8620 50 1 270572 2,13 1,08
Như vậy theo kết quả thu được thì thủy phân tại nhiệt độ 800C cho hàm lượng các chất là lớn nhất. Do đó chúng tôi sẽ chọn điều kiện nhiệt độ thủy phân là 800C trong các khảo sát tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu
Dựa trên các bài báo [4], [30] chúng tôi sử dụng hỗn hợp dung môi CH3OH – HCl 2 N với các tỷ lệ: 90:20; 85:15; 80: 20; 75:25, nhiệt độ thủy phân 800C trong 120 phút, sử dụng chương trình gradient 2 – hệ pha động 1 (bảng 3.2).
Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 N trong dung môi chiết mẫu.
0 5 10 15 20 25 30 35
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
10 15 20 25
C (mg/100 g) C (mg/100 g)
HCl 2 N (%)
delphinidin pelargonidin cyanidin
Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau.
Tỷ lệ CH-
3OH : HCl
Lượng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (mL)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lượng Chất phân
tích (mg/100 g) Del
90:10 10,6358 50 1 165814 4,42 2,08
85:15 9,5705 50 1 180912 4,82 2,52
80:20 9,8526 50 1 191276 5,10 2,59
75:25 10,2504 50 1 160533 4,28 2,09
Cya
90:10 10,6358 50 1 2506020 55,36 26,02
85:15 9,5705 50 1 2650677 58,55 30,59
80:20 9,8526 50 1 2499423 55,21 28,02
75:25 10,2504 50 1 2225993 49,17 23,98
Pel
90:10 10,6649 50 1 282766 2,13 1,00
85:15 10,6013 50 1 332637 2,50 1,18
80:20 10,9061 50 1 335158 2,52 1,16
75:25 10,2999 50 1 267340 2,01 0,98
Như vậy theo kết quả thu được thì theo tỷ lệ dung môi CH3OH - HCl 2 N (85:15) cho hàm lượng các chất chiết được là lớn nhất.
Kết luận: Từ các kết quả ở trên chúng tôi quyết định đưa ra quy trình chiết mẫu như sau:
- Đồng nhất mẫu: Nghiền, xay mẫu.
- Cân chính xác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL.
- Thêm khoảng 35 mL hỗn hợp CH3OH – HCl 2 N (85:15) vào ống ly tâm.
- Lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thủy phân ở nhiệt độ 800C trong 120 phút.
- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút.
- Gạn lấy phần dịch, định mức 50 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 àm.