CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN
1.7. Tổng quan về HPLC
1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng
Hình 1.3. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
- Bộ phận loại khí (degasser): Trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 àm) và đuổi khớ hũa tan trong pha động để trỏnh việc khớ hũa tan cú thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): Trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp suất cao
Chương trình dung môi ở áp suất thấp: Mỗi bình chứa dung môi có một van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
Hệ thống cấp
dung môi Bơm Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký Detector
Hệ thống thu nhận và xửa lý số liệu (máy ghi,
máy tính) Buồng cột
b. Bộ phận tiêm mẫu
- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng chứa mẫu cú dung tớch khỏc nhau, thường dựng loại 0,50 – 20 àL. Cú vũng chứa mẫu lớn hơn.
- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột. Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.
- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa, cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào cột hằng định nên độ lặp lại cao.
c. Cột sắc ký
- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm.
Cột nhồi thường cú hạt cỡ 5 – 10 àm. Ưu điểm của cột nhồi cú hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn.
- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước hạt lớn hơn.
- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.
Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:
- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:
Gốc octadecyl (C18)
Gốc octyl (C8)
Gốc phenyl propyl - Pha tĩnh phân cực có R’ là:
Cyano
Amino
Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như C2H2(OC2H4OH)2, H2O. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan.
- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C18 hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như H2O, CH3CN.
d. Detector
Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và sử dụng các nguyên lý khác nhay tùy thuộc tính chất đối tượng cần nghiên cứu:
- Detector hấp thụ UV-Vis
- Detector huỳnh quang - Detector chỉ số khúc xạ - Detector tán xạ bay hơi - Detector đo dòng
- Detector độ dẫn
Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector mảng diod quang (photodiode array – PDA), loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ UV gần và Vis. Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp. Qua đó, toàn bộ phổ UV-Vis theo thời gian lưu sẽ được ghi lại.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước [1], [2].
e. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu
Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả.