- Khoảng tin cậy: x± X S
2.2.2.Đánh giá phương pháp định lượng
2.2.2.1. Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp
Tiến hành khảo sát các dung dịch acid succinic có nồng độ từ 0,1% tới
1% so với nồng độ aitesunat nguyên liệu 2 mg/ml (nghĩa là từ 0,002 mg/ml tới
0,02 mg/ml).
Pha 5 mức nồng độ acid succinic như sau: 0,1% (0,002 mg/ml); 0,25% (0,005 mg/ml); 0,5% (0,01 mg/ml); 0,75% (0,015 mg/ml); và 1% (0,02
mg/ml). Mỗi nồng độ tiến hành sắc ký 3 lần theo quy trình rồi lấy kết quả trung bình. Các kết quả được ghi ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phưoíng pháp. Nồng độ acid
succinic (mg/ml) 0,002 0,005 0,01 0,015 0,02 Diện tích
(mAu.min) 0,0498 0,1256 0,2506 0,3708 0,5019
Từ kết quả ta thu được ở bảng 2.2, chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic thu được trên sắc ký đồ và nồng độ của dung dịch. Phưofng trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan này là:
y = 24,986x-0,0001. Với hệ số tưcỉng quan: r = 0,9999 (r > 0,99). Độ lệch chuẩn của y_intercept: SB = 0,0023.
Khoảng tin cậy của y_intercept; AB = 0,0073 (p = 0,95; n = 5). - 0,0074 < B < 0,0072 chứa gốc toạ độ.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của acid succinic được ghi ở hình 2.1.
0.005 0.01 0.015
nồng độ (mg/ml)
0.02 0.025
Hình 2.1: ĐỒ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của acid succinic.
Từ kết quả thu được ở hình 2,1 cho thấy tất cả các giá trị thu được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đều cả hai phía của đường hồi quy.
Như vậy trong khoảng nồng độ acid succinic từ 0,002 mg/ml đến 0,02 mg/ml (từ 0,1 - 1% so với nồng độ định lượng aitesunat 2 mg/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của acid succinic.
2.22.2. Đảnh giá độ lặp lại của phương pháp
Xác định ở nồng độ làm việc của acid succinic là 0,012 mg/ml (0,6% so với artesunat nguyên liệu).
Tiến hành: Pha 6 mẫu thử acid succinic ở nồng độ 0,6% so với nguyên liệu, đồng thời làm mẫu chuẩn acid succinic tương đương.
Cách pha: Cân lượng acid succinic chính xác khoảng 10,0 mg rồi pha trong bình định mức 25 ml, lấy chính xác 3,0 ml dung dịch trên pha loãng trong bình định mức 100 ml được dung dịch 0 ,012 mg/ml (0,6%).
Tiêm lần lượt từng mẫu thử và chuẩn vào hệ thống HPLC đã chạy ổn định với pha động 30 phút. Tiến hành sắc ký theo quy trình đã chọn, tính toán hàm lượng các chất trong mẫu thử. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng
độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử song song, RSD <2%. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phưcmg pháp được ghi ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp. r r Khối lượng chuẩn (mg) Diện tích (mAu.min) Khối lượng thử(mg) Diện tích (mAu.min) Hàm lượng(%) 1 10,0 0,3072 9,9 0,3057 100,52 2 10,0 0,3072 9,9 0,3060 100,61 3 10,0 0,3072 10,0 0,3061 99,64 4 10,0 0,3072 10,0 0,3062 99,67 5 10,0 0,3072 10,0 0,3068 99,87 6 10,0 0,3072 10,2 0,3079 98,26 Số liệu thống kê c = 99,76%; s = 0,8467; 5- = 0,3457 Ax = taịn-iy^- = 0,888 (với n = 6, p =0,95). Độ lệch chuẩn tương đối RSD= 0,8487(%) Khoảng tin cậy của hàm lượng: 99,76 + 0,888.
Nhận xét: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp cho thấy, trong các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả < 2%. Như vậy phương pháp định lượng tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu do chúng tôi xây dựng có độ lặp lại cao.
2.2.23. Đánh giá tính đúng của phương pháp
Đánh giá tính đúng của phương pháp được tiến hành dựa trên việc khảo sát khả năng tìm lại của tạp chất khi thêm những lượng đã biết của nó vào mẫu thử. Đối với tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu, tính đúng được xác định bằng cách thêm ở 3 mức nồng độ theo dãy nồng độ khảo sát là: 0,1% (0,002 mg/ml), 0,5% (0,01 mg/ml), 1% (0,02 mg/ml).
Tiến hành:
• Pha dung dịch chuẩn acid succinic: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cân chính xác khoảng 10,0 mg acid succinic cho vào bình định mức 20 ml, hòa tan và thêm dung môi đến vạch được dung dịch (A). Lấy chính xác 2,0 ml dung dịch A đem pha loãng trong bình định mức 25 ml được dung dịch B (0,04 mg/ml).
• Dung dịch artesunat nguyên liệu 2 mg/ml:
Cân chính xác khoảng 40,0 mg artesunat nguyên liệu pha trong bình định mức 20 ml. Làm 5 mẫu, tiến hành sắc ký xác định acid succinic trong nguyên liệu.
• Dung dịch artesunat nguyên liệu chứa 0,1% chuẩn acid succinic:
Tiến hành pha dung dịch artesunat như trên nhưng thêm chính xác 1,0 ml dung dịch B rồi thêm dung môi đủ 20 ml. Làm 3 mẫu, tiến hành sắc ký theo quy trình, lấy kết quả trung bình.
• Dung dịch artesunat nguyên liệu chứa 0,5% chuẩn acid succinic:
Làm như trên nhưng thêm chính xác 5,0 ml dung dịch B rồi thêm dung môi đủ 20 ml. Làm 3 mẫu, tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình.
• Dung dịch artesunat nguyên liệu chứa 1% chuẩn acid succinic:
Làm như trên nhưng thêm chính xác 10,0 ml dung dịch B rồi thêm dung môi đủ 20 ml. Làm 3 mẫu, tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình.
Dung môi pha các dung dịch là MeOH : Nước (70 : 30).
Kết quả khảo sát tính đúng được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.2, Bảng 2.4: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp. Nồng độ thêm(%) Lượng acid succinic thêm trung bình (mg) Lượng acid succinic thu hồi trung bình (mg) % Tìm lại trung bình Khoảng tin cậy(%) 0,1 0,0404 0,0399 98,76 98,76±0,30 0,5 0,202 0,201 99,00 99,00+0,41 1,0 0,400 0,397 99,25 99,25 ±0,28 26
Nhận xét: Giá trị trung bình của tỉ lệ thu hồi luôn nằm trong khoảng 98% -
102%, như vậy phưcmg pháp chúng tôi xây dựng là đúng.
Để đánh giá sai số tỉ lệ và sai số hệ thống của phương pháp, chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa lượng hoạt chất thêm vào và lượng hoạt chất thu hồi. ĐỒ thị biểu diễn mối tương quan giữa lưọmg hoạt chất thêm vào và lượng hoạt chất thu hồi ở hình 2.2.
Phương trình hồi quy về mối tưcỉng quan giữa lượng hoạt chất thêm vào và lượng thu hồi của hoạt chất là:
y = 0,99293x + 0,00001. với hệ số tương quan = 1. Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,001995.
Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,000518. Khoảng tin cậy của độ dốc: Aa = 0,0241.
0,9688 < A < 1,0170 chứa 1 (với độ tin cậy p = 0,95). Khoảng tin cậy của y_intercept: AB = 0,00737.
- 0,00736 < B < 0,00738 chứa gốc toạ độ (với độ tin cậy p = 0,95). Như vậy ta thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, phưcmg pháp xây dựng có độ đúng cao, không mắc sai số tỉ lệ (khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1) và không có sai số hệ thống (khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0).
'<0
Xi
y=0.99293x + 0.00001
R^=1
Lượng acid succinic thêm (mg)
Hình 2.2: Đồ thị đánh giá sự tương quan giữa lượng acid succinic thêm vào và lượng thu hồi.
2.2.2.4. Tính đặc hiệu của phương pháp
Để định lượng một chất thì chúng ta phải xác định được chất đó trong sự có mặt của các chất khác. Như trong trường hợp định lượng acid succinic trong artesunat nguyên liệu, bản thân artesunat cũng như các tạp chất khác có thể là tác nhân ảnh hưởng tới kết quả định lượng acid succinic. Do vậy trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu để xây dựng một phương pháp định lượng acid succinic trong artesunat nguyên liệu mà sự có mặt của artesunat cũng như các tạp chất (có thể có) không ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi tiến hành như sau: • Pha dung dịch acid succinic 5%: Cân chính xác khoảng 10,0 mg acid succinic, cho vào bình định mức 20 ml. Thêm hỗn hợp dung môi Me0 H/H20
vào hoà tan hoàn toàn acid succinic, thêm dung môi cho đủ thể tích.
• Pha dung dịch artesunat 2 mg/ml: Cân chính xác khoảng 40,0 mg artesunat đối chiếu nồng độ 98,6% (do Viện kiểm nghiệm sản xuất), cho vào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bình định mức 20 ml. Hoà tan và thêm dung môi tới vạch.
• Pha dung dịch artesunat 2 mg/ml có thêm 5% DHA và 5% acid succinic: tiến hành như trên nhưng cho thêm 5% DHA và 5% acid succinic. Trộn đều. Thêm dung môi cho đủ thể tích.
Tiến hành tiêm lần lượt 20 ịJẢ mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống HPLC đã chạy ổn định 30 phút với pha động. Tiến hành sắc ký theo quy trình đã chọn. Song song tiến hành ghi sắc đồ của mẫu trắng (hỗn hợp dung môi MeOH/HjO). Sắc đồ của các dung dịch được ghi lại ở các hình 2.3; hình 2.4; hình 2.5; hình 2.6 và bảng 2.5.
Sắc ký đồ của dung dịch acid succinic (0,5 mg/ml) cho một pic chính tại thời gian lưu Ir = 2,800 phút, cân đối và không có pic lạ tại vị trí của pic chính.