XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGŨ cốc BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký

BÁO CÁO PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG VÀ ĐỘC TỐ TRONG SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.. • Việc nghi

xin chào cô và các bạn

BÁO CÁO

PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG VÀ ĐỘC TỐ TRONG SẢN PHẨM

NÔNG NGHIỆP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Tình hình chung

• Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người

• Độc tố aflatoxin là độc tố nguy hiểm và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc

• Việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con

người và các động vật kinh tế

ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillu flavus và Aspergillus parasiticus.

Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư.

 Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc ( ngô , kê , lúa miến , gạo, lúa mì), hạt có dầu ( lạc , đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (  

ớt , hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ , gừng ) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…

 Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin.

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

PHÂN LOẠI AFLATOXIN

• Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên

• Aflatoxin B1 là dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus

và Aspergillus parasiticus.

• Aflatoxin B1 & B2 : được sinh ra bởi Aspergillus flavus và A

parasiticus.

• Aflatoxin G1 & G2 : được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus.

• Aflatoxin M1 : chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật

• Aflatoxin M2 : chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò

được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin

Giới hạn tối đa (ML) Aflatoxin theo quy định

của Bộ Y tế Việt Nam

 

ML (microgam/kg)   Tiêu chí

 

5   Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung

 

0,5   Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa  

15   Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung

Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người

lượng Aflatoxin không vượt quá 10ppb.

Phương pháp xác định aflatoxin

2 nhóm chính

 Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

 

 Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA)

và cột sắc kí ái lực miễn dịch.

Sắc ký bản mỏng Khái niệm

Cấu tạo

Ứng dụng

là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp

 Pha tĩnh:một lớp mỏng các chất hấp phụ: silica gel, aluminium oxide, hoặc

cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ.

 Pha động: dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp

• Định độ tinh khiết của chất phóng xạ trong dược khoa

• Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.

• Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng.

• Nhận biết những hóa chất trong một hỗn hợp

• Giám sát các phản ứng hữu cơ

Xác định Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc

 Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính.

 Các gel này được gắn vào những cột nhỏ

 Khi cho dịch chiết dẫn mẩu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại

 Sau khi toàn bộ mẫu đã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần không đặc hiệu bám lại

 Aflatoxinsex được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol

ĐỊNH TÍNH

Chuẩn bị mẫu

 Xay 1kg mẫu đủ lọc sàng 1mm Trộn đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl

và 125ml dung dịch chiết mẫu Methanol 75% cho vào bình định mức Lắc đều trong 30 phút

 Để lắng trong vòng 10- 15 phút

 Lọc dịch chiết qua giấy lọc

 Lấy 15 ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15

ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu)

Phân tích mẫu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch

• Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ Mở nắp cột sắc ký ái lực

miễn dịch cho đầy nước vào trong ống.

• Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột

• Cho 15 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh.

• Dịch lỏng chảy qua cột với tốt độ khoảng 1 giọt/giây

• Khi dịch mẫu tới đầu cột ,cho 10ml nước cất vào xiranh

để rửa cột Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất.

• Để cột ráo nước.

• Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, để

methanol chảy từ từ qua cột.

ĐỊNH LƯỢNG

• Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-45 độ C Hoà tan cặn lại trong 200 l Benzen-Acetonitrit

(98:2).

• Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ cách nhau 1cm trở lên.

• Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen –Acetonitril(98:2)

• Dùng Microsyringe chấm lên bản silicagel từ trái sang phải theo thứ tự :3 chấm mẫu: 2, 5, 10 l, 1 nội chuẩn: 10 l mẫu và 10l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B 1 ), 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2 l chuẩn (0,5ppm

Aflatoxin B1)

• Dung dịch triển khai: Chloroform- Aceton (9:10) Cho khoảng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai Cho bản silicagel vào bình, đậy kín Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản

khoảng 0,5cm

• Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng Soi trên đèn UV Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng

• So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu Để khẳng định mẫu có nhiễm Alatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu.

• Tính toán nồng độ Alatoxin B1 có trong mẫu

TÍNH TOÁN

Nồng độ Afatoxin B1 có trong mẫu : S.Y.V

Trong đó X.W

S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X  l mẫu ()

Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5 g/ml hoặc 0,5ppm)

V : thể tích hoà cặn (200 l)

X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn

W : số gam mẫu đi qua cột (1g)

KHUYẾN CÁO

• Đeo găng tay khi làm thí nghiệm

• Các vết Aflatoxin phải dược lau sạch bằng nước javen 10%

• Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải dược ngâm trong nước javen 10% tói thiểu là 30 phút trước khi rửa

KẾT LUẬN

• Aspergillus là một loại nấm gây bệnh cơ hội, có thể tồn tại khắp nơi trong mọi điều

kiện.

• Aflatoxin là một sản phẩm thứ cấp được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát

tiển của một số loài nấm Aspergillus, thường thấy nhất là Aspergillus flavus,

Aspergillus parasiticus và Aspergillus fumigatus.

• Cách dự phòng có thể thực hiện là giữ cho cơ thể không bị suy giảm sức đề kháng, nâng cao thể trạng, tập luyện thể dục thể thao, có chế độ ăn uống nghỉ ngơi phù

hợp

• Đối với người có cơ địa thuận lợi cho sự nhiễm nấm, nên đi khám định kỳ và chụp phim X-quang sớm khi thấy có triệu chứng bất thường để có thể phát hiện và điều trị kịp thời

xin cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe