trong HPLC
> Cách đánh giá diện tích pic
* Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic người ta có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.
* Đánh giá chiều cao của pic: Điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao của pic là các chỉ số k ’ hằng định. Đo chiều cao pic chỉ thích hợp
J khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:
• Phương pháp ngoại chuẩn.
Dựa trên việc so sánh mẫu thử và mẫu chuẩn được phân tích trong cùng một điều kiện. Kết quả của chất chưa biết được tính toán dựa trên chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phương pháp nội chuẩn.
Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
• Phương pháp thêm.
Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ. Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn. Các pic thu
■* được của dung dịch chuẩn và thử được đo trong cùng một điều kiện sắc ký.
Phương pháp này có thể thực hiện nhiều lần. Trường hợp đơn giản nhất với một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích pic. Với phương pháp thêm nhiều lần với nồng độ khác nhau ta có phương pháp thêm đường chuẩn.
• Phương pháp phần trăm diện tich pic (hoặc phần thăm chiều cao pic). Là phương pháp tính nồng độ của mẫu thử dựa trên diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng toàn bộ pic có trong sắc ký đồ. Trong phương pháp HPLC, công thức này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của Detector trên các chất là như nhau nếu không như nhau, khi mỗi chất cần phải có hệ số điều chỉnh.
PHẨN II
ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ -
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Đôi tượng nghiên cứu
+ Nguyên liệu artesunat.
+ Nguyên liệu dihydro artemisinin. + Nguyên liệu acid succinic.
2.2. Phương tiện, dụng cụ hoá chất
> Dụng cụ máy móc.
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - Detector u v diode aưay. + Máy quang phổ u v - VIS Lambda EZ 210.
r + Máy lắc siêu âm - SONOREX.
+ Máy đo pH Meter 3305 - Jenway. + Máy lọc chân không - Satorius.
+ Cân phân tích Mettler AB 204 độ chính xác 0,lmg. + Bình định mức 25, 50, 100, 1000 ml.
+ Cốc đong 50, 100, 500, 1000 ml.
+ Pipet các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45 Ịjm.
+ Tủ sấy và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. > Hoá chất.
+ Artesunat: Dạng nguyên liệu do Bộ Môn Công Nghiệp Dược Trường Đại Học Dược Hà Nội sản xuất.
+ Artesunat: Đối chiếu hoá học hàm lượng 98,6% (SKS 019261) của
+ Dihydro artemisinin: Dạng nguyên liệu do bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại Học Dược Hà nội sản xuất.
+ Acid succinic: Dạng nghuyên liệu do Trung Quốc sản xuất. + Muối KH2P 0 4 dùng cho PA.
+ Methanol: Dùng cho HPLC (Merk/Prolabor). + Acetonitril: Dùng cho HPLC (Merk/Prolabor). + Acid Phosphoric đặc dùng cho PA.
+ Nước cất 2 lần dùng cho HPLC và một vài hoá chất khác.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượngartesunat bằng phương pháp HPLC artesunat bằng phương pháp HPLC
+ Tham khảo các phương pháp định lượng artesunat đã công bố.
+ Tham khảo các phương pháp định lượng artesunat dang áp dụng ở Việt Nam.
+ Tham khảo tính đặc hiệu của các phương pháp hiện đang sử dụng để định lượng artesunat ở nước ta và một số phương pháp khác.
+ Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hoá học của artesunat cũng
như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu xây dựng quy
trình kỹ thuật định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC.
+ Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp đó.
> Khảo sát điều kiện sắc ký: Chọn cột, pha động, bước sóng xác định và tốc độ dòng thích hợp để tách tốt 3 chất: Artesunat, DHA, acid succinic. > Xây dựng phương pháp định lượng, đánh giá tính thích hợp của hệ thống
2.3.2. Đánh giá phương pháp vừa xảy dựng vê các mặt: tính chính xác, tính tuyến tính, tinh đúng và đặc biệt chú trọng tới tính đặc hiệu của phương pháp
+ Đánh giá tính chính xác của phương pháp.
+ Đánh giá tính tuyến tính giữa nồng độ artesunat với diện tích pic trên sắc ký đồ.
+ Đánh giá độ đúng của phương pháp.
+ Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp. Đây là chỉ tiêu rất quan trọng vì DHA và acid succinic là nguyên liệu trong quá trình tổng hợp và cũng là sản phẩm phân huỷ trong quá trình bảo quản artesunat, sự có mặt của hai chất này luôn ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Vì vậy rất cần thiết phải đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp.
2.3.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả
* Giá trị trung bình: X = ~ ^ xi
J7x,. - x f
* Độ lệch chuẩn: s = ]Ị—---
V n- 1
* Độ lệch chuẩn tương đối: Sx= ^ x io o
X
* Sai số chuẩn: S x =
PHẦN III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC
3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký
Chọn phương pháp sắc ký: Artesunat là hợp chất hữu cơ phân cực. Vì vậy để phân tích và định lượng tốt, chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột sắc ký thông dụng là Nucleosil C8, C18; Lichrosorb RP8, RP18; Supelcosil LC8, LC18.... Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng cột
Nucleosil C18 (250 X 4 mm; 5 ụ,m).
Chọn pha động: Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là acetonitil, methanol, nước, hay hỗn hợp của acetonitril (methanol) với nước. Do artesunat dễ tan trong acetonitril và methanol, để kéo dài thời gian lưu thích hợp của chất phân tích pha động phải cần nước; để khống chế mức độ ion hoá của artesunat cần sử dụng đệm pH acid.
Chọn bước sóng: Để tách và định lượng được artesunat sau khi rửa giải, dựa vào cấu trúc phân tử của artesunat là có oxy và nhóm carbonyl nên sẽ hấp
thụ u v ở bước sóng ngắn. Vì vậy, chúng tôi dự kiến dùng Detector u v bước
sóng ngắn trong nghiên cứu này.
3.1.2. Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký
Lựa chọn bước sóng thích hợp: Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện artesunat, chúng tôi tiến hành quét phổ u v trên máy quang phổ UV-VIS Lambda EZ210, kết quả được trình bày ở hình 4.
Phổ hấp thụ của artesunat cho thấy cực đại hấp thụ là 215,6nm. Vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 216nm.
Report Date: 16:23:01, 0 5 /2 6 /2 0 0 4 A rtesu n at/M eO H Abs Sam ple: Run Date: Operator: Com m ent: In strum ent Model: Serial N um ber: ROM Version: A rte s u n a t/M e O H 1 5 :0 6 :5 8 , 0 5 / 2 5 / 2 0 0 4 D etault Tung La m b d a E Z 2 1 0 sp ectro p h o to m eter 2 5 5 0 0 2
In strum ent P aram e ters M easu rem en t Type: D ata Mode:
sta rtin g VVavelength: Ending VVavelength: Scan Speed: Sam plinR Interval: Slit VVidth: Lam p Change: Baséline Correction: Response: Path LenRth: Processing P ertorm ed Savitsky-Golav S m oothed Sm oothing Order: N um ber of Points: N um ber of Tim es: Savitsky-Golay S m o oth ed
Sm oothing Order: N um ber of Points: N um ber of Tim es:
Peak InteRration WavelenRth Scan Abs _ 3 5 0 .0 nm 1 9 0 .0 nm 8 0 0 n m /m in 0 .2 nm 2 n m 3 4 0 .0 nm User M ediu m 10.0 mm 3 6 0 1
Hình 4: Phổ hấp thụ tử ngoại của artesunat.
Lựa chọn pha động: Trong quá trình làm thực nghiệm chúng tôi đã phối hợp các dung môi methanol, acetonitril, đệm pH acid với các thành phần và tỷ
lệ khác nhau, cuối cùng pha động cho kết quả phân tách tốt được lựa chọn như sau:
Đệm pH 3,5 : acetonitril: Methanol tỷ lệ 50:10:40.
Đệm pH 3,5: Hoà tan l,36g KH2P 0 4 trong nước và thêm nước vừa đủ đến vạch 1000 ml, điều chỉnh về pH 3,5 bằng H3P04 đặc, sau đó lọc và siêu âm đuổi khí.
Methanol, acetonitril được siêu âm đuổi khí trước khi sử dụng.
Lựa chọn tốc độ dòng: Qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 0,8 ml/phút cho kết quả tách tốt nhất, thời gian lưu phù hợp cho phân tích.
Tóm lại; từ các kết quả khảo sát trên chúng tôi đã xây dựng một chương trình sắc ký để định lượng artesunat như sau.
Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 X 4 m; 5 ụ m).
Detector u v diode aưay X = 216 nm.
Pha động. Đệm pH 3,5 : acetonitril: methanol (50 : 10 : 40). Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 ụ 1.
Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng.
3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thông
Để tiến hành sắc ký định lượng, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống.
Pha dung dịch artesunat chuẩn: Trong bình định mức 25 ml cân chính xác khoảng 0,1 g artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch,
lọc qua màng lọc 0,45 n 1. (nồng độ 4mg/ml).
Tiêm 20 ụ 1 dung dịch trên vào hệ thống sắc ký và tiến hành trong điều
kiện đã chọn (lặp lại 5 lần như vậy). Ghi diện tích pic và hệ số bất đối xứng thu được trên sắc ký đồ. Kết quả thử tính thích hợp của hệ thông sắc ký được trình bày dưới bảng sau:
STT Diện tích pic (mAƯ)
Số liệu thống kê Hệ số bất đối
xứng 1 93,052 93,383 1,10 2 93,838 s = 0,3152 1,08 3 93,524 Sx= 0,338 1,12 4 93,137 1,00 5 93,363 1,17 Bảng 2: Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống sắc ký HPLC Kết quả trình bày ở bảng 2 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các
kết quả thu được là Sx = 0,338 « 2%, hệ số bất đối xứng dao động từ 1,00
đến 1,17. Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký mà chúng tôi sử dụng đảm bảo tính thích hợp cho việc phân tích định lượng artesunat.
3.2. áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng artesunatnguyên liệu nguyên liệu
Chuẩn bị 5 mẫu thử và 5 mẫu chuẩn artesunat có chứa 4 mg/ml artesunat trong methanol như sau:
* Dung dịch thử : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat nguyên liệu hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lọc qua
màng lọc 0,45 n m.
* Dung dịch chuẩn : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 /Ầ m.
Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong khoảng 30 phút. Tiêm 20 ^il mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Ghi diện tích píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % của artesunat
có trong mẫu thử dựa trên chuẩn artesunat đã biết hàm lượng theo công thức sau:
x% = AsXt Hu x p
A u x m s
As, Au : là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn(mAU). Ms, niu : là lượng cân của mẫu chuẩn và mẫu thử (mg).
P: là hàm lượng % ghi trên nhãn của artesunat chuẩn. Kết quả định lượng được trình bày trong bảng sau:
STT Mẫu thử Mẫu chuẩn Hàmlượng
artesunat (%) Lượng cân (gam) Diện tích píc (mAU) Lượng cân (gam) Diện tích píc (mAU) 1 0,1012 91,022 0,1032 93,052 98,355 2 0,1052 93,857 0,1047 93,584 98,417 3 0,1028 91,973 0,1038 93,204 98,434 4 0,1034 92,257 0,1050 93,835 98,442 5 0,1041 93,514 0,1029 92,834 98,177 Số liệu thống kê 98,365% ; s = 0,1105; Sx= 0,0494; Ax = taSx = 0,137 ;
độ lệch chuẩn tương đối Sx = 0,1123%
Khoảng tin cậy = 98,365 ±0,137 Bảng 3: Kết quả định lượng artesunat nguyên liệu
Kết quả trình bày ở bảng 3 cho thấy nguyên liệu artesunat đem định lượng có hàm lượng là 98,365 ±0,137 %.
3.3. Đánh giá phương pháp
Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng artesunat bằng HPLC mới xây dựng với các chỉ tiêu sau.
3.3.1 Đánh giá tính chính xác của phương pháp
Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 3.2. Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song.
Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy, trong các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả rất nhỏ(Sx= 0,1123% « 2%). Như vậy phương pháp là chính xác.
3.3.2. Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích píc của artesunat trên chất chuẩn artesunat. Pha một dãy dung dịch chuẩn của artesunat có nồng độ biến thiên từ: 3,2 - 4,8 mg/ml.
Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,08g; 0,09g; 0,lg; 0,1 lg; 0,12g artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch, ta
' thu được 5 dung dịch có nồng độ từ 3,2 - 4,8 mg/ml. Tiêm lần lượt 20ul mỗi
dung dịch vào hệ thống sắc ký đã chạy ổn định với pha động trong khoảng 30 phút. Ghi các giá trị diện tích píc đo được ứng với các nồng độ của artesunat.
Kết quả được được trình bày ở bảng 4, và đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến
tính giữa diện tich píc và nồng độ artesunat được ghi ở hình 5.
STT Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (mAU)
1 3,2 73,976
2 3,6 84,72
3 4,0 93,517
4 4,4 102,112
5 4,8 110,983
Bảng 4: Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của artesunat
c
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch
Hình 5: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ artesunat
Nhận xét: Kết quả thu được ở bảng 4 và hình 5 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích píc thu được trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng và được biểu diễn bằng phương trinh hồi quy.
y = 22,91x + 1,36 với hệ số tương quan tương ứng r = 0,9990 Độ lệch chuẩn của y - intercept: SB = 0,516 Khoảng tin cậy của y - intercept: AB = 1,64
- 0,28 <; B <; 3,00
Từ các kết quả trên ta thấy, hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99. Khoảng tin cậy của y - intercept chứa 0.
Tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy.
3.3.3 Đánh giá tính đúng của phương pháp
Pha dung dịch chuẩn : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch.
Pha dung dịch thử: Pha 5 dung dịch thử, trong bình định mức 25 ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch.
Tiêm lần lượt 20ịẩ1 mỗi dung dịch vào hệ thống sắc ký đã chạy ổn định
với pha động trong khoảng 30 phút và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và các mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % của artesunat có trong mẫu thử dựa trên chuẩn artesunat đã biết hàm lượng theo công thức ở mục 3.2. Từ đó tính hàm lượng và % tìm lại của mẫu thử. Kết quả được trình bày ở bảng sau.
STT Khối lượng artesunat cho vào (gam) Lượng hoạt chất có thực (gam) Diện tích pic (mAU) Khối lượng tìm lại (gam) Phần trăm Tìm lại (%) 1 0,1017 0,1002 92,588 0,1003 100,09 2 0,1019 0,1005 92,766 0,1005 99,99