• Pha động là dung môi để rửa giải chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột sắc ký. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi. Dựa vào đặc điểm chất phân tích chọn hệ dung môi sao cho khả năng tách chiết là tốt nhất. Pha động quyết định thời gian lưu của chất tan và hiệu quả tách sắc ký.
• Pha động phải thoả mãn các điều kiện sau:
* + Phải trơ với pha tĩnh
+ Phải hoà tan được chất mẫu + Phải bền vững theo thời gian
+ Phải có độ tinh khiết cao
+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký + Phải phù hợp với loại detector
+ Phải kinh tế
• Có bốn yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của một hỗn hợp mẫu:
+ Bản chất của dung môi để pha pha động + Thành phần của các chất tạo ra pha động + Tốc độ của pha động
+ pH của pha động
1.6.6. Nguyên tắc lựa cách chọn pha tĩnh và pha động
Cách chọn pha tĩnh và pha động thích hợp để tách được hỗn hợp chất cần phân tích là rất quan trọng. Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêu trên người ta chọn hệ pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:
+ Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, không phân cực hay ít phân cực. Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60.
+ Sắc ký pha đảo : Pha động là hệ dung môi phân cực, các dung môi tan được trong nước, điển hình là methanol, acetonitril. Nói chung dung môi cho hệ pha đảo là nước cất, alcol...Ngoài các dung môi chính còn có các dung dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệm phosphate) để ổn định cho quá trình sắc ký. Sắc ký pha đảo thường dùng để tách các chất phân cực. Có nhiều cột để lựa chọn, loại thường sử dụng là cột alkyl hoá Cg, C|8 với các tên thương phẩm khác nhau.
Tuỳ theo điều kiện cơ sở và phương pháp tiến hành thí nghiệm mà người ta chọn loại cột thích hợp. ví dụ:
+ Khi chọn cột C18 người ta dùng hệ pha động là acetonitril: đệm phosphate hoặc methanol: hệ đệm phosphate hoặc nước: methanol: acid acetic băng theo các tỷ lệ nghiên cứu phù hợp với chất phân tích.
Việc chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính chất quyết định, cần chọn lựa, thay đổi sao cho phù hợp để việc phân tách đạt kết quả cao nhất. Mặt khác cũng phải lưu ý đến chi phí khi lựa chọn pha tĩnh và pha động.
* Detector
Khi hệ pha động rửa giải các chất ra khỏi cột chúng được ghi nhận bởi Detector và chuyển thành túi hiệu được ghi trên sắc ký đồ. Có nhiều loại Detector như
+ Detector huỳnh quang và Detector điện hoá có độ nhạy và độ chọn lọc cao, chủ yếu được dùng trong phân tích vết và phân tích dịch sinh học.
+ Detector tử ngoại (Đèn Deuterium) và khả kiến (Đèn Voníram) có thể làm việc ở bước sóng tuỳ chọn theo tính chất hấp thụ của chất cần phân tích. Loại này hiện nay được dùng rất phổ biến.
Tuỳ theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau. Khi các thành phần nằm trong dạng phối hợp, muốn định lượng
* đồng thời người ta phải chọn đặt bước sóng phù hợp với hỗn hợp cần phân tích
(bằng cách quét phổ hấp thụ của dung dịch các chất đem chạy sắc ký được pha trong dung môi pha động tương ứng, có ưu tiên cho chất có độ hấp thụ riêng nhỏ hơn hoặc chất có nồng độ nhỏ nhất).
1.6.7. Phương pháp định lượng, cách đánh giá pic và tính kết quảtrong HPLC trong HPLC
> Cách đánh giá diện tích pic
* Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic người ta có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.
* Đánh giá chiều cao của pic: Điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao của pic là các chỉ số k ’ hằng định. Đo chiều cao pic chỉ thích hợp
J khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:
• Phương pháp ngoại chuẩn.
Dựa trên việc so sánh mẫu thử và mẫu chuẩn được phân tích trong cùng một điều kiện. Kết quả của chất chưa biết được tính toán dựa trên chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phương pháp nội chuẩn.
Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
• Phương pháp thêm.
Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ. Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn. Các pic thu
■* được của dung dịch chuẩn và thử được đo trong cùng một điều kiện sắc ký.
Phương pháp này có thể thực hiện nhiều lần. Trường hợp đơn giản nhất với một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích pic. Với phương pháp thêm nhiều lần với nồng độ khác nhau ta có phương pháp thêm đường chuẩn.
• Phương pháp phần trăm diện tich pic (hoặc phần thăm chiều cao pic). Là phương pháp tính nồng độ của mẫu thử dựa trên diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng toàn bộ pic có trong sắc ký đồ. Trong phương pháp HPLC, công thức này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của Detector trên các chất là như nhau nếu không như nhau, khi mỗi chất cần phải có hệ số điều chỉnh.
PHẨN II
ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ -
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Đôi tượng nghiên cứu
+ Nguyên liệu artesunat.
+ Nguyên liệu dihydro artemisinin. + Nguyên liệu acid succinic.
2.2. Phương tiện, dụng cụ hoá chất
> Dụng cụ máy móc.
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - Detector u v diode aưay. + Máy quang phổ u v - VIS Lambda EZ 210.
r + Máy lắc siêu âm - SONOREX.
+ Máy đo pH Meter 3305 - Jenway. + Máy lọc chân không - Satorius.
+ Cân phân tích Mettler AB 204 độ chính xác 0,lmg. + Bình định mức 25, 50, 100, 1000 ml.
+ Cốc đong 50, 100, 500, 1000 ml.
+ Pipet các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45 Ịjm.
+ Tủ sấy và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. > Hoá chất.
+ Artesunat: Dạng nguyên liệu do Bộ Môn Công Nghiệp Dược Trường Đại Học Dược Hà Nội sản xuất.
+ Artesunat: Đối chiếu hoá học hàm lượng 98,6% (SKS 019261) của
+ Dihydro artemisinin: Dạng nguyên liệu do bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại Học Dược Hà nội sản xuất.
+ Acid succinic: Dạng nghuyên liệu do Trung Quốc sản xuất. + Muối KH2P 0 4 dùng cho PA.
+ Methanol: Dùng cho HPLC (Merk/Prolabor). + Acetonitril: Dùng cho HPLC (Merk/Prolabor). + Acid Phosphoric đặc dùng cho PA.
+ Nước cất 2 lần dùng cho HPLC và một vài hoá chất khác.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượngartesunat bằng phương pháp HPLC artesunat bằng phương pháp HPLC
+ Tham khảo các phương pháp định lượng artesunat đã công bố.
+ Tham khảo các phương pháp định lượng artesunat dang áp dụng ở Việt Nam.
+ Tham khảo tính đặc hiệu của các phương pháp hiện đang sử dụng để định lượng artesunat ở nước ta và một số phương pháp khác.
+ Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hoá học của artesunat cũng
như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu xây dựng quy
trình kỹ thuật định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC.
+ Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp đó.
> Khảo sát điều kiện sắc ký: Chọn cột, pha động, bước sóng xác định và tốc độ dòng thích hợp để tách tốt 3 chất: Artesunat, DHA, acid succinic. > Xây dựng phương pháp định lượng, đánh giá tính thích hợp của hệ thống
2.3.2. Đánh giá phương pháp vừa xảy dựng vê các mặt: tính chính xác, tính tuyến tính, tinh đúng và đặc biệt chú trọng tới tính đặc hiệu của phương pháp
+ Đánh giá tính chính xác của phương pháp.
+ Đánh giá tính tuyến tính giữa nồng độ artesunat với diện tích pic trên sắc ký đồ.
+ Đánh giá độ đúng của phương pháp.
+ Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp. Đây là chỉ tiêu rất quan trọng vì DHA và acid succinic là nguyên liệu trong quá trình tổng hợp và cũng là sản phẩm phân huỷ trong quá trình bảo quản artesunat, sự có mặt của hai chất này luôn ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Vì vậy rất cần thiết phải đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp.
2.3.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả
* Giá trị trung bình: X = ~ ^ xi
J7x,. - x f
* Độ lệch chuẩn: s = ]Ị—---
V n- 1
* Độ lệch chuẩn tương đối: Sx= ^ x io o
X
* Sai số chuẩn: S x =
PHẦN III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC
3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký
Chọn phương pháp sắc ký: Artesunat là hợp chất hữu cơ phân cực. Vì vậy để phân tích và định lượng tốt, chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột sắc ký thông dụng là Nucleosil C8, C18; Lichrosorb RP8, RP18; Supelcosil LC8, LC18.... Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng cột
Nucleosil C18 (250 X 4 mm; 5 ụ,m).
Chọn pha động: Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là acetonitil, methanol, nước, hay hỗn hợp của acetonitril (methanol) với nước. Do artesunat dễ tan trong acetonitril và methanol, để kéo dài thời gian lưu thích hợp của chất phân tích pha động phải cần nước; để khống chế mức độ ion hoá của artesunat cần sử dụng đệm pH acid.
Chọn bước sóng: Để tách và định lượng được artesunat sau khi rửa giải, dựa vào cấu trúc phân tử của artesunat là có oxy và nhóm carbonyl nên sẽ hấp
thụ u v ở bước sóng ngắn. Vì vậy, chúng tôi dự kiến dùng Detector u v bước
sóng ngắn trong nghiên cứu này.
3.1.2. Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký
Lựa chọn bước sóng thích hợp: Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện artesunat, chúng tôi tiến hành quét phổ u v trên máy quang phổ UV-VIS Lambda EZ210, kết quả được trình bày ở hình 4.
Phổ hấp thụ của artesunat cho thấy cực đại hấp thụ là 215,6nm. Vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 216nm.
Report Date: 16:23:01, 0 5 /2 6 /2 0 0 4 A rtesu n at/M eO H Abs Sam ple: Run Date: Operator: Com m ent: In strum ent Model: Serial N um ber: ROM Version: A rte s u n a t/M e O H 1 5 :0 6 :5 8 , 0 5 / 2 5 / 2 0 0 4 D etault Tung La m b d a E Z 2 1 0 sp ectro p h o to m eter 2 5 5 0 0 2
In strum ent P aram e ters M easu rem en t Type: D ata Mode:
sta rtin g VVavelength: Ending VVavelength: Scan Speed: Sam plinR Interval: Slit VVidth: Lam p Change: Baséline Correction: Response: Path LenRth: Processing P ertorm ed Savitsky-Golav S m oothed Sm oothing Order: N um ber of Points: N um ber of Tim es: Savitsky-Golay S m o oth ed
Sm oothing Order: N um ber of Points: N um ber of Tim es:
Peak InteRration WavelenRth Scan Abs _ 3 5 0 .0 nm 1 9 0 .0 nm 8 0 0 n m /m in 0 .2 nm 2 n m 3 4 0 .0 nm User M ediu m 10.0 mm 3 6 0 1
Hình 4: Phổ hấp thụ tử ngoại của artesunat.
Lựa chọn pha động: Trong quá trình làm thực nghiệm chúng tôi đã phối hợp các dung môi methanol, acetonitril, đệm pH acid với các thành phần và tỷ
lệ khác nhau, cuối cùng pha động cho kết quả phân tách tốt được lựa chọn như sau:
Đệm pH 3,5 : acetonitril: Methanol tỷ lệ 50:10:40.
Đệm pH 3,5: Hoà tan l,36g KH2P 0 4 trong nước và thêm nước vừa đủ đến vạch 1000 ml, điều chỉnh về pH 3,5 bằng H3P04 đặc, sau đó lọc và siêu âm đuổi khí.
Methanol, acetonitril được siêu âm đuổi khí trước khi sử dụng.
Lựa chọn tốc độ dòng: Qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 0,8 ml/phút cho kết quả tách tốt nhất, thời gian lưu phù hợp cho phân tích.
Tóm lại; từ các kết quả khảo sát trên chúng tôi đã xây dựng một chương trình sắc ký để định lượng artesunat như sau.
Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 X 4 m; 5 ụ m).
Detector u v diode aưay X = 216 nm.
Pha động. Đệm pH 3,5 : acetonitril: methanol (50 : 10 : 40). Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 ụ 1.
Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng.
3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thông
Để tiến hành sắc ký định lượng, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống.
Pha dung dịch artesunat chuẩn: Trong bình định mức 25 ml cân chính xác khoảng 0,1 g artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch,
lọc qua màng lọc 0,45 n 1. (nồng độ 4mg/ml).
Tiêm 20 ụ 1 dung dịch trên vào hệ thống sắc ký và tiến hành trong điều
kiện đã chọn (lặp lại 5 lần như vậy). Ghi diện tích pic và hệ số bất đối xứng thu được trên sắc ký đồ. Kết quả thử tính thích hợp của hệ thông sắc ký được trình bày dưới bảng sau:
STT Diện tích pic (mAƯ)
Số liệu thống kê Hệ số bất đối
xứng 1 93,052 93,383 1,10 2 93,838 s = 0,3152 1,08 3 93,524 Sx= 0,338 1,12 4 93,137 1,00 5 93,363 1,17 Bảng 2: Kết quả thử tính thích hợp của hệ thống sắc ký HPLC Kết quả trình bày ở bảng 2 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các
kết quả thu được là Sx = 0,338 « 2%, hệ số bất đối xứng dao động từ 1,00
đến 1,17. Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký mà chúng tôi sử dụng đảm bảo tính thích hợp cho việc phân tích định lượng artesunat.
3.2. áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng artesunatnguyên liệu nguyên liệu
Chuẩn bị 5 mẫu thử và 5 mẫu chuẩn artesunat có chứa 4 mg/ml artesunat trong methanol như sau:
* Dung dịch thử : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat nguyên liệu hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lọc qua
màng lọc 0,45 n m.
* Dung dịch chuẩn : Trong bình định mức 25ml cân chính xác khoảng 0,lg artesunat chuẩn hoà tan và thêm methanol vừa đủ đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 /Ầ m.
Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong khoảng 30 phút. Tiêm 20 ^il mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Ghi diện tích píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % của artesunat
có trong mẫu thử dựa trên chuẩn artesunat đã biết hàm lượng theo công thức sau:
x% = AsXt Hu x p
A u x m s
As, Au : là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn(mAU). Ms, niu : là lượng cân của mẫu chuẩn và mẫu thử (mg).
P: là hàm lượng % ghi trên nhãn của artesunat chuẩn. Kết quả định lượng được trình bày trong bảng sau:
STT Mẫu thử Mẫu chuẩn Hàmlượng
artesunat (%) Lượng cân (gam) Diện tích píc (mAU) Lượng cân (gam) Diện tích píc (mAU) 1 0,1012 91,022 0,1032 93,052 98,355 2 0,1052 93,857 0,1047 93,584 98,417 3 0,1028 91,973 0,1038 93,204 98,434 4 0,1034 92,257 0,1050 93,835 98,442 5 0,1041 93,514 0,1029 92,834 98,177 Số liệu thống kê 98,365% ; s = 0,1105; Sx= 0,0494; Ax = taSx = 0,137 ;
độ lệch chuẩn tương đối Sx = 0,1123%
Khoảng tin cậy = 98,365 ±0,137 Bảng 3: Kết quả định lượng artesunat nguyên liệu
Kết quả trình bày ở bảng 3 cho thấy nguyên liệu artesunat đem định lượng có hàm lượng là 98,365 ±0,137 %.
3.3. Đánh giá phương pháp
Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng artesunat bằng HPLC mới xây dựng với các chỉ tiêu sau.