ADN tổng số của mẫu bùn tự nhiên, dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt và các chủng đơn đƣợc tách chiết theo một trong hai phƣơng pháp:
Phương pháp1: Mẫu trƣớc khi đem tách chiết ADN đƣợc ly tâm (6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng) thu cặn tế bào và hòa tan lại bằng 1ml nƣớc MQ. Trộn 1ml mẫu với 2ml đệm tách ADN (gồm: 100mM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
NaH2PO4); 1,5M NaCl; 1% CTAB) vào ống falcon. Bổ sung 20µl proteinase K (10mg/ml), lắc ngang nhẹ tốc độ 225 vòng/phút, 37o
C trong 30 phút. Thêm 300µl SDS (20%) ủ ở 65oC trong 2 giờ, đảo ngƣợc ống sau mỗi 25 phút. Bổ sung thêm 3,5ml Phenol:Cloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), lắc đều và ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Cloroform:isoamyl alcohol rồi mix đều. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm thu tủa ADN ở 14000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong 30 phút, gạn bỏ phần dịc nổi thu cặn. Tiếp tục rửa lại phần cặn ADN 2 lần bằng ethanol 80%, ly tâm ở 14000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong 15 phút. Gạn bỏ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng, hòa tan ADN trong 50µl nƣớc MQ khử trùng và bảo quản ở -20o
C.
Phương pháp 2:
Hút 1ml nƣớc MQ đã khử trùng vào ống eppendorf. Dùng tăm bông vô trùng lấy khuẩn lạc đã nuôi cấy trên đĩa môi trƣờng winograsky sau 48h, hòa tan tế bào vào ống eppendoft đã chuẩn bị, mix đều bằng máy vortex rồi đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút (rửa mẫu). Hút bỏ phần dịch. Bổ sung 500µl nƣớc MQ vô trùng vào mẫu hòa tan lại phần cặn. Bổ sung 500 µl hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) vào ống, mix kỹ bằng vortex hoặc bằng tay trong khoảng 20 giây. Ly tâm ở 14000v/p nhiệt độ phòng trong 10 phút. Dùng pipet nhẹ nhàng hút pha dịch nổi trên cùng và chuyển sang 1 ống eppendorf mới (200 µl vào mỗi ống). Bổ sung theo thứ tự: 1µl Glycogen, 100µl ammonium acetate 7,5M và 750µl Ethanol 100%.Ủ trong tủ lạnh nhiệt độ -20oC qua đêm. Ly tâm ở 14000v/p, 4o
C trong 30 phút để tủa ADN. Gạn bỏ phần dịch, bổ sung 150µl ethanol 80%, mix nhẹ bằng pipet. Sau đó đem ly tâm ở 14000vòng/phút, 4oC trong 10 phút để rửa ADN. Lặp lại bƣớc này 2 lần. Nhẹ nhàng gạn bỏ phần dịch, để khô. Bổ sung 50µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nƣớc PCR (nƣớc MQ) để hòa tan ADN.
Sản phẩm tách ADN đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% có bổ sung trực tiếp thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene), chạy trong đệm TAE 1x, hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Sau đó quan sát và chụp ảnh trên máy soi gel UVP (UK).
2.4.6Phƣơng pháp điện di gel biến tính (DGGE)
Khuếch đại gen 16S rARN: Các mẫu bùn tự nhiên, dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt và dịch anode của các MFC trong quá trình hoạt động đƣợc tách ADN tổng số bằng một trong hai phƣơng pháp (Mục 2.4.5), sau khi táchADN tổng số, gen 16S rARN đƣợc khuếchđại bằngphản ứng PCRvới cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′,mồi xuôi) và p1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’,mồi ngƣợc)[62]đƣợc cung cấp bởi Integrated ADN Technologies - IDT (Singapore). Độ đặc hiệu và hiệu quả của cặp mồi này đã đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm với nhiều loài vi khuẩn và mẫu môi trƣờng, cho thấy cặp mồi này rất hữu ích cho khuếch đại gen 16S rADN trong nghiên cứu về sinh thái vi sinh vật [62].
Tiếp đó, đoạn 16S rADN đã khuếch đại với kích thƣớc khoảng 1400bp tiếp tục đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi p338F (5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′, mồi xuôi) và p518R (5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′, mồi ngƣợc) đƣợc cung cấp bởi Integrated ADN Technologies - IDT. Cặp mồi này để khuếch đại đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 210bp đặc trƣng cho vi khuẩn nói chung, phù hợp cho phân tích quần xã vi sinh vật bằng DGGE [63,64] (Bảng 5):
Bảng 5: Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE Thành phần phản ứng Thể tích Chu kỳ nhiệt
Taq PCR mix 12,5 µl 1. 95oC : 5 phút
2. 95oC : 1 phút
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thành phần phản ứng Thể tích Chu kỳ nhiệt P1378R(10µM) 1,5 µl 53oC: 45 giây 72oC: 1 phút Lặp lại 30 chu kỳ. 3. 72oC: 7 phút ADN template 1,5 µl Nƣớc PCR 8 µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl Taq PCR mix 12,5 µl 4. 95o C : 5 phút 5. 95oC : 30 giây 53oC: 30 giây 72oC: 45 giây Lặp lại 30 chu kỳ. 6. 72oC: 5 phút p338F(10µM) 1,5 µl p518R(10µM) 1,5 µl ADN template 1,5 µl Nƣớc PCR 8 µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl Điện di DGGE: Bảng 6: Thành phần dung dịch chất biến tính 0% và 60%
Thành phần dung dịch Dung dịch 0% Dung dịch 60%
Acrylamide 6g 4,5 g Bis-AA 0,162 g 0,122 g 50x TAE 2,5 ml 1,9 ml Ure - 25,2 g Formamide - 24 ml Nƣớc MQ 100 ml 100 ml Bảng 7: Thành phần “Working solutions”
Stock solutions 45% denaturant 60% denaturant 0% denaturant
60% - solution 7,5 ml 10 ml 0 ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TEMED 8 µl 8 µl 5 µl
APS 10% 40 µl 40 µl 20 µl
Điện di đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với gradient biến tính Urea/formamide từ 45% đến 60% (Bảng 8). Các dung dịch biến tính đƣợc đƣa vào khuôn gel (dày khoảng 0,5mm) tạo bởi 2 tấm kính bằng hệ thống bơm tự động có khuấy từ. Phần gel có chứa chất biến tính sau khi đổ đƣợc để polimer hóa tự nhiên 1 - 2 giờ. Dung dịch 0% chất biến tính và lƣợc đƣợc dùng để tạo giếng. Bản gel đƣợc để ổn định và đông trong thời gian ít nhất 3 giờ. Sau khi gỡ bỏ lƣợc, bản gel đƣợc đặt trong đệm TAE 1X, các giếng đƣợc rửa sạch bằng đệm. 15µl mỗi mẫu đƣợc trộn với 10 µl Loading Dye 6x và tra vào mỗi giếng. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DGGEK – 2401(C.B.S Scientific - Mỹ), trong đệm TAE 1x, ở nhiệt độ 60oC, hiệu điện thế 38V, thời gian 16 giờ (overnight). Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch HydraGreen Safe ADN Stain 1xtrong 30 phút, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất trong 10 phút và quan sát bằng máy đọc gel UVP - UK.
Thôi gel: Những băng phân tách trên bản gel DGGE đƣợc cắt bằng dao cắt gel vô trùng, rửa bằng nƣớc MQ vô trùng và bổ sung 50µl nƣớc MQ, để qua đêm ở 4oC. Dịch thôi ADN đƣợc dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR cho DGGE (Bảng 5) với cặp mồi 338F và 518R. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit ExoSAP – IT (Affymetric) và giải trình tự bởi FirstBase (Singapore).
2.4.7Giải và phân tích trình tự gen 16S rARN
Gen 16S rARN của các chủng đơn (1500bp) và sản phẩm thôi gel từ các băng điện di biến tính DGGE (200bp) đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Việc giải trình tự đƣợc thực hiện bởi First Base (Singapore). Các trình tự gen sau đó đƣợc phân tích bằng phần mềm Chromas version 2.4, đối chiếu với trình tự 16S rADN của các loài có liên quan hiện đã công bố trên cơ sở dữ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
liệu trình tự của GenBank bằng công cụ BLAST Search.