Để đánh giá khả năng cảm biến phát hiện Fe(II) của MFC2 và MFC3, các thiết bị đƣợc thử nghiệm với các nồng độ Fe(II) khác nhau trong dịch anode. Kết quảcho thấy dòng điện sinh ra có quan hệ tuyến tính với nồng độ Fe(II) trong dịch anode của thiết bị MFC2 và MFC3 trong khoảng nồng độ Fe(II) từ 1- 20 mM. Tuy nhiên, với các nồng độ Fe(II) trên 20 mM, cƣờng độ dòng điện không tiếp tục tăng mà có xu hƣớng giảm dần (Hình 9).
Hình9: Quan hệ giữa cƣờng độ dòng điện với nồng độ Fe(II) trong dịch anode của MFC2 và MFC3
Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa cƣờng độ dòng điện với nồng độ Fe(II) của các MFC cho thấy thiết bị có thể đƣợc áp dụng tốt nhất để đo nồng độ Fe(II) trong khoảng nồng độ Fe(II) dƣới 20mM. Ở các nồng độ Fe(II) cao hơn 20mM, dòng điện sinh ra bởi MFC bị giảm dần có thể do ở nồng độ Fe cao sẽ gây độc cho tế bào, gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến lƣợng electron chuyển đến điện cực bị giảm đi. Tuy vậy, hiện tƣợng sự có
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 5 10 15 20 25 30 Cường độ dòng đi ện trung bình (mA)
Nồng độ Fe(II) trong dịch anode (mM)
MFC2 MFC3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
mặt của Fe(II) trong dịch anode dẫn đến sự sản sinh dòng điện của thiết bị bƣớc đầu cho thấy thiết bị có thể đƣợc sử dụng nhƣ một cảm biến sinh học phát hiện sắt – trong bất kỳ nguồn nƣớc nào ô nhiễm sắt thì sự có mặt của Fe(II) là tất yếu [70]. Các nghiên cứu xa hơn là cần thiết để tối ƣu hóa khả năng cảm biến phát hiện sắt của thiết bị.
3.3Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn trong các MFC
Từ các mẫu dịch anode của các MFC, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng Winograsky theo phƣơng pháp truyền thống (Mục 2.4.3). Kết quả thu đƣợc cho thấy có sự khác nhau về số lƣợng và đặc điểm các chủng vi khuẩn giữa các MFC. Cụ thể là ở MFC1 chúng tôi đã phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn (Ký hiệu: ĐS1, ĐS2) có 1 chủng có hình thái khuẩn lạc giống với vi khuẩn oxi hóa sắt, trong khi đó ở MFC2 phân lập đƣợc 6 chủng vi khuẩn (Ký hiệu: FC2.1; FC2.2; FC2.3; FC2.4; FC2.5; FC2.6) thì có 4 chủng có hình thái khuẩn lạc giống với vi khuẩn oxi hóa sắt, và ở MFC3 phân lập đƣợc 5 chủng(Ký hiệu: FC3.1; FC3.2; FC3.3; FC3.4; FC3.5) thì cũng có có 4 chủng có hình thái khuẩn lạc giống với vi khuẩn oxi hóa sắt. Khuẩn lạc màu nâu đỏ và có ánh dầu là đặc điểm đặc trƣng của vi khuẩn oxi hóa sắt [65]. Sau khi phân lập đƣợc các chủng riêng rẽ, để xác định hình dạng tế bào và kiểu Gram của mỗi chủng, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram và soi dƣới kính hiển vi quang học. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào (độ phóng đại 1000 x) đƣợc thể hiện ở Hình 9, Hình 10, Hình 11.
Khuẩn lạc dạng tròn, mép răng cƣa, màu nâu đỏ và có ánh dầu.
Tế bào hình que, bắt màu Gram âm, không sinh bào tử. Khuẩn lạc dạng tròn, lồi, màu trắng sữa, nhỏ li ti.
Tế bào hình que, bắt màu Gram âm, không sinh bào tử.
ĐS1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 10: Khuẩn lạc và tế bào các chủng phân lập từ MFC1.
Chú thích: Ký hiệu chủng ở góc của mỗi hình. Các hình bên trái là các ảnh chụp khuẩn lạc. Các ảnh bên phải là các ảnh chụp tế bào (độ phóng đại 1000x).
Khuẩn lạc dạng tròn, bóng, màu vàng nhạt.
Tế bào hình cầu, đứng riêng rẽ, bắt màu Gram âm.
Khuẩn lạc dạng tròn, mép nhẵn, bóng nƣớc bao phủ khuẩn lạc, màu nâu đỏ. Tế bào dạng cầu khuẩn, đứng riêng rẽ, bắt màu Gram âm. Khuẩn lạc dạng tròn, lồi, màu trắng sữa. Tế bào hình rùi trống, kích thƣớc lớn, bắt màu Gram âm. Khuẩn lạc dạng tròn, mép răng cƣa, bề mặt xù xì, màu nâu đỏ và có ánh dầu. Tế bào hình cầu, bắt màu Gram âm, không sinh bào tử. Khuẩn lạc dạng tròn, nhỏ li ti, màu trắng. Tế bào hình que, kích thƣớc lớn, bắt màu Gram dƣơng. Khuẩn lạc dạng tròn, mép nhẵn, có bóng nƣớc bao phủ, màu hồng đậm. Tế bào hình que, bắt màu Gram âm, sinh bào tử.
FC2.1 FC2.2 FC2.3 FC2.4 FC2.5 FC2.6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 11: Khuẩn lạc và tế bào các chủng phân lập từ MFC2. Chú thích: Ký hiệu chủng ở góc của mỗi hình. Các hình bên trái là các ảnh chụp khuẩn lạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Khuẩn lạc dạng tròn, dẹp, mép nhẵn, màu nâu, bề mặt khô. Tế bào hình cầu, đứng riêng rẽ, bắt màu Gram âm.
Khuẩn lạc dạng tròn, mép nhẵn, bóng nƣớc bao phủ khuẩn lạc, màu nâu.
Tế bào hình cầu, xếp chuỗi, bắt màu Gram dƣơng, sinh bào tử. Khuẩn lạc dạng tròn, mép nhẵn, bóng nƣớc bao phủ khuẩn lạc, màu hồng.
Tế bào hình que, thƣờng xếp chuỗi, bắt màu Gram âm, sinh bào tử.
Khuẩn lạc dạng tròn, mép loang rộng ra xung quanh, màu nâu, có ánh dầu.
Tế bào hình que, nhỏ, bắt màu Gram âm, sinh bào tử. Khuẩn lạc dạng tròn, mép nhẵn, màu trắng, nhỏ. Tế bào hình cầu, xếp chuỗi, bắt màu Gram dƣơng.
Hình 12: Khuẩn lạc và tế bào các chủng phân lập từ MFC3.
Chú thích: Ký hiệu chủng ở góc của mỗi hình. Các hình bên trái là các ảnh chụp khuẩn lạc. Các ảnh bên phải là các ảnh chụp tế bào
(độ phóng đại 1000x). FC3.1 FC3.2 FC3.3 FC3.4 FC3.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐS2: Bacillus subtilis (99%) FC2.1: Acinetobacter calcoaceticus (99%) FC2.3: Bacillus amyloliquefaciens (100%) FC2.5: Pseudomonas teessidea (99%) FC2.6: Bacillus sp. (100%) FC3.1: Pseudomonas stutzeri (100%) FC3.2: Bacillus aryabhattai (100%) FC3.4: Aeromonas caviae (100%) FC3.5: Bacillusbarbaricus (98%)
Hình 13: Thống kê tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ anode củamỗi MFC trong nghiên cứu.
Tỷ lệ % trên biểu đồ tròn là tỷ lệ số khuẩn lạc của chủng tƣơng ứng so với tổng số khuẩn lạc của tất cả các chủng phân lập đƣợc, xác định qua phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Các chủng ĐS2, FC2.1, FC2.3, FC2.5, FC2.6, FC3.1, FC3.2, FC3.4, FC3.5 đƣợc phân tích trình tự 16S rADN. Kết quả phân tích (bằng công cụ BLAST search) cho thấy mỗi chủng có trình tự 16S rADN tƣơng đồng với trình tự 16SrADN của loài tƣơng ứng đƣợc trình bày (với tỷ lệ % tƣơng đồng trong ngoặc).
Kết quả phân tích quần xã vi sinh vật anode bằng phƣơng pháp phân lập vi sinh truyền thống và thống kê khuẩn lạc (Hình 13) cho thấy số lƣợng vi
ĐS1 62% ĐS2 38% MFC1 FC2.1 1% FC2.2 16% FC2.3 7% FC2.4 10% FC2.5 58% FC2.6 8% MFC2 FC3.1 35% FC3.2 17% FC3.3 22% FC3.4 5% FC3.521% MFC3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
khuẩn phân lập đƣợc trong mỗi MFC không nhiều. Hiện tƣợng này có thể là do môi trƣờng anode cho hoạt động của MFC là môi trƣờng vô cơ, chính vì vậy mà chỉ những chủng vi khuẩn có khả năng tự dƣỡng hóa năng vô cơ hoặc có mối quan hệ về dinh dƣỡng trao đổi chất với chủng có khả năng đó thì mới tồn tại đƣợc. Hơn nữa, môi trƣờng Winograsky là môi trƣờng có thiên hƣớng chọn lọc những chủng vi khuẩn có khả năng oxi hóa sắt.
Với MFC1, không có nguồn vi sinh vật ban đầu, thì lƣợng vi khuẩn phân lập đƣợc rất ít (2 chủng), ngƣợc lại với 2 MFC còn lại, đƣợc bổ sung nguồn vi sinh vật ban đầu, thì số lƣợng chủng thu đƣợc nhiều hơn (5-6 chủng). Một điều thú vị ở đây là kết quả phân lập này có sự tƣơng đồng nhất định với kết quả sản sinh dòng điện ở các MFC, đó là MFC1 với dòng điện trung bình là 0,2mA trong khi đó MFC2, MFC3 là 0,5mA và 0,6mA.
Một điểm chung của các MFC này là chủng chiếm đa số trong quần xã vi sinh vật anode đều thuộc chi Pseudomonas sp. Những kết quả nghiên cứu trƣớc đây về hệ vi sinh vật điện hóa trong khoang anode MFC đều cho thấy sự có mặt của Pseudomonas sp.[44]. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, với mục đích làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt cho anode của thiết bị MFC mà vẫn thấy sự có mặt của Pseudomonas sp., điều này cho thấy Pseudomonas sp. có vai trò quan trọng trong quần xã vi khuẩn oxi hóa sắt và sản sinh dòng điện ở anode. Năm 2009, Sudek và cộng sự đã báo cáo rằng Pseudomonas có thể xúc tác cho quá trình oxi hóa sắt II trong điều kiện vi hiếu khí [47]. Trong khi đó, nhóm nghiên cứu ở Đại học Ghent (Bỉ) cũng đã phát hiện ra một số vi khuẩn trong khoang anode của MFC, trong đó có Pseudomonassp., có khả năng tự sản sinh các chất truyền điện tử trung gian để thực hiện phản ứng truyền điện tử tới điện cực [45].
3.4Nghiên cứu động thái quần xã vi khuẩn trong các MFC bằng phƣơng pháp DGGE
Khuếch đại gen 16S rARN: Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN có kích thƣớc 1500bp (Hình 14) và đoạn ADN có kích thƣớc 250bp (Hình 15) sử dụng cho điện di DGGE cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 14: Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN với cặp mồi p61F & p1378R từ
sản phẩm tách ADN tổng số.
N2, N3, N4, N5 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu của MFC1 sau lần lƣợt 7, 14, 21, 28 ngày; (-) là đối chứng âm. (Các mẫu phân tích còn lại đều cho kết quả tƣơng tự).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 15: Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16SrADN dùng cho phân tích DGGE bằng cặp mồi (p338F & p518R).
N6 là mẫu bùn tự nhiên; N7, N8, N9 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu MFC2 sau 7, 14, 21 ngày. (Các mẫu phân tích còn lại đều cho kết quả tƣơng tự).
Sản phẩm PCR đoạn ADN kích thƣớc 250bp (có GC-clamp) sau đó đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp PCR - DGGE.
Kết quả điện di DGGE (Hình 16) cho thấy sự thay đổi trong quần xã vi khuẩn của mỗi MFC và sự khác nhau giữa MFC1 và MFC2.
MFC1 MFC2
Hình 16: So sánh kết quả điện di DGGE phân tích quần xã anode của MFC1 và MFC2.
N2, N3, N4, N5 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu của MFC1 sau lần lƣợt 7, 14, 21, 28 ngày; N6 là mẫu bùn tự nhiên; N7, N8, N9 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu MFC2 sau 7, 14, 21 ngày, (-) là đối chứng âm.
Ở MFC1, sau 1 tuần hoạt động đã xuất hiện khá nhiều băng so với ở
Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.
Bacillus sp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
MFC2 tức là đã có sự có mặt của vi khuẩn, sang tuần thứ 2 và 3 thì các băng này có đậm hơn, tuy nhiên sang tuần thứ 4, khi đạt trạng thái ổn định thì chỉ còn 3 băng chính, và độ sáng các băng tƣơng đối nhƣ nhau chứng tỏ các chủng vi khuẩn trong dịch anode MFC1 chiếm tỷ lệ tƣơng đối bằng nhau. Ở MFC2, sau tuần đầu tiên làm giàu thấy xuất hiện rất nhiều băng nhƣng các băng đều khá mờ, sang tuần thứ 2 mặc dù các băng quan sát đƣợc trên bản gel ít hơn nhƣng các băng này có sự đậm nhạt rõ ràng.Ba băng chính thể hiện rõ nhất trên bản gel đƣợc cắt và trình tự của chúng đƣợc xác định tƣơng ứng với trình tự đoạn 16S rADN tƣơng ứng của các vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas
sp., Geobacter sp. và Bacillus sp (Hình 16). Trong số đó, Geobacter sp. đƣợc biết đến nhiều nhƣ là một vi khuẩn kỵ khí có tính hoạt điện cao, và khả năng truyền điện tử trực tiếp cho điện cực [69].
Các băng đậm tƣơng ứng với các chủng chiếm ƣu thế trong quần xã, các băng mờ còn lại là của những chủng chiếm thiểu số. Nhƣ vậy, có thể thấy ở bản gel phân tích MFC2 có nhiều băng mờ hoặc ít băng hơn so với bản gel phân tích MFC1. Điều này không có nghĩa là số loài vi khuẩn ở dịch anode MFC2 ít hơn anode MFC1. Heuer và cộng sự đã làm thí nghiệm DGGE tƣơng tự với xạ khuẩn, kết quả của ông cho thấy rằng những loài chiếm ƣu thế đã “lấn át” sự biểu hiện của các loài chiếm số ít, bởi vậy trong kết quả DGGE, không phải tất cả các loài có mặt trong mẫu phân tích đều đƣợc thể hiện trên bản gel [68].
Với MFC3 (Hình 17), ngay ở tuần đầu tiên của quá trình làm giàu, quần xã vi sinh vật đã có sự khác biệt hoàn toàn với quần xã nguồn ban đầu, quần xã mới xuất hiện chỉ có 2 băng chính tƣơng đƣơng với 2 chủng chiếm đa số. Sự thay đổi hoàn toàn này có thể do dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt có pH thấp (khoảng pH3), và các chủng vi khuẩn đã đƣợc làm giàu thích hợp với pH thấp, khi bổ sung vào anode của MFC hoạt động trong pH trung tính (pH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
6,5 - 7) thì các chủng này không còn hoạt động. Sau 2 tuần, 3 tuần làm giàu, quần xã này không thay đổi về thành phần mà chỉ tăng lên về số lƣợng tế bào thể hiện ở các băng càng rõ hơn ở tuần thứ 2 và tuần thứ 3. Các chủng chiếm tỷ lệ ít đƣợc thể hiện rất mờ trên bản gel hoặc không đƣợc thể hiện.
MFC1 MFC3
Hình 17: So sánh kết quả điện di DGGE phân tích quần xã anode của MFC1 và MFC3.
N2, N3, N4, N5 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu của MFC1 sau lần lƣợt 7, 14, 21, 28 ngày; N11 dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt; N12, N15, N16 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu MFC3 sau 7, 14, 21 ngày.
Để giải thích cho vấn đề những loài chiếm số ít không đƣợc thể hiện, những thí nghiệm của Muyzer và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng sự có mặt của một vài loài chi phối (loài chiếm đa số) dẫn đến một mô hình DGGE đơn giản và những chủng chiếm tỉ lệ ít hơn 1% trong quần xã sẽ không đƣợc xuất hiện trong mô hình quần xã đó [68].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
MFC2 MFC3
Hình 18: So sánh kết quả điện di DGGE phân tích quần xã anode của MFC2 và MFC3.
N6 là mẫu bùn tự nhiên; N7, N8, N9 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu MFC2 sau 7, 14, 21 ngày; N11 dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt; N12, N15, N16 là các mẫu dịch anode trong quá trình làm giàu MFC3 sau 7, 14, 21 ngày.
Quần xã vi khuẩn anode khi đạt trạng thái ổn định của MFC2 đa dạng hơn MFC3 về số lƣợng loài và có 3 loài chiếm ƣu thế thuộc các chi
Pseudomonas sp., Geobacter sp. và Bacillus sp., trong khi ở MFC3 chỉ có 2 loài thể hiện ƣu thế trong quần xã và đều là các loài thuộc chi Pseudomonas
sp.Sự khác biệt về thành phần, cấu trúc quần xã vi sinh vật có lẽ cũng là một trong những nguyên nhân giải thích cho việc dòng điệndo MFC2 sinh ra cao hơn so với dòng điện của MFC3. Từ kết quả này, cũng có thể nhận định rằng, thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật làm giàu từ nguồn vi sinh vật tự nhiên cho kết quả sản sinh dòng điện cao hơn so với làm giàu từ nguồn vi khuẩn oxi hóa sắt đã chọn lọc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/