Kết quả phân tích vi khuẩn ôxi hóa sắt bằng kỹ thuật FISH (Hình 19A1, 19A2) kết hợp với kết quả tính toán số điểm ảnh bằng phần mềm Image J cho thấy trong mẫu nguồn làm giàu là bùn tự nhiên, mật độ tế bào của vi khuẩn oxi hóa sắtkhá thƣa thớt, chiếm tỷ lệ 25% so với vi sinh vật tổng số. Trong khi đó, ở mẫu dịch anode của MFC4 (đƣợc làm giàu hệ vi khuẩn ôxi hóa sắt theo quy trình tƣơng tự MFC2) (Hình 19B1, 19B2), mật độ tế bào vi khuẩn oxi hóa sắt cao hơn, chiếm tỷ lệ 36,5% trong tổng số vi sinh vật có mặt trong dịch anode. Điều này cho thấy rằng, sau quá trình làm giàu, lƣợng vi khuẩn oxi hóa sắt đã tăng lên đáng kể.Ngƣợc lại, ở mẫu bề mặt điện cực (Hình 19C1, 19C2), lƣợng tế bào vi khuẩn tổng số cũng nhƣ vi khuẩn oxi hóa sắt ít hơn rất nhiều so với mẫu dịch anode.
Các kết quả trêngợi ý rằng vi khuẩn oxi hóa sắt chủ yếu có mặt và chiếm ƣu thế trong phần dịch anode chứ không phải trên bề mặt điện cực anode của thiết bị thử nghiệm (MFC4).
Mẫu bùn tự nhiên Mẫu dịch anode MFC4 Mẫu bề mặt điện cực MFC4 Hình 19: Kết quả phân tích vi khuẩn oxi hóa sắt trong thiết bị bằng kỹ thuật FISH. A1, B1, C1 là các ảnh hiển vi tổng hợp tín hiệu huỳnh quang từ DAPI, phản ánh sự có mặt của toàn bộ vi sinh vật trong mẫu. A2, B2, C2 là các ảnh hiển vi tổng hợp tín hiệu huỳnh quang từ Cy3, phát ra từ đầu dò PS1, phản ánh sự
B1
A1 C1
B2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
có mặt của vi khuẩn oxi hóa sắt trong mẫu. Độ phóng đại của các ảnh hiển vi là 40x.
THẢO LUẬN CHUNG
Nhìn chung, có thể thấy rõ có những khác biệt nhất định giữa kết quả phân tích vi sinh truyền thống và kết quả phân tích DGGE đối với mỗi quần xã. Với MFC1, kết quả phân lập cho thấy chỉ thu đƣợc 2 chủng từ dịch anode, trong khi kết quả DGGE chỉ ra sự có mặt của trên 5 loài. Với MFC2, kết quả DGGE chỉ ra sự có mặt ƣu thế của Geobacter sp. trong khi quá trình phân lập lại không thu đƣợc vi khuẩn này. Với MFC3, hai kết quả cũng có độ lệch nhất định. Những sự sai khác nói trên là có thể dự đoán đƣợc, vì hiện nay phần lớn vi sinh vật đƣợc cho là chƣa nuôi cấy đƣợc, trên 99% các loài vi khuẩn trong tự nhiên không thể nuôi cấy đƣợc bằng kỹ thuật truyền thống [71]. Hơn thế nữa, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng môi trƣờng Winogradsky là môi trƣờng cũng có tính chọn lọc cao. Tuy nhiên, có thể thấy rõ rằng, về cơ bản kết quả phân tích vi sinh truyền thống và kết quả phân tích DGGE đối với các quần xã của MFC2 và MFC3 là khá tƣơng đồng. Cụ thể, cả hai phƣơng pháp đều cho thấy sự ƣu thế của các vi khuẩn Pseudomonas và Bacillus trong quần
xã của MFC2, và của Pseudmonas trong quần xã của MFC3. Sự tƣơng đồng
giữa hai phƣơng pháp khẳng định chắc chắn hơn về sự có mặt ƣu thế của các vi khuẩn nói trên trong quần xã tƣơng ứng.
Từ những kết quả phân lập vi sinh truyền thống và điện di DGGE đã thu đƣợc trên đây có thể thấy rõ sự khác nhau về độ đa dạng, thành phần loài của các quần xã vi khuẩn anode các MFC khác nhau trong quá trình làm giàu; và dƣờng nhƣ sự khác nhau này có mối liên hệ nhất định đến sự khác nhau về hoạt động của các quần xã:
-Quần xã vi khuẩn của MFC1 (đối chứng) khác hẳn quần xã của hai MFC còn lại, cả về số lƣợng và thành phần loài. Điều này chắc chắn có liên quan đến khả năng sinh điện kém hơn của MFC1 so với hai MFC còn lại và cho thấy nguồn vi sinh vật ban đầu là cần thiết để làm giàu vi sinh vật điện hóa mong muốn. Các nguồn vi sinh vật ban đầu của MFC2 và MFC3 đều khá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đa dạng hoặc đã đƣợc chọn lọc định hƣớng trƣớc nên chắc chắn chúng cho phép làm giàu đƣợc nhiều các vi khuẩn ôxi hóa sắt chuyên biệt hơn, có khả năng sinh điện tốt hơn. Các kết quả nghiên cứu MFC trƣớc đây đều chỉ ra rằng khâu làm giàu vi sinh vật điện hóa trong anode từ một nguồn tự nhiên là cần thiết để phát triển thành công pin nhiên liệu vi sinh vật theo ý muốn [52].
-Quần xã vi sinh vật anode MFC2 và MFC3 có số lƣợng loài phân lập đƣợc tƣơng đƣơng nhau nhƣng khác nhau về thành phần loài. Kết quả DGGE (Hình 16) cho thấy rõ quần xã của MFC2 đa dạng hơn MFC3. Sự khác nhau này đƣợc tạo ra chỉ có thể do sự khác nhau ở nguồn vi sinh vật ban đầu. Chúng tôi cũng nhận thấy MFC2 hoạt động ổn định hơn và điều này có lẽ cũng liên quan đến hệ vi khuẩn đƣợc làm giàu, có thể là đa dạng hơn và khả năng thích ứng tốt hơn do có nguồn gốc từ một quần xã tự nhiên. Các nghiên cứu trƣớc đây cũng cho thấy các MFC vận hành với các quần xã đa chủng luôn có sự ổn định cao và thậm chí hiệu suất sinh điện cũng cao hơn các MFC vận hành với một chủng hoặc một vài chủng chọn lọc [39]. Ở MFC2, một điều đáng chú ý là sự có mặt của Geobacter sp., một nhóm vi khuẩn có tính hoạt điện mạnh, đƣợc phát hiện và sử dụng trong nhiều loại MFC [69]. Trong tự nhiên, Geobacter sp. đƣợc tìm thấy trong điều kiện yếm khí trong đất và trầm tích dƣới nƣớc [69].
Sự có mặt ƣu thế của Pseudomonas ở các MFC hay của Bacillus ở MFC2 là những kết quả rất đáng lƣu ý; bởi vì đây không phải là các vi khuẩn đƣợc biết đến nhƣ là các vi khuẩn ôxi hóa sắt tiêu biểu, đặc biệt là theo hình thức hóa tự dƣỡng. Kết quả FISH cho thấy sự có mặt của vi khuẩn oxi hóa sắt chủ yếu trong phần dịch anode của MFC với quần xã anode làm giàu từ nguồn tự nhiên. Trong các hệ thống MFC, các Pseudmonas đƣợc biết đến nhƣ là các vi khuẩn điện hóa truyền điện tử cho điện cực thông qua chất truyền điện tử trung gian do chúng tự sản sinh, và vì vậy chúng không cần bám trên bề mặt điện cực mà có thể hoạt động chính trong phần dịch anode [40]. Từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
các dữliệu nói trên, có hai giả thuyết đƣợc đặt ra về vai trò của các vi khuẩn trong các quần xã anode đƣợc nghiên cứu:
(i) Giả thuyết 1: Có một nhóm vi khuẩn thuộc chi Pseudomonaslà các vi khuẩn ôxi hóa sắt chính trong các MFC của chúng tôi. Điều này sẽ là hợp lý để giải thích sự có mặt ƣu thế của các Pseudomonas và sự có mặt chủ yếu trong phần dịch của vi khuẩn ôxi sắt. Theo đó, có thể nhóm Pseudomonas này có thể thực hiện ôxi hóa sắt, thu điện tử, truyền điện tử đến điện cực qua chất truyền điện tử trung gian tự sinh và thực hiện hóa tự dƣỡng để tồn tại. Nếu đúng nhƣ vậy thì đây sẽ là một điểm mới về trao đổi chất của Pseudomonas.
Trong trƣờng hợp này, probe PS1 (vốn đƣợc thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự 16S rADN của các vi khuẩn sắt khác nhau) có thể cũng nhận biết nhóm Pseudomonas này nên kết quả FISH mới nhƣ vậy [66].
(ii) Giả thuyết 2: Các vi khuẩn Pseudomonas thông thƣờng cộng sinh với các vi khuẩn ôxi hóa sắt trong anode của các MFC. Theo cách giải thích này, các vi khuẩn sắt cũng không cần có mặt trên điện cực, mà chỉ cần tƣơng tác với các Pseudomonastrong phần dịch anode. Các vi khuẩn sắt có thể thực hiện hóa tự dƣỡng ôxi hóa sắt thu năng lƣợng và tạo ra cơ chất để Pseudomonas sử dụng; Pseudomonas ôxi hóa các cơ chất thứ cấp này và tƣơng tác với điện cực thông qua các chất truyền điện tử trung gian mà chúng tự sản sinh. Ở MFC2 hoặc các vi khuẩn sắt khác mà chúng tôi chƣa phát hiện đƣợc. Sự có mặt ƣu thế của các
Pseudomonas gợi ý rằng, nếu giả thuyết này đúng thì các vi khuẩn sắt thực thụ cũng không đóng vai trò chính mà chỉ ở vị trí hỗ trợ cho các
Pseudomonastrong toàn bộ con đƣờng chuyển hóa ở anode.
Trong trƣờng hợp giả thuyết này đúng, kết quả FISH với probe PS1 có lẽ phản ánh sự có mặt thực thụ của vi khuẩn sắt. Tuy nhiên với sự có mặt ƣu thế của Pseudomonas thể hiện bằng các kết quả DGGE, cũng có thể xảy ra khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
năng PS1 cũng nhận biết một số Pseudomonas, dẫn đến tín hiệu ƣu thế của PS1 trong thí nghiệm FISH.
Sự phát hiện Geobacter sp. ở MFC2 cùng với khả năng sinh điện trội hơn hẳn của MFC2 và MFC3 so với MFC1 khiến chúng tôi thiên về giả thuyết 2. Bởi vì, chỉ MFC2 và 3 đƣợc cung cấp nguồn vi sinh vật ban đầu. Điều này chắc chắn tạo ra sự khác biệt về thành phần hệ vi khuẩn đƣợc làm giàu; cụ thể là các vi khuẩn ôxi hóa sắt chuyên biệt có thể đƣợc chọn lọc ở 2 MFC này trong khi chúng không thể có ở MFC1, nơi mà vi khuẩn có mặt chỉ là do nhiễm từ môi trƣờng xung quanh. Và chính sự khác biệt này có lẽ quyết định sự khác nhau về khả năng sinh điện giữa MFC2, MFC3 và MFC1; bởi sự có mặt của các vi khuẩn sắt sẽ giúp thu năng lƣợng từ Fe(II) hiệu quả hơn, còn các Pseudomonas có lẽ chỉ đóng vai trò giúp thực hiện khâu cuối cùng là truyền điện tử đến điện cực. Tuy nhiên, với giả thuyết 1 về khả năng tồn tại các
Pseudomonas ôxi hóa sắt, sự khác nhau về khả năng sinh điện giữa các MFC vẫn có thể đƣợc giải thích bởi sự làm giàu một nhóm Pseudomonas ôxi hóa sắt chuyên biệt hơn từ nguồn vi sinh vật ban đầu đa dạng của MFC2 và MFC3.
Vai trò của Bacillus – khá phổ biến ở các MFC trong nghiên cứu này - vẫn là một câu hỏi cần đƣợc tìm hiểu thêm. Bacillus là nhóm vi khuẩn có khả năng trao đổi chất đa dạng [72]. Vì vậy, có lẽ chúng đóng vai trò hỗ trợ hoặc tham gia vào các bƣớc chuyển hóa trung gian trong phản ứng anode. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để đạt đƣợc trạng thái quần xã vi sinh vật anode ổn định, quần xã vi sinh vật ban đầu phải trải qua những quần xã trung gian để chọn lọc những loài có khả năng thích nghi với điều kiện hoạt động trong khoang anode. Chính vì vậy, có thể thấy phải sau một thời gian làm giàu nhất định thì dòng điện sinh ra của các MFC mới ổn định.
Kết hợp những kết quả nghiên cứu đã đạt đƣợc chúng tôi cho rằng, việc làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt trong thiết bị MFC có thể thực hiện đƣợc ở pH trung tính, với nguồn vi sinh vật từ bùn tự nhiên. Thời gian làm giàu không
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cần thiết quá dài, khoảng 3 - 4 tuần là phù hợp, bởi vì vi khuẩn hoạt động chính nằm trong phần dịch, nghĩa là không cần chờ sự hình thành một biofilm trên bề mặt điện cực.
KẾT LUẬN
1. Trong nghiên cứu này, pin nhiên liệu vi sinh vật chứa các vi khuẩn oxi sắt đƣợc làm giàu đã bƣớc đầu đƣợc phát triển thành công.
2. Các quần xã vi khuẩn ôxi sắt ở anode đƣợc làm giàu từ các nguồn vi sinh vật khác nhau thì cũng khác nhau. Việc làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt cho anode của MFC ở pH trung tính (pH 6,5 - 7) sử dụng nguồn vi sinh vật từ bùn tự nhiên là có hiệu quả nhất.
3. Các vi khuẩn nhƣ Bacillus sp. và Pseudomonas sp., không thuộc nhóm vi khuẩn sắt phổ biến, chiếm ƣu thế trong hệ vi khuẩn ôxi hóa sắt(II) ở anode của các MFC đƣợc phát triển. Các vi khuẩn này có thể cộng sinh với các vi khuẩn sắt đặc trƣng hoặc bản thân chúng cũng thực hiện quá trình ôxi hóa sắt (trong điều kiện pH trung tính) và truyền điện tử tới điện cực. 4. Thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật chứa các vi khuẩn sắt đƣợc làm giàu
trong nghiên cứu này đã bƣớc đầu thể hiện các đặc điểm của một cảm biến sinh học phát hiện nhanh Fe(II) có mặt trong mẫu dịch anode.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Nghiên cứu về tƣơng tác giữa các vi sinh vật trong khoang anode thiết bị đƣợc làm giàu, tìm hiểu về hoạt tính điện hóa của quần xã vi sinh vật đó để làm rõ vai trò của chúng trong quá trình truyền điện tử đến điện cực.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt.
[1] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền, 2009 : “Vi khuẩn sinh trƣởng bằng oxy hóa sắt II và khử nitrat ở Việt Nam:Tính đa đạng và ứng dụng”. [13] Trần thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh,”chuyển hóa sắt trong cơ thể và quá tải
sắt ở một số bệnh máu” Hội nghị khoa học ngành huyết học – truyền máu Quốc gia.
[18] Phạm Thế Hải, Nguyễn Thị Thu Thủy, Trần Nguyễn Hoàng Phƣơng, Lƣơng Thị Thanh Thà, bƣớc đầu phát triển pin nhiên liệu vi sinh vật chứa vi khuẩn sắt đƣợc làm giàu để làm cảm biến sinh học phát hiện tại chỗ sắt trong nƣớc. 2013.
[26] Đặng Đình Kim. Xử lý ô nhiễm một số kim loại nặng trong nƣớc thải công nghiệp bằng phƣơng pháp sinh học. Tổng luận phân tích. Trung tâm thông tin tƣ liệu - Trung tâm KHTN và CN quốc gia. Hà Nội 2000.
[43] Lại Thúy Hiền, “Giáo trình sau đại học, Phân loại Vi sinh vật”, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 2012.
Tài liệu tiếng Anh.
[2] J. D. Coates. K. Wrighton. "Microbial Fuel Cells: Plug-in and Power-on Microbiology." Microbe Magazine, 2009.
[3] H. Liu. R. Ramnarayanan. B. E. Logan. “Production of Electricity during Wastewater Treatment Using a Single Chamber Microbial Fuel Cell.”
Environmental Science & Technology, vol. 38, iss. 7, pp. 2281-2285, 2004. [4] B. E. Logan. "Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology."
Environmental Science and Technology, vol. 40, iss. 17, pp. 5181-192, 2006. [5] Logan "Modified Microbial Fuel Cell Produces Electricity and Desalinates
Water." FuelCellsWorks: Leader in the Fuel Cell Industry. Aug. 9, 2009. [6] "Microbial Fuel Cell: High Yield Hydrogen Source And Wastewater Cleaner."
ScienceDaily, 2010.
[7] B. E. Logan. Microbial Fuel Cells. New York: Wiley-Interscience, 2008. Print. [8] K. Rabaey and W. Verstraete. "Microbial fuel cells: novel biotechnology for
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[9] Straub KL, Benz M, Schink B, “Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH”, FEMS Microbiol Ecol, 34pp, 181-186, 2001. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[10]. Weber KA, Achenbach LA, Coates JD, “Microorganisms pumping iron: anaerobic microbial iron oxidation and reduction”, Nature, 4pp. 752 - 764, 2006.
[11] Temple KL, Colmer AR. “The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium:Thiobacillus ferrooxidans”, J Bacteriol, 62, 605-611, 1951.
[12] Yamanaka T et al. “ Moleculer aspects of the electron transfer system which participates in the oxidation of ferrous ion by Thiobacillus ferrooxidans”,
FEMS Microbiol Rev,17(4), pp 401-413, 1995.
[14] Moon J, Iron – the most deadly metal, George Ohsawa Macrobiotic Foundation Chico, California.
[15] Mehanna,M , Saito, “Using microbial desalination cells to reduce water salinity 66 prior to reverse osmosis”, Environment Science. 3(8): 1114-1120, 2010 [16] Liu.H, Logan,B “Electricity generation using an air-cathode single chamber
Microbial fuel cell in presence and absence of a proton exchange membrane”,
Environ. Sci. Technol, 38, 4040-4046, 2004.
[17] Priscilla A, Selembo, Matthew D. Merrill, Bruce E. Logan, “Hydrogen production with nickel powdercathode catalysts in microbial electrolysis cells”, Hydrogen Energy 35, 428-437, 2010.
[19] V. B. Souza , Roberto Moreira da Silva Júnior , Daniela Koshikene “Applications of fluorescent in situ hybridization (FISH) in environmental microbiology” . vol.5, p. 408-411. 2007
[20] Langer-Safer PR, Levine M, Ward DC (July 1982). "Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.79 (14): 4381–5.
[21] Giovannoni SJ et al., “ Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identificatio of single microbial cells” J Bacteriol, 170(2), pp.720- 726, 1988.
[22] Delong EF et al., “Phylogenetic stain: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells”, Science, 243(4896), pp.1360-1363, 1989.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/