1.7.2.1Điện di gel gradient biến tính (DGGE)
Điện di gel gradient biến tính (DGGE) là một kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và đã trở thành kỹ thuật chính trong nghiên cứu về các đặc điểm cấu trúc và động thái của quần xã vi sinh vật trong vi sinh môi trƣờng [41]. Đây là một kỹ thuật hữu hiệu, có thể cung cấp một cách nhanh chóng những đặc điểm về thành phần loài và tính đa dạng của quần xã vi sinh vật chứa trong mẫu cần phân tích.
DGGE đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn ADN sợi đôi giống hệt nhau về chiều dài nhƣng khác nhau về trình tự, cụ thể là sự khác nhau về tỷ lệ G+C/A+T. Một hỗn hợp là sản phẩm của phản ứng PCR bao gồm các đoạn ADN có chiều dài bằng nhau đƣợc điện di trên một bản gel acrylamide không đồng nhất về thành phần hóa học mà có chứa chất làm biến tính ADN với gradient nồng độ tăng dần từ nồng độ thấp đến nồng độ cao[42]. Trong thời gian điện di, phân tử ADN nào có tỷ lệ GC thấp hơn sẽ dừng lại trƣớc, phân tử ADN nào có tỷ lệ GC cao hơn sẽ tiếp tục di chuyển và dừng lại ở vị trí có nồng độ chất làm biến tính cao hơn trên bản gel. Đoạn ADN sợi đôi có thể di chuyển dễ dàng trong bản gel acrylamide, còn các phân tử ADN biến tính sẽ di chuyển chậm và dừng lại trên gel nhờ có GC-clamp (kẹp GC). Theo cách này, các đoạn ADN có trình tự khác nhau có thể đƣợc tách ra ở các vị trí khác nhau trên gel acrylamide. Phƣơng pháp này rất nhạy và hiệu quả đối với việc phân tích thành phần, cấu trúc của một khu hệ vi sinh vật, kể cả những đối tƣợng không nuôi cấy đƣợc.Thời gian cần thiết cho phƣơng pháp này là khoảng 2 - 3 ngày. Đặc biệt, DGGE rất hữu hiệu khi so sánh về thành phần, cấu trúc hệ vi sinh vật trong các mẫu khác nhau, hoặc cùng một mẫu nhƣng có sự thay đổi về thành phần theo thời gian [43].
Ƣu điểm nổi bật của DGGE là có thể xác định sự có mặt của các nhóm, loài vi sinh vật không thể nuôi cấy đƣợc trong mẫu cần phân tích[43].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.7.2.2FISH (Fluorescence In Situ Hydridization)
Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một kỹ thuật sinh học phân tử,đƣợc phát triển bởi các nhà nghiên cứu y sinh từ đầu những năm 1980[20], đƣợc sử dụng để phát hiện và khoanh vùng sự hiện diện hay vắng mặt của các trình tự ADN chuyên biệt trên nhiễm sắc thể.
FISH ứng dụng cho nghiên cứu vi sinh vật lần đầu tiên đƣợc mô tả vào cuối những năm 1980, đầu những năm 1990[21,22,23] và đƣợc đánh dấu nhƣ một bƣớc tiến vƣợt bậc trong lĩnh vực sinh thái vi sinh vật. Phƣơng pháp này sử dụng đầu dò có gắn huỳnh quang liên kết với một đoạn ADN (đoạn mồi hay đầu dò) có trình tự bổ sung với trình tự của một đoạn axit nucleic đặc thù của tế bào vi sinh vật. Tế bào mang ADN hay ARN “lai” đƣợc với đoạn mồi gắn huỳnh quang này sẽ đƣợc phát hiện và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Đây là phƣơng pháp duy nhất cho phép đánh giá tính đa dạng của một loài hoặc một nhóm loài một cách trực tiếp trong các mẫu cần phân tích thông qua việc phát hiện các trình tự axit nucleic đặc thù của loài/nhóm loài đó ngay trong mẫu mà không cần nuôi cấy [24].
Việc ứng dụng các kỹ thuật nêu trên có thể giúp thu đƣợc những kết quả làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật, giúp cho việc phát triển hoặc tối ƣu các công nghệ sử dụng vi sinh vật trở nên khả thi và tăng khả năng triển khai thực tế của chúng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu của đề tài
- Làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt thành công từ hai nguồn vi sinh vật khác nhau: Dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt và bùn ngoài tự nhiên.
- Xác định độ đa dạng và sự biến đổi của quần xã vi khuẩn trong quá trình làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt của các MFC.
- So sánh độ đa dạng thành phần loài giữa các quần xã trong các MFC đƣợc làm giàu từ những nguồn vi sinh vật khác nhau.
2.2 Nội dung của đề tài
Đề tài sẽ bao gồm một số nội dung chính với các vấn đề cần giải quyết sau: - Xây dựng hệ thống các MFC.
- Làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt từ hai nguồn vi sinh vật khác nhau: Dịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt, bùn ngoài tự nhiên, và một MFC đối chứng (không bổ sung nguồn vi sinh vật ban đầu).
- Thử các phản ứng của các thiết bị các nồng độ sắt khác nhau.
- Xác định độ đa dạng và sự biến đổi tƣơng ứng của quần xã vi sinh vật trong quá trình hình thành và vận hành các MFC bằng ba phƣơng pháp:
+ Phân lập vi sinh vật truyền thống
+ DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) + FISH (Fluorescence In Situ Hydridization)
2.3 Vật liệu
2.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Các pin nhiên liệu vi sinh vật đƣợc thiết kế, chế tạo trong nghiên cứu. Bốn nhóm mẫu vi sinh vật đƣợc thu thập phục vụ cho nghiên cứu này là: - Mẫu bùn tự nhiên lấy dƣới độ sâu 20cm tại một con suối có màu nƣớc vàng ố đặc trƣng của khu vực có nhiều sắt tại xã Đồng Tân, huyện Ứng Hòa, thành phố Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
vật - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Mẫu dịch lấy từ khoang anode của các MFC trong quá trình hoạt động. - Mẫu điện cực than chì trong khoang anode của MFC đã hoạt động ổn định.
Các mẫu để sử dụng làm nguồn vi sinh vật cho các MFC đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Các mẫu để sử dụng cho các thí nghiệm sinh học phân tử đƣợc bảo quản trong glycerol (15%) ở -20oC cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học - Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các máy móc, thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, Sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ). - Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)
- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)
- Máy DGGE K-2401 (C.B.S Scientific, Mỹ) - Bàn soi gel LMW-20 UVP (UK).
- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)
Ngoài ra, nghiên cứu còn đƣợc sự trợ giúp về máy móc thiết bị của Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học trong thí nghiệm FISH. Một số thiết bị cần thiết khác đƣợc sử dụng trong quá trình hoạt động của pin nhiên liệu vi sinh vật nhƣ bình khí Nito, bình Duran nút cao su, hệ thống dây dẫn silicon, đồng hồ vạn năng (Honeytek, Hàn Quốc).
Hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: Các muối (NaCl, MgSO4...), nguyên tố vi lƣợng(H3BO3, CoCl2.6H2O...), ammonium ferric citrat, ... Trừ một số hóa chất thông thƣờng không dùng cho các thí nghiệm sinh học phân tử (ví dụ NaCl) có xuất xứ Trung Quốc, các hóa chất quan trọng đều đƣợc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cung cấp bởi các hãng lớn nhƣ Merck, Sigma.
Hoá chất sử dụng trong phƣơng pháp điện di gel biến tính DGGE: Acrylamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl ethylenediamine), APS (Ammonium persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ) cung cấp.
Hoá chất sử dụng trong các thí nghiệm Sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử dụng tách ADN (Glycogen 20mg/ml, Ethanol 100%, Ammonium acetate) , phản ứng PCR (USB Taq PCR Master Mix 2x), điện di kiểm tra sản phẩm PCR (HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x, Loading Dye 6x, GeneRuler 1kb ADN Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup). Tất cả đều đƣợc cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và Fermentas (Mỹ).
Hóa chất sử dụng trong phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ FISH: Formaldehyde 37 %, NaCl, EDTA (Ethylene diamine tetra aceticacid), Formamide, PBS (Phosphate buffered saline), Tris-HCl, SDS (Sodium dodecyl sulfate), DAPI (4’6-diamidino-2-phenylindole). Các hóa chất này đều đƣợc cung cấp bởi các hãng tin cậy (Sigma, Merck, Promega).
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Thiết kế, xây dựng và vận hành MFC
Thiết kế và xây dựng MFC: Các pin nhiên liệu vi sinh vật đƣợc chế tạo theo mô hình của Trung tâm Quốc gia Anh về Giáo dục Công nghệ sinh học (National Centre for Biotechnology Education) - gọi tắt là mô hình NCBE [53] - nhƣng với kích thƣớc nhỏ hơn để phù hợp hơn với mục đích sử dụng làm cảm biến sinh học (Hình 7).
Cụ thể, mỗi thiết bị MFC bao gồm 2 tấm perpex lớn kích thƣớc 12cm×12cm×2cm, 2 khung nhỏ để tạo khoang anode và cathode với kích thƣớc 8cm × 8cm × 1,5cm, ở giữa rỗng dạng hình vuông kích thƣớc 5cm × 5cm. Các hạt than chì đƣờng kính 3-5 mm [54] đƣợc đổ lấp đầy mỗi khoang, đảm bảo tiếp xúc với nhau và tiếp xúc với một que than chì (đƣờng kính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0,5cm) đƣợc gắn xuyên qua tấm perpex lớn và thông ra bên ngoài. Tập hợp các hạt than chì và que than chì chính là các điện cực ở mỗi khoang. Giữa các khung có các tấm đệm cao su để đảm bảo độ kín chặt của các khoang anode và cathode. Màng Nafion N117 (DuPont, Hoa Kỳ) kích thƣớc 6cm × 6cm đƣợc sử dụng để ngăn cách khoang anode và cathode. Thiết bị đƣợc lắp ráp và cố định nhờ ốc và bu-lông xuyên qua 4 góc mỗi tấm lớn. Các đầu điện cực que than chì đƣợc nối với ngàm cá sấu và dây dẫn điện bằng đồng (đƣờng kính 1mm) và nối với một điện trở mạch ngoài (10Ω).
Để tạo đƣờng vào và ra cho dịch anode và cathode, các khung lớn ở anode và cathode đƣợc khoan lỗ và ống nhựa PVC đƣờng kính 5cm đƣợc gắn vào các lỗ đó. Ống dẫn dịch vào anode đƣợc nối qua ống nhỏ giọt với bình chứa môi trƣờng M9 cải tiến (Bảng 1).
Hình 7: Pin nhiên liệu vi sinh vật thiết kế theo mô hình NCBE Bảng 1: Môi trƣờng M9 cải tiến cho khoang anode
STT Thành phần Hàm lƣợng 1 Nƣớc cất 1 L 2 KH2PO4 0,44 g 3 K2HPO4 0,34 g 4 NaCl 0,5 g 5 MgSO4.7H2O 0,2 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
6 CaCl2 0,0146 g
7 Trace elements 1 mL
Khử trùng ở 121oC/ 15 phút.
Bảng 2: Hỗn hợp vi lƣợng (Dung dịch Trace element)
STT Thành phần Hàm lƣợng 1 Nƣớc cất 1 L 2 FeSO4.7H2O 1 g 3 ZnCl2 0,07 g 4 MnCl2.4H2O 0,1 g 5 H3BO3 0,006 g 6 CaCl2.6H2O 0,13 g 7 CuCl2.2H2O 0,002 g 8 NiCl2. 6H2O 0,024 g 9 Na2Mo4.2H2O 0,036 g 10 CoCl2.6H2O 0,238 g
Bảng 3: Dung dịch đệm cho khoang cathode
STT Thành phần Hàm lƣợng
1 Nƣớc cất 1 L
2 KH2PO4 4,4 g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 K2HPO4 3,4 g
4 NaCl 0,5 g
Vận hành: Các thiết bị MFCđƣợc vận hành theo mẻ (batch mode). Trƣớc khi đƣợc đƣa vào khoang anode, bình chứa môi trƣờng đƣợc sục khí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Ni-tơ khoảng 30 phút để đuổi khí ôxi, nhằm giảm bớt sự có mặt của chất nhận điện tử cạnh tranh này ở anode. Khi bắt đầu một mẻ vận hành, Fe(II) ở dạng dung dịch FeCl2, cùng hỗn hợp các nguyên tố vi lƣợng (Bảng 2), sẽ đƣợc cấp vào khoang anode bằng xi-lanh qua một ống chữ T trên đƣờng ống dẫn dịch.Lƣợng FeCl2đƣợc tính toán sao cho nồng độ cuối cùng trong khoang anode đạt giá trị cần thử nghiệm. Tiếp đó, cũng qua ống chữ T, dung dịch M9 đƣợc hút, bằng xi-lanh, từ bình môi trƣờng, đi quaống nhỏ giọt và ống dẫn,rồi đƣợc bơm vào khoang anode của thiết bị. Sau cùng HCO3
-
- nguồn cacbon cho vi khuẩn oxi hóa sắt đƣợc cung cấp dƣới dạng dung dịch NaHCO3 vào khoang anode, theo cách tƣơng tự nhƣ Fe(II) đƣợc cung cấp, sao cho nồng độ cuối cùng trong dịch anode đạt 2 g/L [55]. Cách cung cấp các thành phần dịch anode nhƣ trên đảm bảo tránh sự tạo thành các muối carbonatekết tủa trong dịch anode.
Ở khoang cathode, trong quá trình vận hành luôn đƣợc sục khí bằng máy sục khí SL-2800 (Silver Lake, Trung Quốc) để cung cấp Oxi (chất nhận điện tử cuối cùng); tốc độ sục khí đƣợc điều chỉnh vừa phải để tránh dung dịch cathode bay hơi quá nhanh. Kết thúc mỗi mẻ vận hành, khoang cathode lại đƣợc bơm đầy bằng dung dịch đệm (Bảng 3).
Một mẻ vận hành đƣợc tính từ lúc bắt đầu cấp môi trƣờng chứa Fe(II) vào khoang anode cho đến khi dòng điện sinh ra giảm về giá trị ban đầu (thƣờng khoảng 2h).
2.4.2 Làm giàu vi khuẩn ôxi hóa sắt trong các MFC
Việc thực hiện làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt đƣợc thực hiện trên 2 MFC (ký hiệu MFC2 và MFC3) từ 2 nguồn vi sinh vật khác nhau:
- MFC2 đƣợc làm giàu từ nguồn vi sinh vật là bùn từ nhiên bùn tự nhiên lấy dƣới độ sâu 20cm tại một con suối có màu nƣớc vàng ố đặc trƣng của khu vực có nhiều sắt tại xã Đồng Tân, huyện Ứng Hòa, thành phố Hà Nội.
- MFC3 đƣợc làm giàu từ nguồn vi sinh vật làdịch làm giàu vi khuẩn oxi hóa sắt của Phòng Sinh thái Vi sinh vật - Viện Vi sinh vật và Công nghệ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Dùng 1ml mỗi loại nguồn vi sinh vật đƣợc chọn, đem ly tâm(5000 vòng/phút, trong 10 phút) thu cặn, hòa tan lại bằng 1ml dịch M9. 1ml hỗn hợp này đƣợc cấp vào khoang anode cùng dịch M9, Fe(II), NaHCO3 trong 3 ngày vận hành đầu tiên của các MFC.
- MFC4 đƣợc làm giàu theo điều kiện giống MFC2, sử dụng riêng cho thí nghiệm FISH.
Song song với 2 MFC đƣợc cấp nguồn vi sinh vật, một MFC đối chứng (ký hiệu MFC1) đƣợc tiến hành với điều kiện tƣơng tự nhƣng không bổ sung nguồn vi sinh vật. Trong vòng 2 - 4 tuần, dòng điện sinh ra bởi các MFC đƣợc theo dõi và ghi lại hàng ngày, đồng thời dịch mẫu anode của mỗi MFC đƣợc giữ lại trong ống eppendorf 1,5 ml, bảo quản ở 4oC để phục vụ cho các phân tích vi sinh và sinh học phân tử.
2.4.3 Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống
Các mẫu dịch anode sau mỗi mẻ vận hành của các MFC đƣợc thu và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Các mẫu thu ở thời điểm các MFC sinh dòng điện ổn định đƣợc sử dụng cho quá trình phân lập vi sinh vật. Để phân lập các chủng vi khuẩn oxi hóa sắt, các mẫu đƣợc pha loãng ở 4 nồng độ (10-1-10-4) và cấy trên đĩa môi trƣờng thạch Winograsky [25] (Bảng 4) bằng phƣơng pháp cấy gạt, sau đó các đĩa thạch đƣợc quấn parafilm và để trong tủ ấm 30oC trong 48 giờ. Bảng 4: Môi trƣờng Winograsky [65] STT Thành phần Hàm lƣợng 1 Nƣớc cất 1 L 2 K2HPO4 0,5 g 3 NaNO3 0,5 g 4 CaCl2 0,2 g 5 MgSO4.7H2O 0,5 g 6 NH4NO3 0,5 g 7 FeC6H5O7NH4OH 6 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(Ammonium ferric citrat)
8 Thạch agar 17 g
pH 6.5 ± 0.5, khử trùng ở 121o
C/ 15 phút.
Sau 48h các đĩa pettri đƣợc đem ra kiểm tra sự xuất hiện khuẩn lạc. Những khuẩn lạc mọc riêng rẽ đƣợc tuyển chọn, đƣợc chuyển sang đĩa thạch Winograsky khác bằng phƣơng pháp cấy ria 3 pha để tinh sạch. Các chủng thu đƣợc đƣợc lƣu giữ trong dung dịch glycerol 20%, ở - 20o
C, để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram và quan sát hiển vi
Dịch nuôi cấy huyền phù tế bào hoặc khuẩn lạc của chủng cần quan sát đƣợc nhỏ lên bề mặt lam kính sạch và cố định tiêu bản bằng ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút. Sau khi rửa bằng nƣớc cất, mẫu đƣợc nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút. Vết bôi đƣợc rửa lại bằng ethanol 96% trong 30 giây, sau đó đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất. Mẫu đƣợc nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm bổ sung màu đỏ Safranin (hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây. Cuối cùng, mẫu đƣợc rửa bằng