Để xác định sự có mặt của vi khuẩn oxi hóa sắt trong MFC đƣợc làm giàu bằng phƣơng pháp lại huỳnh quang tại chỗ FISH, một thiết bị pin nhiên liệu vi sinh ký hiệu MFC4 đƣợc tiến hành làm giàu đồng thời với điều kiện tƣơng tự MFC2 (nguồn vi khuẩn từ bùn tự nhiên). Sau khi làm giàu thành công (3 - 4 tuần), dịch anode và phần hạt than chì đƣợc giữ lại, bảo quản ở 4oC sử dụng cho phân tích FISH. Sự có mặt của vi khuẩn oxi hóa sắt đƣợc xác định trên 3 mẫu: nguồn vi sinh vật ban đầu, dịch anode và các hạt điện cực than chì khi đã làm giàu thành công.
Bảng 8: Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa cho mỗi mẫu
Dung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối 2ml đệm lai 50ml đệm rửa 5 M NaCl 360µl 2,4 ml 900mM 1M Tris/HCl 40 µl 1 ml 20 mM Formamide 35 % 0,5M EDTA 0,5 ml 5 mM
Nƣớc cất vô trùng dẫn tới 2 ml dẫn tới 50 ml
SDS 10% (bổ sung cuối
cùng để tránh kết tủa) 2 µl 50 µl 0,01%
Các mẫu cần phân tích đƣợc tiến hành theo 3 bƣớc chính:
Bước 1: Cố định mẫu
Trộn 1ml mẫu đƣợc với 0,1ml dung dịch PBS 1x (đệm photphat, pH7), bổ sung 1ml formaldehyde 37% vào mẫu và giữ ở 4ºC trong thời gian ít nhất là 30 phút nhƣng không quá 24 giờ. Ly tâm loại bỏ phần dịch và rửa lại cặn tế bào bằng PBS 1x. Tiếp tục ly tâm loại PBS và phần cặn tế bào đƣợc bổ sung 1,5 ml hỗn hợp dung dịch ethanol/PBS (1:1). Mẫu đã cố định đƣợc bảo quản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tại -20º
C.
Bước 2: Lai với đầu dò
20µl mẫu đƣợc hòa với 2ml nƣớc cất vô trùng và đƣa lên màng polycarbonate (0,2 µl). Để khô mẫu tự nhiên trong không khí và bảo quản trong hộp kín ở -20oC đến khi sử dụng. Chia màng thành các phần nhỏ để sử dụng cho nhiều đầu dò khác nhau, dùng bút chì đánh dấu mẫu. Chuẩn bị 2 ml đệm lai vào ống eppendorf (Bảng 6).
Để chuẩn bị dung dịch đầu dò, 2 µL đầu dò PS1 đƣợc trộn với 18 µL đệm lai trong ống eppendorf, giữ trong đá và tránh ánh sáng. Mẫu dò PS1 (cung cấp bởi Integrated ADN Technologies) bao gồm đoạn oligonucletide PS1 có trình tự (5’-AC GGU AGA GGA GCA AUC -3') đặc hiệu với nhiều vi khuẩn oxi hóa sắt[66], gắn với chất phát tín hiệu huỳnh quang Cy3.
Đặt mảnh màng polycarbonate mang mẫu lên lam kính và nhỏ dung dịch đầu dò đã chuẩn bị lên trên. Đặt toàn bộ lam kính vào ống falcon 50ml có chứa phần còn lại của đệm lai và ủ trong buồng lai ở 46º
C trong 1,5 - 3 giờ.
Chuyển nhanh mẫu sau khi lai sang đệm rửa (Bảng 6) đã đƣợc làm nóng trong bể ổn nhiệt tại 48ºC, trong 15 phút. Gạn bớt đệm, dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua nƣớc cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mặt có mẫu lên trên).
Bước 3: Nhuộm đối chứng và quan sát
Để nhuộm mẫu, nhỏ 50µl dung dịch thuốc nhuộm DAPI lên mỗi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nƣớc cất vô trùng và rửa trong ethanol 80% trong vài giây, rồi để khô tự nhiên trong không khí (đặt trong hộp tối). Mẫu có thể đƣợc bảo quản trong -20oC vài ngày mà không bị thay đổi tín hiệu huỳnh quang. Cuối cùng, mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang (Carl-Zeiss, Đức) có trang bị kính lọc chuyên biệt cho tín hiệu từ Cy3. Kính hiển vi này cũng cho phép quan sát tín hiệu từ DAPI nhờ kính lọc blue/cyan. Hình ảnh thu đƣợc sau đó sẽ đƣợc phân tích bằng phần mềm Image J
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Sự sản sinh dòng điện ở các MFC - dấu hiệu của sự làm giàu thành công vi khuẩn oxi hóa sắt