Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ rubus idaeus với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

ĐẶT VẤN ĐỀ Trở về với thiên nhiên đang là xu hướng chung của nhân loại trên nhiều lĩnh vực, trong đó có dược phẩm. Chính vì lẽ đó, nghiên cứu về cây thuốc và các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu của nhiều nhà khoa học trên thế giới.Trong đó, việc nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa ngày càng được quan tâm và có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Theo đông y, phúc bồn tử ( Rubus idaeus L.) là một trong những vị thuốc có tác dụng chống oxy hóa rất tốt. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hợp chất anthocyanin trong phúc bồn tử giữ vai trò chính trong tác dụng chống oxy hóa. Anthocyanin trong quả phúc bồn tử có hàm lượng khá cao nên việc chiết xuất anthocyanin là hoàn toàn khả thi và có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn. Tuy nhiên, việc chiết xuất bằng dung môi với những kĩ thuật cổ điển thường tốn nhiều thời gian và mang lại hiệu quả thấp. Hơn nữa, nhiệt độ chiết xuất trong một thời gian dài có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc các anthocyanin và làm giảm đi hoạt tính chống oxy hoá của những dược chất này. Theo các nghiên cứu gần đây, phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm với nhiều tính năng ưu việt đã được ứng dụng rộng rãi. Chính vì thế, trong phạm vi bài báo cáo này chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ Rubus idaeus với sự hỗ trợ của sóng siêu âm” với các mục tiêu: Chiết xuất và phân lập anthocyanin bằng phương pháp chiết siêu âm. Xác định các anthocyanin thu được bằng HPLCMS. So sánh kết quả thu được với phương pháp chiết xuất thông thường. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm về siêu âm:1 1.1.1. Định nghĩa siêu âm: Sóng âm thanh là những dao động cơ học trong một chất rắn, chất lỏng, chất khí. Siêu âm là sóng âm có tần số trên 20 KHz mà con người không thể nghe thấy.Âm thanh mà con người nghe được có tần số từ 1–16 KHz. Thiết bị tạo siêu âm (sừng siêu âm), thanh titan được ngâm vào trong dung dịch phản ứng để truyền động thông qua sự rung. 1.1.2. Lợi ích của siêu âm trong chiết xuất: Chiết xuất nhờ siêu âm là một cách hiệu quả để thu được một lượng đáng kể những chất cần phân tích từ nhiều loại mẫu khác nhau. Nhiệt độ và áp suất rất cao tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hòa tan, khuếch tán, vận chuyển, thâm nhập xảy ra dễ dàng hơn. Các quá trình trên phụ thuộc vào năng lượng siêu âm và một chất nền rắn, kết hợp với năng lượng oxy hóa những gốc tự do (hydroxyl và hydrogen peroxide) tạo ra trong suốt quá trình phân tích sẽ mang lại năng suất chiết xuất cao. 1.2. Tổng quan về phúc bồn tử: 1.2.1 Phúc bồn tử: Tên khoa học: Rubus idaeus L. Tên khác: Mâm xôi đỏ. Họ: Hoa hồng ( Rosaceae). 1.2.1.1. Hình thái2: Cây nhỡ, thân bụi, cao khoảng 1.5 mét, lá kép có từ 3 đến 5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn và có cuống dài hơn so với các lá chét còn lại. Cụm hoa hình chùm, nhiều nhị, nhiều lá noãn đỏ, khi chín tạo thành quả kép có mảu đỏ tươi, vị chua, ăn được. 1.3. Tổng quan về Anthocyanin:3 1.3.1. Tính chất Anthocyanin tồn tại đa số trong các thực vật bậc cao, được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ... CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 Chiết xuất Anthocyanin toàn phần từ quả phúc bồn tử: 2.1.1. Quy trình chiết xuất được hỗ trợ bởi sóng siêu âm 60 ± 0.5g mẫu quả ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước 34 mm và cho vào bình 2 cổ có chứa sẵn dung môi chiết xuất HCl 1.5M : ethanol 95% (15:85) với hệ thống làm lạnh (dung tích bình được chọn dựa vào khả năng hòa tan của mẫu trong dung dịch chiết xuất). Bình được ngâm vào bể nước lạnh có kích thước 250 x 240 x 150mm trong buồng siêu âm với nguồn phát sóng siêu âm có công suất 650W, đường kính đầu phát siêu âm 8mm được đặt vào bể ở vị trí ½ chiều cao bể, tần số phát siêu âm 22kHz. Nhiệt độ được duy trì dưới 400C bằng cách thay thế nước trong bể bằng nước lạnh (150C). Bình được lấy ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước lạnh. Lọc qua giấy lọc Whatman No.1 dưới chân không và dung dịch được thu gom vào bình định mức. Phần còn lại được chiết xuất lần nữa với cùng điều kiện. Các anthocyanin qua 2 lần chiết xuất sẽ được dùng để phân tích. 2.1.3. Tinh khiết hóa các Anthocyanin9: Nhựa Amberlite CG50 (50g mỗi lần) được hydrate hóa bằng cách cho vào becher thêm ít nước và gạn, lặp lại vài lần. Nhựa sau khi trương nỡ được nạp vào cột kích thước 26 x 400 mm. 2.1.5. Kết quả chiết xuất: Tiến hành chiết xuất với những điều kiện tối ưu: Tỉ lệ dung môi và dược liệu: 4:1(mlg). Thời gian chiết xuất: 200s Năng lượng siêu âm: 400W Ta thu được 34,5 mg anthocyanidin từ 100g quả tươi. Khoảng 78.13% tổng số bột màu đỏ. Các anthocyanin được xác định bởi HPLCMS và kết quả là 12 loại anthocyanin đã được xác định, trong đó có 8 loại anthocyanidin đặc trưng.

ĐẶT VẤN ĐÊ Trở với thiên nhiên xu hướng chung nhân loại nhiều lĩnh vực, có dược phẩm Chính lẽ đó, nghiên cứu thuốc hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên vấn đề quan tâm hàng đầu nhiều nhà khoa học giới.Trong đó, việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa ngày quan tâm có tiềm ứng dụng lớn Theo đông y, phúc bồn tử ( Rubus idaeus L.) vị thuốc có tác dụng chống oxy hóa tốt Các nghiên cứu gần cũng cho thấy hợp chất anthocyanin phúc bồn tử giữ vai trò tác dụng chống oxy hóa Anthocyanin quả phúc bồn tử có hàm lượng cao nên việc chiết xuất anthocyanin hoàn toàn khả thi có nhiều triển vọng ứng dụng thực tiễn Tuy nhiên, việc chiết xuất dung môi với kĩ thuật cổ điển thường tốn nhiều thời gian mang lại hiệu quả thấp Hơn nữa, nhiệt độ chiết xuất thời gian dài có thể gây thay đổi cấu trúc anthocyanin làm giảm hoạt tính chống oxy hoá dược chất Theo nghiên cứu gần đây, phương pháp chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm với nhiều tính ưu việt đã ứng dụng rộng rãi Chính thế, phạm vi báo cáo chúng định chọn đề tài: “ Chiết xuất phân lập anthocyanin từ Rubus idaeus với hỗ trợ sóng siêu âm” với mục tiêu: - Chiết xuất phân lập anthocyanin phương pháp chiết siêu âm - Xác định anthocyanin thu HPLC-MS - So sánh kết quả thu với phương pháp chiết xuất thông thường Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm siêu âm:[1] 1.1.1 Định nghĩa siêu âm: Sóng âm dao động học chất rắn, chất lỏng, chất khí Siêu âm sóng âm có tần số 20 KHz mà người không thể nghe thấy.Âm mà người nghe có tần số từ 1–16 KHz Thiết bị tạo siêu âm (sừng siêu âm), titan ngâm vào dung dịch phản ứng để truyền động thông qua rung 1.1.2 Lợi ích siêu âm chiết xuất: Chiết xuất nhờ siêu âm cách hiệu quả để thu lượng đáng kể chất cần phân tích từ nhiều loại mẫu khác Nhiệt độ áp suất cao tạo điều kiện thuận lợi cho trình hòa tan, khuếch tán, vận chuyển, thâm nhập xảy dễ dàng Các trình phụ thuộc vào lượng siêu âm chất rắn, kết hợp với lượng oxy hóa gốc tự (hydroxyl hydrogen peroxide) tạo suốt trình phân tích mang lại suất chiết xuất cao Tác động học siêu âm làm cho dung môi thấm sâu vào cấu trúc tế bào cải thiện khả chuyển khối Siêu âm cũng có thể phá vỡ vách tế bào, tạo điều kiện cho hoạt chất giải phóng Sự phá vỡ vách tế bào khả chuyển khối cao hai yếu tố làm tăng hiệu quả chiết xuất sử dụng sóng siêu âm Những hình ảnh hiển vi điện tử đã chứng minh tác động học siêu âm, chủ yếu phá vỡ vách tế bào giải phóng hoạt chất Sóng siêu âm đã sử dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ dược liệu, ví dụ tinh dầu, chất béo, chất bổ sung dinh dưỡng Mason cộng đã đưa nhìn tổng quát ứng dụng siêu âm công nghệ thực phẩm Còn Vinatoru lại phác họa tổng quan việc sử dụng siêu âm để chiết xuất chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu Chiết siêu âm xem phương pháp hiệu quả để chiết xuất chất có hoạt tính sinh học từ Solvia officinalis (Salisova cộng sự, 1997) hoa Hibiscus tiliaceus L (Melecchi cộng sự, 2002), chất chống oxi hóa từ Rosmarinus officinalis (Albu cộng sự, 2004), steroid triterpenoid từ Chresta spp (Schinor, Salvador, Turatti, Zucchi Dias, 2004) 1.1.3 Cơ chế vật lí siêu âm (Sonophysic): Trong chất lỏng, dãn nở sóng âm tạo áp suất âm Nếu sóng siêu âm đủ mạnh, tạo bong bóng bên chất lỏng Đó cũng lúc áp suất âm vượt sức căng cục chất lỏng, bình thường áp suất âm phụ thuộc vào bản chất độ tinh khiết chất lỏng Quá trình sủi bong bóng kéo dài vòng 400 µ s Hầu hết chất lỏng bị nhiễm lượng lớn phần tử nhỏ đủ để làm cho sủi bọt khởi đầu dễ dàng áp suất âm thấp Khi sủi bong bóng xảy chất lỏng gần với bề mặt chất rắn động lực học bọt nước thay đổi cách đột ngột Trong chất lỏng tinh khiết, bọt nước giữ dạng hình cầu chúng xẹp lại, bề mặt chúng không thay đổi Tuy nhiên, gần tới ranh giới chất rắn, chúng xẹp lại không đối xứng, tạo tia chất lỏng bắn với tốc độ cao Năng lượng điện trình dãn nở bọt nước chuyển thành lượng động học tia chất lỏng, di chuyển suốt bên xuyên qua thành đối diện bọt nước Những tia chất lỏng bắn với tốc độ gần 400 km/giờ va chạm mạnh với bề mặt chất rắn Điều có thể gây tổn thương nghiêm trọng vùng va chạm làm cho bề mặt tiếp xúc có khả phản ứng lại mức độ cao Ảnh chụp máy quay vi phim cảm ứng laser tốc độ cao Sự tạovỡ bọt gần bề mặt phân cách rắn lỏng, vòi nhỏ hình thành, bắn vào bề mặt rắn với vận tốc xấp xỉ 400Km/giờ (111 m/s) Sự sủi bọt nhờ sóng siêu âm cho ta thấy mối liên quan độc vô nhị lượng vật chất Nhiệt độ áp suất cao tạo dẫn đến hình thành gốc tự nhiều hợp chất khác.Tầm quan trọng trình sủi bong bóng hóa học siêu âm không phải làm mà hình thành bọt nước mà chỗ điều xảy bọt nước xẹp lại Chúng có thể không hấp thu lượng từ sóng siêu âm nổ tung Sự nén ép đoạn nhiệt nhanh chóng chất khí bên bọt nước tạo nhiệt độ áp suất cực lớn Kích thước bọt nước nhỏ, tương ứng với thể tích chất lỏng, vậy, nhiệt độ sinh có thể biến cách nhanh chóng mà không cần có thay đổi đáng kể điều kiện môi trường Sau bọt nước xẹp lại, nhiệt độ hạ xuống với tốc độ khoảng 10 tỉ 0C/giây (nhanh triệu lần chúng ta nhúng sắt nóng đỏ vào nước) Hot spot có nhiệt độ xấp xỉ 5000oC, áp suất khoảng 1000atm, thời gian sống ngắn 1microsecond, tốc độ gia nhiệt làm lạnh 10 tỉ độ C/giây 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình siêu âm: Sự phân phối sóng siêu âm máy chiết cũng thông số quan trọng để thiết kế máy chiết tốt Năng lượng siêu âm đạt tối đa gần bề mặt đầu dò Càng xa đầu dò, cường độ siêu âm giảm đột ngột Sự hiện diện tiểu phân rắn làm giảm cường độ siêu âm Vì vậy, để tránh việc cản trở đường sóng siêu âm hay hình thành khối rắn, người ta thường khuấy lắc dung dịch Để đạt hiệu quả chiết xuất cao, chúng ta cần chú ý đến đặc điểm dược liệu (độ ẩm, kích thước tiểu phân) dung môi chiết xuất Thêm vào đó, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sóng siêu âm tần số, áp suất, nhiệt độ thời gian chiết xuất Tần số sóng siêu âm ảnh hưởng lớn đến khối lượng dịch chiết, phụ thuộc vào bản chất dược liệu Một thay đổi tần số nhỏ cũng có thể làm tăng khối lượng dịch chiết khoảng 32% trường hợp chiết Pyrethrine từ hoa Cúc với dung môi hexan rắn Tuy nhiên, chiết xuất dầu hạt Tùng Lam siêu âm lại có ảnh hưởng 1.1.5 Ứng dụng siêu âm phân tích: Trong hóa học phân tích, sóng siêu âm sử dụng công cụ gia tốc cho trình phân tích Do đó, sóng siêu âm giúp ích nhiều việc xử lý mẫu rắn Chẳng hạn, tạo điều kiện dễ dàng nhanh chóng việc chiết xuất hợp chấp hữu vô cơ, trình đồng hóa, khí dung hóa… Sóng siêu âm có thể làm tăng khối lượng chiết xuất Sharma Gupta (2004) tìm việc xử lí trước với sóng siêu âm đã mang lại khối lượng lớn chất dầu từ quả hạnh, quả mơ cám gạo Sản lượng dầu chiết xuất từ hạt đậu tương cũng tăng rõ rệt sử dụng siêu âm (Li cộng sự, 2004) Khi chiết saponin từ nhân sâm siêu âm, tổng lượng dịch chiết thu tăng 15% lượng saponin thu tăng 30% (Hui cộng sự, 1994) Sóng siêu âm còn làm tăng động học chiết xuất, nghĩa trình chiết xuất diễn nhanh hơn, chí còn cải thiện chất lượng dịch chiết Cravotto cộng (2004) đã việc chiết xuất dầu từ cám gạo thực hiện cách hiệu quả vòng 30 phút cường độ cao sóng siêu âm với dung môi hexan dung dịch kiềm Tốc độ chiết xuất Carvone Limonene siêu âm nhanh gấp 1,3 đến lần so với phương pháp cổ điển phụ thuộc nhiệt độ (Chemat cộng sự, 2004) Hơn nữa, khối lượng chất lượng Carvone chiết siêu âm cũng tốt Sóng siêu âm còn áp dụng kỹ thuật Soxhlet để chiết xuất chất béo từ hạt có dầu hướng dương, cải dầu đậu tương, thời gian chiết xuất giảm nửa so với phương pháp cổ điển mà thành phần dịch chiết không đổi (Luque-Garcia Luque de Castro, 2004) Wu cộng (2001) đã chiết xuất Saponin từ nhân sâm siêu âm, thời gian chiết xuất tăng gấp lần so với phương pháp Soxhlet cổ điển 1.1.6 Nhược điểm, ưu điểm chiết siêu âm: Ưu điểm:  Đơn giản, rẻ tiền hiệu quả cao phương pháp cổ điển  So với kỹ thuật khác chiết vi sóng chiết siêu âm rẻ tiền vận hành dễ dàng  Lợi ích việc sử dụng siêu âm chiết lỏng-rắn tăng khối lượng dịch chiết rút ngắn thời gian chiết  Hơn nữa, chiết siêu âm cũng giống chiết Soxhlet, có thể dùng dung môi để chiết xuất hợp chất thiên nhiên đa dạng  Giảm nhiệt độ áp suất chiết Chẳng hạn chiết xuất Pyrethrine từ hoa Cúc hexan rắn mà không sử dụng siêu âm, khối lượng dịch chiết tăng theo nhiệt độ chiết xuất khối lượng tối đa thu 66 oC Trong sử dụng sóng siêu âm, ảnh hưởng nhiệt độ khoảng 40 – 60 oC khối lượng dịch chiết không đáng kể Vì vậy, chiết siêu âm thích hợp với chất không chịu nhiệt độ cao chiết Soxhlet Tuy nhiên, sóng siêu âm cũng có thể sinh nhiệt, nên chúng ta phải chú ý điều chỉnh nhiệt độ chiết xuất cho phù hợp Thời gian chiết xuất cũng nên xem xét cẩn thận, vượt giới hạn cho phép có thể làm hỏng chất lượng dịch chiết Nhược điểm:  Tuy nhiên, ảnh hưởng siêu âm lên khối lượng dịch chiết có thể liên quan đến bản chất dược liệu  Sự hiện diện pha phân tán góp phần làm yếu sóng siêu âm hoạt động siêu âm bên máy chiết giới hạn vùng gần phận phát sóng Vì vậy, hai yếu tố cần xem xét kỹ lưỡng thiết kế máy chiết siêu âm 1.1.7 So sánh với phương pháp khác: Trong nhiều trường hợp, chiết xuất nhờ siêu âm lựa chọn hiệu quả, rẻ tiền, nhanh chóng kỹ thật chiết xuất cổ điển, vài trường hợp, còn cả phương pháp khác vi sóng hay dùng CO siêu tới hạn Tuy nhiên siêu âm có nhược điểm riêng cần cân nhắc trước sử dụng 1.1.7.1 Chiết siêu âm vi sóng: Ưu điểm chiết siêu âm so với vi sóng:  Đôi nhanh  Chiết siêu âm an toàn chiết vi sóng ta có sử dụng acid không đòi hỏi nhiệt độ hay áp suất cao  Quá trình vận hành đơn giản Nhược điểm chiết siêu âm so với vi sóng:  Sự thoái hóa bề mặt đầu dò theo thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất chiết  Kích thước hạt nhân tố định chiết siêu âm 1.7.1.2 Chiết siêu âm chất lỏng siêu tới hạn: Ưu điểm siêu âm so với so với chất lỏng siêu tới hạn:  Dụng cụ đơn giản chi phí tiêu hao thấp  Có thể áp dụng nhiều hợp chất, kể cả phân cực không phân cực, có thể sử dụng dung môi Trái lại, CO siêu tới hạn dùng để chiết xuất hợp chất không phân cực Nhược điểm siêu âm so với chất lỏng siêu tới hạn:  Trong vài trường hợp, chiết CO2 siêu tới hạn đơn giản nhanh  Không giống dung môi chiết siêu âm (cyclohexane, tetrahydrofuran, hỗn hợp dichloromethane acetone), CO2 siêu tới hạn không gây ô nhiễm môi trường  Chiết siêu tới hạn thường rõ ràng, xác có lẽ sử dụng bể chứa thay đầu dò chiết siêu âm 1.7.1.3 Chiết siêu âm Soxhlet: Ưu điểm siêu âm so với chiết Soxhlet:  Sự sủi bong bóng làm gia tăng phân cực hệ thống, bao gồm dung môi, chất phân tích chất nền, điều làm tăng hiệu quả chiết xuất  Có thể thêm chất hỗ trợ để tăng độ phân cực pha lỏng  Thích hợp với chất không chịu nhiệt, chất bị biến đổi chiết Soxhlet  Thời gian chiết xuất ngắn Nhược điểm siêu âm so với chiết Soxhlet:  Dung môi không thể làm suốt trình chiết xuất, hiệu lực hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly  Thời gian lọc rửa dịch chiết kéo dài, tốn nhiều dung môi, làm lượng dịch chiết dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn Trong chiết Soxhlet tốn lượng nhỏ dung môi 1.1.8 Trang thiết bị: Có hai thiết bị bản dùng phương pháp siêu âm bể nước đầu dò Mặc dù bể nước đã sử dụng rộng rãi chúng có hai bất lợi chủ yếu có thể làm giảm độ lặp lại độ chép thí nghiệm Thứ giảm lượng theo thời gian, lượng cung cấp cho bể nước lãng phí Đầu dò siêu âm có điểm thuận lợi bể nước tập trung lượng vùng cố định, mà trình sủi bong bóng diễn hiệu quả Thứ hai phân phối lượng siêu âm không đồng đều, có phần nhỏ thể tích chất lỏng tiếp xúc trực tiếp với nguồn lượng siêu âm xảy sủi bong bóng 1.1.9 Chiết siêu âm cải tiến: Người ta cải tiến khả xử lí mẫu cách chiết siêu âm liên tục Ưu điểm trình chiết tốn mẫu thuốc thử, hóa chất cần cho hòa tan liên quan đến tốc độ chiết xuất Sự hữu ích chiết siêu âm liên tục đã chứng minh việc chiết chất sắt nguyên liệu thực vật…Sự hình thành phức hợp sắt 1,10phenanthroline đã mang lại kết quả phù hợp với phương pháp cổ điển sử dụng phổ hấp thu nguyên tử sau xử lí acid nóng Thời gian chiết siêu âm liên tục có phút so với 40 phút phương pháp cổ điển mà kết quả tương tự Có hệ thống chiết siêu âm liên tục:  Hệ thống kín: dung môi có thể tích định chảy liên tục qua mẫu rắn Việc điều khiển dung môi có thể không đổi suốt trình chiết xuất thay đổi sau khoảng thời gian định cách lập trình sẵn Với cách này, dung môi tới lui qua mẫu, tránh kết hợp lại thành khối rắn mẫu gia tăng áp suất bên dung môi Việc sử dụng siêu âm chất lưu xung quanh nguyên nhân tạo hốc Các hốc dùng để hình thành phát triển bị đè bẹp mức vi bọt chất lỏng đánh sóng biến động áp suất Như vậy, So với chiết dung môi thông thường kĩ thuật chiết siêu âm mang lại hiệu quả cao nhanh đáng kể tác động sóng siêu âm lên cấu trúc mô dược liệu So sánh khác cấu trúc vi mô phúc bồn tử sau chiết xuất đã thực hiện nhờ kính hiển vi điện tử quét (SEE scanning electron microscopy) Để quan sát SEE mẫu phải chuẩn bị sau, sau chiết phương pháp thông thường siêu âm tùng mẫu thêm 2.5% glutaraldehyde 1% axit osmic (acid osmi, có tính chất ăn da tác nhân oxy hóa mạnh mẽ dễ bay hơi, dung dịch sử dụng chất nhuộm cho chất béo myelin dùng chất định hình cho kính hiển vi điện tử) 12 h, sau dehydrate dung dịch đệm ethanol với nồng độ lần lượt: 30%, 50%, 70%, 90%, 100% cho mỗi 15 phút Sau đó, mẫu đã làm khô tới điểm tới hạn, quan sát kính hiển vi điện tử quét Hitachi S-5000 Cấu trúc phúc bồn tử đỏ sau UAE đã lỏng lẻo so với sau chiết phương pháp thông thường Các hốc, tỏa nhiệt hoạt động học hình thành chiếu xạ sóng siêu âm nguyên nhân gây phá vỡ cấu trúc vật lý dược liệu, dẫn đến việc di chuyển trực tiếp thành phần Acys mong muốn vào dung môi xung quanh Trong trình chiết xuất thông thường dung môi nóng khuyếch tán chậm qua tế bào dược liệu hòa tan mang theo hoạt chất Từ so sánh cho thấy chiết UAE hiệu quả nhanh Hình chụp kính hiển vi điện tử quét sau chiết xuất phúc bồn tử đỏ a Phương pháp thông thường (rất tế bào bị phá cách đun nóng) b Chiết xuất với hổ trợ siêu âm (nhiều tế bào dược liệu bị phá sóng siêu âm) Mặt khác, phân tích HPLC-MS cũng cho thấy khác biệt đáng kể thành phần Acys chiết xuất từ UAE chiết xuất thông thường Điều đã chứng minh, trình UAE đã không làm giảm hàm lượng Acys, điều kiện tốt (năng lượng điện nhỏ thời gian chiết ngắn) UAE không làm giảm chức sinh học dịch chiết phúc bồn tử HPLC profile Anthocyanin chiết xuất UAE phương pháp thông thường 2.2 Phân lập xác định anthocyanin phúc bồn tử HPLC-MS: 2.2.1 Cách tiến hành: µ lit dung dịch mẫu Acys tinh khiết đã tiêm trực tiếp vào hệ thống HPLC-MS đã phân lập cách sử dụng cột KROMASIL C 18 (250mm x 4.6mm, µ m) cột bảo vệ (20 mm x 4.6 mm) phát hiện bước sóng 520 nm Pha động gồm, dung dịch rửa giải A acid formic : nước (3:97, v / v), dung dịch rửa giải B acid formic : nước : methanol (3:47:50, v/v) Một quy trình rửa giải theo gradient thực hiện sau: trước hết, sử dụng tỷ lệ 60% A 40% B phút, sau dung môi A giảm xuống 0% B tăng lên tới 100% vòng 40 phút, với tốc độ dòng chảy 0,8 ml / phút Còn đối vói thiết bị khối phổ ion hóa phun ion (ion trap electro-spray mass spectromecter) trang bị điện phun ion hóa electro-spray ionization (ESI) thiết bị phân tích khối lượng ion Khối phổ hoạt động chế độ ion dương khoảng 200-1000 m / z theo điều kiện sau đây: đầu dò điện trường 3,5 kV; điện áp mao quản, 3500V; nhiệt độ mao quản 250° C; làm khô 350°C khí nitơ với tốc độ dòng chảy 10 lít / phút 2.2.2 Kết thảo luận: HPLC pha đảo với đầu dò quang phổ phân tích MS sử dụng để nhanh chóng xác định anthocyanin dịch chiết phúc bồn tử Các anthocyanin phúc bồn tử chiết xuất UAE Peak 13,3 cyanidin-3-sophoroside; peak 14,3 cyanidin-3-(2 G glucosylrutinoside); peak 15,8 cyanidin-3-sambubioside; peak 16,1 cyanidin-3-glucoside; peak 16,6 cyanidin - - xylosylrutinoside; peak 17,4 cyanidin-3-(2G - glucosylrutinoside); peak 17,7 cyanidin-3-rutinoside; peak 21,5 pelargonidin-3-rutinoside, peak 25,2 min, 28,2 min, 35,7 min, 39,2 chưa xác định rỏ Khối lượng quang phổ phân mảnh mẫu đã thể hiện hình 5.Đối với Acys chuẩn sẵn, đã xác định cách so sánh thời gian lưu trọng lượng phân tử xác chúng ( xác định ES / MS) với tài liệu tham khảo nghiên cứu trước nhà nghiên cứu khác acys Các kết quả xác định đã thể hiện b ng sau Có 12 loại Acys chiết xuất tinh khiết Bảy loại Acys bao gồm cyanidin3-sophoroside, cyanidin-3-(2G-glucosylrutinoside), cyanidin-3-sambubioside cyanidin-3-rutinoside, cyanidin-3-xylosylrutinoside, cyanidin-3-(2G-glucosylrutinoside), cyanidin-3-rutinoside Năm loại Acys phụ, trong Acys xác định pelargonidin-3-rutinoside, còn lại không xác định cụ thể cấu trúc hóa học bốn loại anthocyanin còn lại, aglycone tương ứng chúng đã xác định pelargonin, petunidin, delphindin, malvidin Đỉnh thời gian lưu (t = 13.3 min), cyanidin-3 – sophoroside với khối lượng ion M+ m/z 610,9 mảnh ion m / z 286,7 mà tương ứng với cyanidin -324.2 phù hợp với sophoroside Đỉnh thời gian lưu (t = 14.3 min), với M+ m/z 757.0 đã xã định cyanidin-3-(2G-glucosylrutinoside) mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin m / z 610,8 có thể tương ứng với rhamnoglucoside Do -146 đã rhamnose -324 đã cho hai phân tử indican Đỉnh thời gian lưu (t = 15,8 min), với M+ m/z 580.8 đã xác định cyanidin-3-sambubioside mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin m / z 444.7, với -136.1 cho xyloside -158 cho indican khác Đỉnh thời gian lưu (t = 16,1 min), với M+ m/z 448.7 đã xác định cyanidin-3-sambubioside mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin m / z 444.7, với -136.1 cho xyloside -158 cho indican Đỉnh thời gian lưu (t = 16.6 min), với M+ m/z 726.8 đã xác định cyanidin-3-xylosylrutinoside mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin m / z 448.7, với – 162 cho glucoside - 278.1 cho hai phân tử indicans Đỉnh thời gian lưu (t = 17.4 min), với M+ m/z 740,9 đã xác định 3-(2glucosylrutinoside) mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin m / z 594.8, với -308.1 cho rutinoside -454.2 cho rutinoglucoside Đỉnh thời gian lưu (t = 17.7 min), với M+ m/z 594.8 đã xác định cyanidin-3-rutinoside mảnh ion m / z 286,7 tương ứng với cyanidin -308 cho rutinoside Đỉnh thời gian lưu (t = 21.5 min), với M+ m/z 578.8 đã xác định pelargonidin-3-rutinoside Mảnh ion m / z 270,7 cho pelargonidin -308 cho rutinoside Ngoài ra, còn bốn loại Acys, tức peak 9, 10, 11,12 đã tìm lần phúc bồn tử đỏ Những thông tin cấu trúc phân tử họ có thể đưa sau: Đỉnh thời gian lưu (t = 25.2 min), với M+ m/z 330,7, tương ứng với malvidin Và ion phụ m / z -266.1 có thể phân tử pentose với phân tử hexose deoxygenated Đỉnh 10 thời gian lưu (t = 28.2 min), với M+ m/z 542,8 mảnh ion m / z 302,7 tương ứng với delphindin Một mảnh ion khác m / z 432,6, với -240.2 cho hai phân tử pentose Đỉnh 11 thời gian lưu (t = 35.7 min), với M+ m/z 470,7 mảnh ion m / z 316,7 petunidin mảnh -154 có thể phân tử hexose Đỉnh 12 thời gian lưu (t = 39,2 min), với M+ m/z 753.1 mảnh ion m / z 267,5 có thể pelargonidin Một mảnh ion khác m / z 398,5, với -132 có thể lả giả thiết mảnh phân tử pentose Các thành phần Acys phúc bồn tử đỏ trình bày tương đối giống với nghiên cứu trước đây[13] Còn thành phần Acys tìm khác có thể đa dạng loài phúc bồn tử CHƯƠNG III: KẾT LUẬN Siêu âm có tiềm giúp tăng hiệu suất tiết kiệm thời gian để chiết xuất anthocyanin Kết quả thu nghiên cứu có thể ứng dụng chiết suất anthocyanin tự nhiên qui mô công nghiệp Điều kiện chiết suất siêu âm anthocyanin từ phúc bồn tử đã tối ưu hóa Khi kỹ thuật chiết xuất kiểm soát tỷ lệ hòa tan mẫu dung môi theo tỉ lệ 4/1 200s công suất máy 400W, lượng anthocyanin chiết xuất đạt 78.13%, loại anthocyanin xác định kỹ thuật HPLC-MS, cyanidin-3-sophoroside, cyanidin-3-(2-glucosylrutinoside), cyanidin-3- sambubioside, cyanidin-3-rutinoside loại thành phần Nghiên cứu đã chứng minh có khác biệt thành phần cấu tạo anthocyanin kỹ thuật chiết siêu âm kỹ thuật truyền thống, siêu âm không làm thay đổi cấu trúc hóa học anthocyanin thành phần cấu tạo điều kiện tối ưu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] The Yearbook of Science & the Future 1994; Encyclopaedia Britannica: Chicago, 1994; pp 138-155 [2] http://en.wikipedia.org/wiki/Rubus_idaeus [3] Bộ y tế 1998 – Bài giảng dược liệu 1, Đại học dược Hà Nội, Đại học y dược TPHCM [4] J.A Joseph, H.B Shukitt, N.A Denisova, D Bielinski, A Martin, J.J McEwen, P.C Bickford, J Neurosci (1999) 19 8114–8121 [5] H Wagnar (1985), in: Annual Proceedings of Phytochemical Society of Europe 25 409 [6] J Kong, L Chia, N Goh, T Chia, R Brouillard (2003) - Phytochem 64 923– 933 [7] J.Y.Wu,L.D.Lin,F.T.Chau (2001),Ultrason.Sonochem 347–352 [8] T Fuleki, F.J Francis, J Food Sci 33 (1968) 72–77 [9] T Fuleki, F.J Francis, J Food Sci 33 (1968) 266–274 [10] S.Koda, T.Kimura, T.Kondo, H.Mitome, Ultrason.Sonochem.10(3) (2003) 149–156 [11] M.M.Castellanos, D.Reyman, C.Sieiro, P.Calle, Ultrason Sonochem.8 (1) (2001) 17–22 [12] A.Vercet, P.Lopez, J.Burgos, Ultrasonics36 (2) (1998) 615–618 [13] W Mullen, J Mcginn, M.E.J Lean, M.R Maclean, P Gardner, G.G Duthie, T Yokota, A Crozier, J Agric Food Chem 50 (2002) 5191–5196 [14] Fang Chen, Yangzhao Sun, Guanghua Zhao, Xiaojun Liao, Xiaosong Hu, Jihong Wu, Zhengfu Wang (2006), “Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography–mass spectrometry” [...]... kiện chiết xuất siêu âm đã xác định rằng lượng anthocyanin toàn phần chiết xuất từ phúc bồn tử phụ thuộc rất lớn vào tỉ lệ dung môi:mẫu, thời gian chiết xuất, và năng lượng siêu âm, do đó một thiết kế mô hình phức hợp xoay quanh điểm trung tâm (CCRD) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất siêu âm và kiểm tra nhanh ảnh hưởng của 3 biến số trên chiết xuất anthocyanin toàn phần từ phúc bồn tử... và năng lượng siêu âm đóng vai trò nổi bật trong hiệu suất chiết anthocyanin từ phúc bồn tử, liên quan đến việc gia tốc sự phá vỡ mô và xâm nhập của chất tan từ mô dưới ảnh hưởng của bọt khí sinh ra do sóng siêu âm 2.1.5 Kết quả chiết xuất: Tiến hành chiết xuất với những điều kiện tối ưu: - Tỉ lệ dung môi và dược liệu: 4:1(ml/g) Thời gian chiết xuất: 200s - Năng lượng siêu âm: 400W Ta thu... bình được chọn dựa vào khả năng hòa tan của mẫu trong dung dịch chiết xuất) - Bình được ngâm vào bể nước lạnh có kích thước 250 x 240 x 150mm trong buồng siêu âm với nguồn phát sóng siêu âm có công suất 650W, đường kính đầu phát siêu âm 8mm được đặt vào bể ở vị trí ½ chiều cao bể, tần số phát siêu âm 22kHz Nhiệt độ được duy trì dưới 400C bằng cách thay thế nước trong bể bằng nước lạnh (15... đã được dự đoán trước Sự tối ưu hóa điều kiện chiết xuất siêu âm bao gồm từ việc phân tích sơ bộ tương ứng như sau: thời gian chiết xuất 200s, năng lượng siêu âm 400W và tỉ lệ dung môi:mẫu là 4/1 Dưới những điều kiện này, giá trị anthocyanin toàn phần thực nghiệm (34.5mg/100g) gần với giá trị dự đoán ban đầu (35.3mg/100g) tính toán từ đa thức tương ứng kiểu công thức đã cho Do đó, CCRD... thể là do sự đa dạng của các loài phúc bồn tử CHƯƠNG III: KẾT LUẬN Siêu âm có tiềm năng giúp tăng hiệu suất và tiết kiệm thời gian để chiết xuất các anthocyanin Kết quả thu được trong nghiên cứu có thể ứng dụng chiết suất anthocyanin tự nhiên ở qui mô công nghiệp Điều kiện chiết suất siêu âm của các anthocyanin từ phúc bồn tử đã được tối ưu hóa Khi kỹ thuật chiết xuất được kiểm... siêu âm và năng lượng siêu âm có ảnh hưởng quan trọng trong chiết xuất các anthocyanin Ngược lại, sự tương tác giữa tỉ lệ dung môi:mẫu và thời gian chiết xuất (X1X3), tỉ lệ giữa dung môi:mẫu và năng lượng siêu âm (X 1X2) và năng lượng siêu âm với thời gian chiết xuất (X 2X3), giới hạn phương trình bậc hai của năng lượng siêu âm ( X 22 ) không có ý nghĩa Trong khi đó, các mô hình trọn vẹn bao gồm mức... hệ thống chiết siêu âm liên tục LC, leaching carrier; PP, bơm nhu động; UP, đầu dò siêu âm; EC, bình chiết; WB, bồn nước; W, chất thải; SV, van chọn lọc; EX, dịch chiết; E, dung môi rửa giải; IV, van tiêm; SPC, cột pha rắn; DR, derivatization reagent; RC reaction coil; D, detector 1.2 1.2.1 - Tổng quan về phúc bồn tử: Phúc bồn tử: Tên khoa học: Rubus idaeus L Tên khác: Mâm xôi đỏ Họ: Hoa... đoán hiệu suất chiết xuất các anthocyanin từ quả phúc bồn tử bằng kỹ thuật chiết siêu âm Ngoài ra, khi một trong những yếu tố đã được điều chỉnh đến giá trị tối ưu từ thực nghiệm CCRD thì ảnh hưởng của các yếu tố khác được trình bày bởi biểu đồ đường viền tối ưu Biểu đồ đường viền tối ưu xác định cho chúng ta thấy việc tăng giá trị năng lượng siêu âm và thời gian chiết xuất sẽ mang... hydroxyl làm phân hủy hóa học[11] [12], và nó là một sản phẩm cản trở trong nghiên cứu bởi vì sẽ làm giảm hiệu suất chiết anthocyanin được quy cho sự phân hủy anthocyanin liên quan đến sản sinh gốc tự do khi dùng siêu âm có năng lượng lớn trong thời gian dài, chúng ta cần nghiên cứu kỹ hơn để xác định cơ chế Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi:mẫu và thời gian chiết xuất đến hàm lượng anthocyanin. .. có từ 3 đến 5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn và có cuống dài hơn so với các lá chét còn lại Cụm hoa hình chùm, nhiều nhị, nhiều lá noãn đỏ, khi chín tạo thành quả kép có mảu đỏ tươi, vị chua, ăn được 1.2.1.2 Phân bố sinh thái: Rubus idaeus phân bố rộng khắp ở các khu rừng Châu Âu Hiện nay được trồng nhiều ở một số tỉnh Trung Quốc Ở Việt Nam, có một số loài như Rubus alceaefolius, Rubus