3.2.1. Tinh chế bƣớc 1 - Loại tạp chất bằng nƣớc sữa vôi 3.2.1.1. Kết tủa tạp chất bằng nƣớc sữa vôi
Một số nghiên cứu sử dụng vôi bột hay nước vôi trong để loại tạp trong dịch chiết nước cỏ ngọt cho kết quả tương đối tốt, có thể loại được một số tạp chất tan
trong nước như: gôm, chất nhầy, pectin và một số ion kim loại nặng… [7], [12], [22], [28], [29].
Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng, nếu sử dụng vôi bột thì khó kiểm soát được pH của dịch chiết do vôi bột ít tan; còn nếu sử dụng nước vôi trong thì thể tích của dịch chiết sẽ tăng lên đáng kể, gây khó khăn cho quá trình cô loại bỏ dung môi. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng loại tạp trong dịch chiết nước cỏ ngọt bằng nước sữa vôi nhằm mục đích khắc phục những hạn chế trên.
Nguyên tắc:
Dịch chiết thu được sau giai đoạn chiết xuất được cô đặc đến ½ dịch chiết ban đầu, điều chỉnh đến pH = 9 – 10 bằng nước sữa vôi, tạp chất (gôm, chất nhầy, pectin và một số kim loại nặng,…) sẽ tủa rồi được lọc loại đi. Khả năng loại tạp của nước sữa vôi được đánh giá qua khối lượng tạp kết tủa và chất lượng dịch chiết.
Tiến hành:
Gộp các dịch chiết nước lần 1 và lần 2 đã thu được sau giai đoạn chiết xuất, cô đặc bằng máy cất quay Buchi (60 ) đến khi thể tích dịch chiết còn 1 L. Sau đó thêm dần nước sữa vôi 10% vào dịch chiết đã cô đặc, chỉnh pH = 9 – 10, kết hợp khuấy nhẹ trong vòng 1 giờ ở 50 . Sau đó làm lạnh môi trường xung quanh ở 0 – 5 . Hỗn dịch thu được đem lọc qua phễu Buchner để loại bỏ tủa. Cân khối lượng tủa. Tủa và dịch lọc được kiểm tra bằng SKLM.
Kết quả:
Sau khi cho nước sữa vôi vào dịch chiết, một lượng lớn tạp chất đã được kết tủa và được loại đi dễ dàng bằng phễu lọc Buchner (Kết quả kiểm tra bằng SKLM không thấy sự xuất hiện của hoạt chất): Cụ thể là khi thêm khoảng 37,5 g nước sữa vôi vào dịch chiết thì loại được khoảng 133,5 g tạp (chưa sấy).
Hình 3.2. Hình ảnh SKLM dịch chiết cỏ ngọt sau loại tạp bằng nước sữa vôi
T: Dịch chiết cỏ ngọt ban đầu.
S: Dịch chiết cỏ ngọt sau khi loại tạp bằng nước sữa vôi.
Nhận xét:
Từ sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy vết tạp chất ở bên dưới vết hoạt chất trong dịch lọc sau bước loại tạp bằng nước sữa vôi mờ đi nhiều so với vết tạp chất trong dịch chiết ban đầu, kết hợp với lượng tạp được loại đi tương đối nhiều chứng tỏ nước sữa vôi đã loại được một lượng tương đối tạp chất.
Kết luận:
Bước loại tạp chất bằng nước vôi là khá hiệu quả và cần thiết trong quá trình
tinh chế. Nhưng lượng tạp chất trong dịch chiết vẫn chưa được loại triệt để. Ngoài ra, dịch chiết còn lẫn thêm ion Ca2+. Vì vậy cần dùng tác nhân acid để trung hòa và loại ion Ca2+.
3.2.1.2. Trung hòa dịch chiết
Một số nghiên cứu dùng tác nhân acid citric và acid phosphoric để trung hòa dịch chiết cỏ ngọt sau khi loại tạp chất bằng nước vôi khá là hiệu quả [12], [29]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát để so sánh 2 tác nhân này.
Tiến hành:
Lượng dịch lọc sau bước loại tạp bằng nước vôi được chia làm 2 phần bằng nhau (khoảng 500 ml/phần). Sau đó, tiến hành trung hòa 2 phần dịch chiết bằng 2 acid (acid citric, acid phosphoric) như sau:
Nhỏ từ từ dung dịch acid vào dịch chiết, chỉnh pH = 6 – 7, kết hợp khuấy nhẹ trong vòng 30 phút ở 50 . Dịch chiết được cô (60 ) loại dung môi đến khi không còn tủa xuất hiện (200 ml), lọc nóng qua phễu Buchner để loại bỏ tạp (nếu xuất hiện tủa), rửa tủa bằng 10 ml nước cất. Tủa và dịch lọc được kiểm tra bằng SKLM.
Kết quả:
Bảng 3.2. Đặc điểm của 2 phương pháp trung hòa
Chỉ tiêu so sánh Trung hòa với acid
citric Trung hòa với acid phosphoric
Có tủa xuất hiện Có Có
Lượng tủa Nhiều Ít
Tính chất tủa Xốp Nhớt
Thao tác loại tủa Dễ lọc Khó lọc
Kết quả kiểm tra SKLM cho thấy: Tủa không lẫn hoạt chất, dịch lọc thu được ở 2 phương pháp không nhận thấy sự khác biệt.
Nhận xét:
Dựa vào kết quả bảng 3.2 cho thấy: Bước trung hòa dịch chiết cỏ ngọt bằng acid là cần thiết để loại một số tạp chất như ion Ca2+. Tác nhân trung hòa là acid citric có khả năng tạo phức hoặc muối khó tan với nhiều ion kim loại và hợp chất khác. Sử dụng acid citric ưu điểm hơn acid phosphoric: thao tác thực hiện đơn giản hơn. Vì vậy, từ các quy trình sau chúng tôi sử dụng acid citric.
3.2.2. Tinh chế bƣớc 2
Sau bước loại tạp chất bằng nước vôi, dịch chiết cỏ ngọt vẫn còn khá nhiều tạp, vì vậy phải tiếp tục tinh chế để loại tạp. Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi nhận thấy hai phương pháp được sử dụng nhiều là phương pháp tinh chế sử dụng
nhựa trao đổi ion [12], [30], [32] và phương pháp sử dụng n-butanol [7], [8], [10], [28], [29]. Vì vậy, chúng tôi định hướng sử dụng một trong 2 phương pháp này. Các thí nghiệm sau đây nhằm so sánh hiệu quả của 2 phương pháp về mức độ phức tạp của thao tác, hiệu suất chiết và hiệu quả kinh tế.
Chuẩn bị dịch cỏ ngọt để tinh chế theo 2 phương pháp
Cân khoảng 500 g bột dược liệu đã xay nhỏ cho vào bình chiết, chiết bằng nước ở 60 (2 lần 3 giờ, với lượng dung môi tương ứng là 3,5 L; 2,5 L). Gộp các dịch chiết nước đã thu được, cô cất quay (60 để loại bớt dung môi đến còn ½ thể tích ban đầu. Sau đó thêm dần nước sữa vôi 10% vào dịch chiết, chỉnh pH = 9 – 10, kết hợp khuấy trộn nhẹ trong vòng 1 giờ ở 50 . Làm lạnh môi trường xung quanh ở 0 – 5 . Hỗn dịch thu được đem lọc qua phễu Buchner để loại bỏ tủa, rửa tủa bằng 100ml nước cất. Sau đó, trung hòa dịch chiết bằng cách nhỏ từ từ dung dịch acid citric vào dịch chiết, chỉnh pH = 6 – 7, kết hợp khuấy trộn nhẹ trong vòng 30 phút ở 50 . Cô loại dung môi đến khi không còn tủa xuất hiện ở 60 . Lọc loại tạp qua phễu Buchner, rửa tủa với 50ml nước cất.
Dịch lọc thu được chia làm 2 phần bằng nhau để tinh chế theo 2 phương pháp: sử dụng nhựa trao đổi ion và n-butanol.
3.2.2.1. Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion
Một số nghiên cứu sử dụng nhựa trao đổi ion để tinh chế trong quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt đều bắt đầu từ bước sau khi trung hòa dịch chiết [12], [30], [32]. Tuy nhiên, nhựa trao đổi ion có giá thành tương đối cao; mặt khác chúng tôi nhận thấy rằng ethanol có khả năng loại một số tạp muối trong dịch chiết nước dược liệu [2]. Vì vậy, để giảm lượng nhựa trao đổi ion sử dụng chúng tôi tiến hành loại tạp bằng ethanol 96 trước khi tinh chế bằng nhựa trao đổi ion.
Nguyên tắc:
Dịch chiết sau khi trung hòa được cô đặc đến thể tích nhất định, thêm 2-3 lần thể tích ethanol 96 , khuấy trộn đều, để lắng qua đêm sau đó gạn lọc. Cất thu hồi ethanol, sau đó cho cao lỏng dược liệu (trong nước cất 2 lần) lần lượt qua cột đã được nhồi hạt nhựa trao đổi ion (cationit, anionit). Rửa giải cột hấp phụ bằng nước
cất 2 lần đến khi dịch rửa giải không còn hoạt chất (kiểm tra các phân đoạn dịch rửa giải bằng SKLM). Gộp dịch rửa giải và cất loại dung môi thu được cắn. Cắn này đem kết tinh trong methanol.
Tiến hành:
Loại tạp bằng ethanol:
Dịch lọc phần 1 (sau bước trung hòa bằng acid citric) được cô cất quay đến khoảng 125 ml, thêm 2-3 lần ethanol 96 , khuấy trộn đều cho đến khi cao đặc tan hết, để lắng chỗ mát qua đêm. Tạp được loại qua phễu Buchner, rửa tủa với 20 ml ethanol 96 . Thu dịch lọc rồi cất thu hồi dung môi. Sau đó, hòa tan cao dược liệu trong 200 ml nước cất 2 lần để chuẩn bị cho chạy cột nhựa trao đổi ion.
Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion:
- Chuẩn bị cột nhựa hấp phụ (tiến hành với 2 loại nhựa: cationit và anionit):
Cân khoảng 40 g nhựa, rửa sạch bằng nước cất 2 lần để loại bỏ chất bảo quản và vớt bỏ những hạt nhựa bị nổi. Sau đó nhồi hạt vào cột chạy sắc ký. Rửa lại cột bằng 200 ml nước cất để ổn định cột và loại bỏ hoàn toàn chất bảo quản.
- Đưa dịch chiết nước cỏ ngọt đã xử lý lần lượt lên 2 cột nhựa đã chuẩn bị với
tốc độ 3 ml/phút (đầu tiên cho qua cột nhồi hạt cationit, sau đó cho qua cột nhồi hạt anionit).
- Rửa giải cột (đối với mỗi cột):
Rửa giải cột bằng nước cất 2 lần với tốc độ rửa giải 3 ml/phút đến khi dịch rửa giải không còn hoạt chất. Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM.
Gộp các dịch rửa giải và cất loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được cắn. Hòa tan nóng cắn thu được trong methanol (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích methanol = ¼). Rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh ở nhiệt độ 0-5ºC. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng 1ml methanol lạnh và đem sấy, cân khối lượng. Kiểm tra sơ bộ bằng SKLM.
Kết quả:
Sau bước loại tạp bằng ethanol:
Lượng tạp chất kết tủa trong cồn tương đối lớn (kết quả SKLM cho thấy không lẫn hoạt chất) và được loại bỏ dễ dàng bằng cách lọc qua phễu Buchner. Từ kết quả đó, ta thấy rằng sử dụng ethanol để loại tạp khá hiệu quả và cần thiết.
Sau bước tinh chế bằng nhựa trao đổi ion:
Hình 3.3. Cột nhựa trao đổi ion sau rửa giải
Hình 3.4. Hình ảnh SKLM dịch rửa giải qua 2 cột nhựa trao đổi ion
(Chú thích hình 3.4: A: tương ứng là dịch trước khi rửa giải. B, C: lần lượt tương ứng là dịch rửa giải qua 2 cột nhựa cationit, anionit).
Nhận xét:
Qua hình 3.3 ta thấy sau khi 2 cột nhựa trao đổi ion được rửa giải, hạt anionit có màu đậm lên, còn hạt cationit hầu như không thay đổi. Dịch rửa giải qua 2 cột nhựa trao đổi ion cũng thay đổi về màu sắc, cụ thể: dịch rửa giải thu được ở cột cationit không thấy sự thay đổi rõ rệt về màu sắc, còn dịch rửa giải thu được ở cột nhồi hạt anionit có màu nhạt đi nhiều so với dịch trước rửa giải. Qua đó, chúng tôi dự đoán rằng hạt anionid có khả năng lưu giữ các tạp anion và một số tạp màu.
Từ hình 3.4. cho thấy: Vết tạp chất dưới vết hoạt chất trong dịch rửa giải qua cột cationit có màu nhạt đi không đáng kể so với vết tạp trong dịch trước rửa giải. Còn vết tạp chất trong dịch rửa giải qua cột anionit có màu nhạt đi nhiều hơn chứng tỏ hạt anionit lưu giữ tạp chất tốt hơn hạt cationit. Tuy nhiên, vết tạp trong dịch thu được sau khi rửa giải qua 2 cột nhựa trao đổi ion mờ đi không nhiều, vẫn còn vết tạp chất ở cả 2 phía so với vết hoạt chất. Điều đó cho thấy, nhựa trao đổi ion không thực sự hiệu quả trong việc loại tạp chất trong dịch chiết cỏ ngọt.
3.2.2.2. Tinh chế bằng n-butanol bão hòa nƣớc
Glycosid ít tan trong n-butanol, tan nhiều hơn trong nước. Do đó, nếu sử dụng n-butanol khan [7], [8], [28], [29] để chiết glycosid sang pha n-butanol từ cao đặc cỏ ngọt hay chiết glycosid sang pha n-butanol bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng [6] sẽ làm hàm lượng glycosid phân bố sang pha n-butanol thấp hay hiệu suất chiết không cao. Để khắc phục hiện tượng này, chúng tôi tiến hành tinh chế glycosid bằng n-butanol bão hòa nước.
Tiến hành:
Dịch lọc phần 2 (sau khi trung hòa bằng acid citric) được cô bằng máy cất quay Buchi ở 60 đến khối lượng không đổi.
Đun hồi lưu cao thu được với dung dịch n-butanol bão hòa nước (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích dung môi = 1/10) trong 3 giờ 2 lần.
Sau đó lọc lấy dịch n-butanol, loại nước bằng Na2SO4 khan, rồi cô thu hồi dung môi ở 60 đến khối lượng không đổi thu được cắn.
Hòa tan cắn trong 150 ml methanol rồi để kết tinh qua đêm ở 0-5 . Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng 1 ml methanol lạnh rồi đem sấy, cân khối lượng. Kiểm tra sơ bộ bằng SKLM.
Kết quả và nhận xét
Từ hình 3.5 cho thấy dịch n-butanol thu được khá sạch (trên sắc ký đồ, vết tạp bên dưới vết hoạt chất hầu như không còn, chỉ còn vết tạp bên trên vết hoạt chất), chứng tỏ sử dụng n-butanol bão hòa nước để chiết glycosid là khá hiệu quả.
Bảng 3.3. Đặc điểm của 2 phương pháp tinh chế glycosid: sử dụng nhựa trao đổi ion và sử dụng n-butanol bão hòa nước
Các chỉ tiêu so sánh Phương pháp sử dụng
nhựa trao đổi ion
Phương pháp sử dụng n- butanol bão hòa nước
Đặc điểm phương pháp Chi phí cao, tiến hành
phức tạp
Chi phí thấp, tiến hành đơn giản
Thời gian kết tinh 7 ngày 2 ngày
Khối lượng tinh thể
glycosid thu được 1,96g 3,07g
Hình 3.5. Hình ảnh SKLM của dịch n-butanol
T: Dịch trước khi tinh chế bằng n-butanol. S: Dịch n-butanol.
Hình 3.6. Hình ảnh SKLM của 2 sản phẩm thu được từ 2 phương pháp tinh chế
1: Sản phẩm từ phương pháp sử dụng nhựa trao đổi ion. 2: Sản phẩm từ phương pháp sử dụng n-butanol.
Từ kết quả ở bảng 3.3 ta thấy phương pháp tinh chế sử dụng nhựa trao đổi ion kém hiệu quả hơn nhiều so với sử dụng dung môi chiết là n-butanol, cụ thể: phương pháp sử dụng nhựa trao đổi ion tiến hành phức tạp, chi phí cao và dịch rửa giải cuối cùng còn lẫn nhiều tạp đó là nguyên nhân làm thời gian kết tinh kéo dài, lượng sản phẩm không cao. Mặt khác, từ sắc ký đồ hình 3.6 cho thấy, sản phẩm kết tinh được qua 2 phương pháp đều là một hỗn hợp gồm các steviol glycosid (trong đó steviosid chiếm tỷ lệ cao nhất, rồi đến rebaudiosid A), tuy nhiên chất lượng sản phẩm thu được từ phương pháp sử dụng n-butanol tốt hơn (sản phẩm ít tạp hơn), phương pháp tiến hành đơn giản, chi phí thấp. Do đó, từ các quy trình sau chúng tôi sẽ tinh chế bằng phương pháp sử dụng n-butanol.
Vậy từ kết quả khảo sát các bước trong quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt được trình bày ở trên (từ mục 3.1 đến 3.2.2.2). Chúng tôi đã chiết xuất và kết tinh được glycosid từ lá cỏ ngọt bằng phương pháp không yêu cầu thiết bị phức tạp, dễ thao tác, chi phí thấp, không cần sử dụng nhựa trao đổi ion như trong các nghiên cứu khác. Tuy nhiên vẫn sử dụng n-butanol, methanol là những dung môi độc hại.
Quy trình chiết xuất và tinh chế glycosid từ lá cỏ ngọt
Quy trình gồm các bước như sau:
- Giai đoạn chiết xuất: Chiết bột lá cỏ ngọt bằng phương pháp ngâm nóng phân đoạn với dung môi là nước, ở 60 , thời gian chiết 3 giờ/lần, chiết 2 lần với tỷ lệ khối lượng dược liệu/dung môi = 1/7.
- Giai đoạn tinh chế và thu sản phẩm:
Bước 1: Loại tạp bằng nước sữa vôi (pH = 9-10). Sau đó trung hòa và loại
tạp bằng acid citric (pH = 7).
Bước 2: Tinh chế bằng phương pháp sử dụng n-butanol bão hòa nước.
Bước 3: Kết tinh cắn thu được sau khi cất thu hồi n-butanol trong methanol.
Mô tả quy trình:
Cân khoảng 250 g bột dược liệu đã xay nhỏ cho vào bình chiết, chiết bằng nước cất ở 60 (2 lần 3 giờ, với lượng dung môi tương ứng là 1,7 L và 1 L).
Gộp các dịch chiết nước lần 1 và lần 2 đã thu được, cô đặc bằng máy cất quay Buchi (60 ) đến khi thể tích dịch chiết còn 1 L. Sau đó thêm dần nước sữa vôi 10% vào dịch chiết đã cô đặc, chỉnh pH = 9 – 10, kết hợp khuấy nhẹ trong vòng 1 giờ ở 50 . Sau đó làm lạnh môi trường xung quanh ở 0 – 5 . Hỗn dịch thu được đem lọc qua phễu Buchner để loại bỏ tủa. Sau đó, dịch lọc được trung hòa bằng