Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- TRẦN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU

THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes)

NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, 2015

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AST Serum aspartat transaminase

ALT Serum alanin transaminase

Collection

Ngân hàng chủng giống Mỹ

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

COSY Correlation Spectroscopy Phổ COSY

CS% Cell survival % % tế bào sống sót

DEPT Distortionless Enhancement by

DMSO Dimethyl sulfoxid Dimetyl sulfoxit

EAC Ehrlich ascites Carcinoma Ung thư cổ trướng

ECACC The European Collection of Cell

Cultures

Ngân hàng chủng giống châu

Âu ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spectra

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

FBS Foetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò

Fl Human cervical uterine carcinoma Tế bào Ung thư tử cung

γGT Serum gamma glutanin

HPLC High Performance liquid

PBS Phosphat buffer saline Dung dịch đệm phosphat

RD Human Rhabdomyosarcoma Ung thư mô liên kết

SC% % scavenging capacity % khả năng trung hòa gốc tự

do

SRB Sulforhodamine B

TCA Trichloacetic acid Axit tricloaxetic

TCL Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm dược liệu 3

1.1.2 Ứng dụng trong y học dân tộc 4

1.2 Những nghiên cứu trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học của nấm dược liệu 6

1.2.1 Các hợp chất có phân tử lượng nhỏ 6

1.2.1.2 Các chất có hoạt tính sinh học khác 11

1.2.2 Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu 19

1.3 Tình hình nghiên cứu về nấm hầu thủ và nấm hương 30

1.3.1 Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) 30

1.3.1.1 Trên thế giới 30

1.3.1.2 Ở Việt Nam 34

1.3.2 Nấm hương (Lentinus edodes) 35

1.3.2.1 Trên thế giới 36

1.3.2.2 Ở Việt Nam 40

1.4 Mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ba chiều (3D) trong nghiên cứu ung thư 41

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Đối tượng nghiên cứu 44

2.1.1 Nấm hương 44

2.1.2 Nấm hầu thủ 44

2.2 Dụng cụ, hóa chất và môi trường 44

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 44

2.2.2 Môi trường 44

2.3 Các phương pháp phân lập các hợp chất 45

2.4 Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ 46

2.4.1 Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương 46

2.4.2 Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ 46

2.5 Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học 46

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide 46

2.7 Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3-glucanase 47

2.8 Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan 47

2.9 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 48

2.9.1 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) 48

2.9.2 Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro 50

2.10 Các phương pháp thử dược lý 51

2.10.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp 51

2.10.2 Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn 51

2.10.3 Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm 52

2.10.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid 52

2.10.3.2 Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn 52

2.10.3.3 Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm 52

2.10.3.4 Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm 52

2.10.4 Xử lý số liệu 52

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 53

3.1 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương 53

3.1.1 Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương 53

3.1.2 Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương 55 3.1.3 Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hương 55

3.1.4 Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương (sơ đồ 3.3) 56

3.2 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ 57

3.2.1 Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ (sơ đồ 3.4) 57

3.2.2 Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ 60

3.2.3 Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hầu thủ 60 3.2.4 Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ 61

3.2.5 Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzyme  -1,3-glucanase 62

3.2.6 Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin 64

3.3 Tạo chế phẩm thử nghiệm 66

3.4 Thử dược lý chế phẩm 66

3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp 66

3.4.3 Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm ………68

3.4.4 Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm HG2….……… 70

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73

4.1 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương 73

4.1.1 Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học 73

4.1.2 Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3 76

4.1.2.1 Hợp chất NH1: galactiol 76

4.1.2.2 Hợp chất NH-2: Ergosterol 80

4.1.2.3 Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide 84

4.1.2.4 Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan (lentinan) 88

4.1.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương 89

4.2 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ 92

4.2.1 Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư 92

4.2.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ 94

4.2.2.1 Hợp chất HT1: axit stearic 94

4.2.2.2 Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide 97

4.2.2.3 Hợp chất HT3 - Cerebroside B 99

4.2.2.4 Hợp chất HT4 - Hericenone D 104

4.2.2.5 Hợp chất HT5 - Ergosterol 110

4.2.2.6 Hợp chất HT6 - β-Adenosine 112

4.2.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ 118

4.3 Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn và đánh giá hoạt tính của chúng 121

4.3.1 Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase 122

4.3.2 Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin 124

4.4 Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm 128

4.4.1 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống của chế phẩm HG1 128

4.4.2 Độc tính bán trường diễn của sản phẩm HG1 khi cho uống trên động vật thực nghiệm 129

4.4.2.1 Ảnh hưởng của HG1, cho CNT uống trường diễn đối với khối lượng gan, lách, thận động vật 130

4.4.2.2 Kết quả nghiên cứu trọng lượng cơ thể CNT, khối lượng gan, lách, thận và tỷ số giữa khối lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể 131

4.4.2.3 Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu huyết học trên động vật thực nghiệm 132

4.4.2.4 Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số hóa sinh động vật khi cho uống bán trường diễn 133

4.4.2.5 Ảnh hưởng của sản phẩm dùng uống 6 tuần đến chức năng tim thỏ được đo điện tim 134

4.4.2.6 Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số mô bệnh học khi dùng trường diễn 135

4.4.3 Kết quả nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 136

4.4.3.1 Tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm trên chuột nhắt được gây độc gan

bằng carbon tetraclorid 136

4.4.3.2 Ảnh hưởng của sản phẩm uống bán trường diễn đến quá trình tổng hợp protein trên động vật thực nghiệm 137

4.4.3.3 Tác dụng trên hệ miễn dịch của sản phẩm 138

4.4.3.4 Kết quả đánh giá tỷ lệ sống/chết của CNT sau chiếu xạ dưới tác dụng của sản phẩm 139

4.4.3.5 Kết quả nghiên cứu tác dụng tên các dòng tế bào có chức năng miễn dịch 140

4.4.3.6 Kết quả nghiên cứu về phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu dưới tác dụng của sản phẩm 141

4.4.4 Thử nghiệm tác dụng của sản phẩm HG1 lên tế bào ung thư 144

4.4.4.1 Tác dụng của sản phẩm HG1 lên hồng cầu và tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vitro 144

4.4.4.2 Tác dụng của hỗn hợp HG1 lên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vivo 144

4.4.4.1 Tác dụng của chế phẩm HG1 lên khối tế bào ung thư Ehrlich in vivo 144

KẾT LUẬN 147

KIẾN NGHỊ 149

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 150

TÀI LIỆU THAM KHẢO 152

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh 5

Bảng 1.2 Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u 9

Bảng 1.3 Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu19 Bảng 1.4 Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide 28

Bảng 1.5 Giá trị y học và một số chất hoạt tính từ nấm hương 37

Bảng 3.1 Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzym -1,3-glucanase 63

Bảng 4.1 Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương 73

Bảng 4.2 Hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết của nấm hương 74

Bảng 4.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polysaccharide 74

Bảng 4.4 Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn 75

Bảng 4.5 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn 76

Bảng 4.6 Kết quả phổ 13 C- NMR của NH2 83

Bảng 4.7 Số liệu phổ NMR của hợp chất NH3 và hợp chất tham khảo 86

Bảng 4.8 So sánh phổ 13 C-NMR của lentinan và β-1,3/1,6 tinh sạch 89

Bảng 4.9 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương 90

Bảng 4.10 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan Hep-G2 trên thạch mềm của các hợp chất 91

Bảng 4.11 Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm hương 92

Bảng 4.12 Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn chiết tách từ nấm hầu thủ 93

Bảng 4.13 Hoạt tính kháng u trên thạch của các cặn chiết nấm hầu thủ 94

Bảng 4.14 Kết quả phổ NMR của HT3 103

Bảng 4.15 Kết quả phổ NMR của HT4 107

Bảng 4.16 Kết quả phổ NMR của HT6 113

Bảng 4.17 giá trị tín hiệu phổ 13 C-NMR của -1,3/1,6 glucan hầu thủ 118

Bảng 4.18 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ119Bảng 4.19 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 trên thạch mềm của các hợp chất 120Bảng 4.20 Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau 123Bảng 4.21 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β-1,3/1,6-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau 124Bảng 4.22 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các sản phẩm trên dòng tế bào HepG2 128Bảng 4.23 Độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống trên CNT 129Bảng 4.24 Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sản phẩm nghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩm trên chuột nhắt trắng 131Bảng 4.25 Kết quả nghiên cứu về trọng lượng cơ thể và khối lượng các tạng ở mức liều sản phẩm là 3,0 g/kg/24h trong 42 ngày 132Bảng 4.26 Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bán trường diễn với mức liều 3,0g/kg/24h 133Bảng 4.27 Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩm bán trường diễn liều 3,0 g/kg/24 giờ 133Bảng 4.28 Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều 3,0 g/kg TLCT tại các thời điểm (n=12) 134Bảng 4.29 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan, lách, thận khi uống sản phẩm bán trường diễn liều 3,0 g/kg/TLCT 135Bảng 4.30 Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGT ở các nhóm chuột nhắt nghiên cứu dưới tác dụng của sản phẩm 136Bảng 4.31 Kết quả định lượng khối lượng gan ở các nhóm chuột nhắt nghiên cứu137Bảng 4.32 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm uống liều 1,0 g/kg/TLCT đến lượng protein toàn phần (tính bằng g/L) ở huyết tương động vật thực nghiệm (n=12) 138

Bảng 4.33 Tác dụng của sản phẩm về tác dụng trên hệ miễn dịch ở động vật thực nghiệm dùng uống liều 1,0 g/kg TLCT/24h và 3,0 g/kg TLCT/24h trên các chỉ tiêu khối lượng các cơ quan miễn dịch 138Bảng 4.34 Tỷ lệ chuột nhắt sống sót sau chiếu xạ liều 7.0 Gy dưới tác dụng của sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT-CNT 139Bảng 4.35 Ảnh hưởng của sản phẩm đến kết quả định lượng các tế bào tủy, bạch cầu và quần thể coloni lách ở CNT 140Bảng 4.36 Ảnh hưởng của sản phẩm đến tỷ số thực bào và chỉ số thực bào 141Bảng 4.37 Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu trên CNT dưới tác dụng của HG1 liều 1,0 g/kg TLCT (chiếu xạ 7.0 Gy, sau đó uống sản phẩm) 141Bảng 4.38 Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên chuột nhắt dưới tác dụng của sản phẩm; uống sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT, sau đó được chiếu xạ 7,0 Gy 142Bảng 4.39 Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên CNT chiếu xạ 7,0 Gy không dùng sản phẩm 143Bảng 4.40 Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế bào ung thư Ehrlich ở chuột (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0.05) 145Bảng 4.41 Ảnh hưởng của HG1 lên chỉ số tăng tuổi thọ của chuột có khối tế bào ung thư Ehrlich Ước tính tuổi thọ trung bình được xác định sau 30 ngày kể từ khi bắt đầu thí nghiệm (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0,05) 145DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Hình 1.1: Kết nối các polymer trong thành tế bào nấm 21

Hình 1.2 cấu trúc hóa học điển hình của β1,3/1,6 glucan 22

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc của βglucan và sự chuyển đổi giữa chúng 24

Hình 1.4 Cấu trúc của lentinan 25

Hình 1.5 Cấu trúc β1,3/1,6 glucan của schizophyllan 26

Bảng 1.4 Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide 28

Hình 1.6 Mô hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân gây bệnh (Leung, 2006) [81] 29

Hình1.7 Tác dụng y học của nấm hương (Bisten et al 2010) 37

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương 54

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3 55

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương 57

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ 59

Sơ đồ 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất HT1 và HT2 60

Sơ đồ 3.6 Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ 62

Sơ đồ 3.7 Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ bằng emzyme 64

Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ và curcumin 65

Hình 4.1 Phổ 1 H-NMR của NH1 77

Hình 4.2 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH1 78

Hình 4.3 Phổ COSY của NH1 78

Hình 4.4 Phổ HMBC của NH1 79

Hình 4.5 Phổ ESI-MS của NH1 79

Hình 4.6 Cấu trúc hóa học hợp chất NH1 80

Hình 4.7 Phổ 13C-NMR của hợp chất NH2 80

Hình 4.8 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH2 81

Hình 4.9 Phổ 1 H-NMR của NH2 82

Hình 4.10 Cấu trúc hóa học của NH2 84

Hình 4.11 Phổ ESI-MS của NH3 84

Hình 4.12 Phổ 1

H-NMR của NH3 85

Hình 4.13 Phổ 13 C-NMR của NH3 86

Hình 4.14 Cấu trúc hóa học của NH3 87

Hình 4.15 Phổ 13C-NMR của NH-GL 88

Hình 4.16 Ức chế phát triển khối u tế bào Hep-G2 bởi các chất phân lập 91

Hình 4.17 Phổ 1 H-NMR của HT1 95

Hình 4.18 Phổ 13 C-NMR của HT1 95

Hình 4.19 Phổ ESI-MS của HT1 96

Hình 4.20 Cấu trúc hóa học của hợp chất HT1 97

Hình 4.21 Phổ ESI-MS của HT2 97

Hình 4.22 Phổ 13 C-NMR của HT2 98

Hình 4.23 Phổ 1 H-NMR của HT2 99

Hình 4.24 Cấu trúc hóa học của HT2 99

Hình 4.25 Phổ ESI-MS của HT3 100

Hình 4.26 Phổ 1 H-NMR của HT3 100

Hình 4.27 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT3 101

Hình 4.28 Phổ HMBC của HT3 102

Hình 4.29 Phổ HSQC của HT3 102

Hình 4.30 Cấu trúc hóa học của HT3 104

Hình 4.31 Phổ ESI-MS của HT4 105

Hình 4.32 Phổ 1H-NMR của HT4 105

Hình 4.33 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT4 106

Hình 4.34 Phổ HSQC của HT4 107

Hình 4.35 Phổ HMBC của HT4 109

Hình 4.36 Cấu trúc hóa học của HT4 109

Hình 4.37 Phổ 1 H-NMR của HT5 110

Hình 4.38 Phổ 13C-NMR của HT5 111

Hình 4.39 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT5 111

Hình 4.40 Cấu trúc hóa học của HT5 112

Hình 4.41 Phổ ESI-MS của HT6 112

Hình 4.42 Phổ 1 H-NMR của HT6 113

Hình 4.43 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT6 114

Hình 4.44 Phổ HSQC của HT6 114

Hình 4.45 Phổ HMBC của HT6 115

Hình 4.46 Cấu trúc hóa học của HT6 115

Hình 4.47 Phổ 13C-NMR của HT-GL 117

Hình 4.48 Ức chế phát triển khối u tế bào HepG2 bởi các chất phân lập 121

Hình 4.49 Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Mw phân đoạn HT-GL1, HT-GL2 và HT-GL3 sau khi ủ với enzyme và tách phân đoạn bằng EtOH 25, 40 và 70%.122 Hình 4.50 Phổ hấp thụ điện tử của Cur và Cur-Glu 126

Hình 4.51 Phổ huỳnh quang của Cur và Cur-Glu 126

Hình 4.52 Ảnh FESEM của Glu (a), Cur (b) và Cur-Glu (c,d) 127

Hình 4.53 Hình ảnh minh họa độ hòa tan của hỗn hợp Glu- Cur so sánh với Curcumin (độ tan của Glu-Cur (a) và Cur (b)) 127

Hình 4.54 Ảnh huỳnh quang của hạt Cur (a) và Cur-Glu (b) 127

MỞ ĐẦU

Hàng nghìn năm nay, nấm lớn (mushroom) đã được con người sử dụng làm thực phẩm và thuốc chữa bệnh Theo ước tính, trên thế giới có khoảng 140.000 loài nấm lớn, trong đó có 14.000 loài đã được biết và mô tả với 50%

có thể dùng làm thực phẩm Hơn 2.000 loài nấm là an toàn cho người và khoảng 700 loài có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược Vì vậy, nấm lớn là nguồn tài nguyên phong phú phục vụ cho phát triển các sản phẩm có giá trị cho ngành y và dược học Một số loài đang được sử dụng rộng rãi phải

kể đến nấm linh chi (Ganoderma lucidum), hầu thủ (Hericium erinaceus), nấm hương (Lentinula edodes), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm chân chim (Schizophyllum commune)…

Khoa học đã chứng minh rằng nấm dược liệu hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch do virus, chống viêm nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh (Wasser, 2002; Chang và cs., 2004) [167,29] Các hoạt chất trong nấm có thể là các phân tử nhỏ như

triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm linh chi G lucidum (Huie và cs., 2004) [60], các hericinone (8 loại) và erinacine của nấm hầu thủ H erinaceus (Arnone và

cs., 1994) [17], và hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ các chất phân tử lượng lớn như polysaccharide và glycoprotein Phần lớn các polysaccharide ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật …) mà không hây hại cơ thể chủ

Ở Việt Nam, nấm lớn đã được chú ý từ lâu Nấm có thể được thu hái từ

tự nhiên hoặc chủ động nuôi trồng Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây, nấm dược liệu được sử dụng nhằm

bổ sung nguồn dinh dưỡng, tăng cường sức khoẻ và hệ miễn dịch, điều trị hỗ trợ phòng và chống các bệnh hiểm nghèo

Với mục đích làm rõ hơn các hoạt chất có giá trị y học trong hỗ trợ điều trị ung thư của một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u

và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam” Trong khuôn khổ luận án,

chúng tôi tập trung nghiên những nội dung chủ yếu sau:

1 Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ quả thể nấm

2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm của các chất đã phân lập

3 Tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm

4 Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực nghiệm (hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục hồi chức năng gan của sản phẩm)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc

1.1.1 Giới thiệu về nấm dược liệu

Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn thức

ăn và dược liệu chữa bệnh Nấm lớn được hiểu là có quả thể rõ ràng xuất hiện

trên cây, trên hoặc dưới mặt đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái bằng tay (Chang và Miles, 1992) [28] Nấm lớn được sử dụng trong y dược gọi là

nấm dược liệu

Hiện nay việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu là nấm đảm (Basidiomycetes), vì nấm túi (Ascomycetes) thường khó nuôi trồng Nấm được con người sử dụng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị dược học của chúng Nấm cung cấp ít calor và chất béo nhưng rất giầu protein, chất xơ, vitamin và chất khoáng (Crisan và Sands, 1978) [40]

Các nấm có thể ăn được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức năng

như các loài thuộc chi Lentinula, Hericium, Grifola, Flammulina, Pleurotus,

Tremella… Một số nấm như linh chi (Ganoderrma lucidum), nấm vân chi

(Trametes versicolor) chỉ sử dụng làm thuốc bởi chúng có vị đắng và rất cứng

Hiện nay, khoảng hơn 200 loài nấm đã được thu hái và dùng cho chữa bệnh; 35 loài nấm được nuôi trồng cho mục đích thương mại, trong đó 20 loài được sản xuất ở qui mô công nghiệp làm thực phẩm và dược liệu (Chang, 1999) [27] Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới năm 1994 là 4909103 tấn

và tăng 6158103 tấn năm 1997 với giá trị ước tính 14 tỉ đô la Mỹ Sáu trong số

10 loài nấm được trồng nhiều nhất (chiếm tới 92% tổng sản lượng nấm) gồm:

Agaricus bisporus (nấm mỡ, chiếm 31.8%), Lentinus edodes (nấm hương,

25,4%), Pleurotus spp (thuộc nấm sò, 14,2%), Auricularia auricular (7,9%),

Flammulina velutipes (kim châm, 4,6%) và Volvariella volvaceae (nấm rơm,

7,9%) (Chang, 1999) [27]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm dược liệu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật nuôi trồng (Nguyễn Thị Chính, 2005 và 2011; Lê Minh Tuấn, 2009) [2,3,11] Nguyễn Thị Chính cũng là một trong những nhà khoa học đầu tiên ở Việt Nam thí điểm nuôi trồng nấm sò và nấm linh chi bằng phương pháp lên men dịch thể để sản xuất thực phẩm chức năng, nhưng không tách chiết lấy polysaccharide hay các thành phần có hoạt tính mà dùng sản phẩm hỗn hợp (Chính, 2005 và 2011) [2,3] Hoạt tính chống ung thư, tăng cường sức khỏe cho bệnh nhân mắc AIDS của polysaccharide từ nấm linh chi cũng được tác giả Nguyễn Thị Chính (2005) thử nghiệm [2] Tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng đã bước đầu nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi, nấm hầu thủ nuôi trồng ở Việt Nam và xác định hoạt tính chống oxy hoá của chúng [5] Nhóm nghiên cứu của chúng tôi (đứng đầu là PGS.TS Lê Mai Hương) là những người đi tiên phong trong nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam và đã đạt được những thành tựu đáng kể như tách chiết và sản xuất thực phẩm chức năng chứa β-glucan và một số hoạt chất từ nấm dược liệu

1.1.2 Ứng dụng trong y học dân tộc

Các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng nấm

để phòng và chữa một số bệnh, kéo dài tuổi thọ Những năm gần đây, thị trường Mỹ đã mở cửa để đón nhận những sản phẩm thuốc từ nấm dược liệu, đặc biệt nấm linh chi và nấm maitake Năm 1994 thế giới tiêu thụ nấm dược liệu và các sản phẩm từ nấm với ước tính tới 3,8 tỉ USD và tăng lên tới 6 tỉ năm

1999 với thị trường chính (chiếm tới 99%) là châu Á và châu Âu Các sản phẩm quan trọng từ nấm dược liệu thường có nguồn gốc từ các nấm

Ganoderma sp., L edodes, S commune, Tremella fusiformis, Trametes versicolor, Grifola frondosa, và gần đây là từ Phellinus sp (thượng hoàng) và Hericium erinaceus (hầu thủ) (bảng 1.1 - Wasser và Weis, 1999) [166]

Bảng 1.1 Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh [166]

Tremella fucifomis Berk + + + + + + X

Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd X X X X X

Piptoporus betulinus (bull.:Fr.) P

Karst

Hericium erinaceus (bull.:Fr.) Pers + X X X

Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Bond.et

Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst X X X X X X X X X X X X

Ganoderma applanatum (Pers.) Pat + + + +

Agaricomycetideae

Agaricales s.I

Pleurotaceae

Lentinus edodes (Berk.) Sing X X X X X X X X X X X

Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kumm + + + + +

Pleurotus pulmonarius (Fr.:Fr.) Quel + + +

Agaricus blazei Murr X

Agaricus bisporus (J.Lge) Imbach + X X

Pluteaceae

Volvariella volvacea (Bull.:Fr.) Sing + + + +

Bolbitiaceae

Agrocibe aegerita (Brit.) Sing + + + +

x: Sản phẩm nấm đã được thương mại (thuốc hay thực phẩm chức năng)

+: Sản phẩm nấm chưa được thương mại

1.2 Những nghiên cứu trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học của

nấm dược liệu

Nấm dược liệu đã thu hút các nhà nghiên cứu bởi hai lý do chính sau: (i) nấm có đặc tính chữa nhiều bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất ví dụ như ung thư, tiểu đường, tim mạch; (ii) nấm có thể được thu nhận từ thiên nhiên hoặc từ nuôi trồng (nuôi trồng rắn và lỏng) (Borches và cs., 2004) [21]

Các chất có hoạt tính trong nấm gồm polysaccharide, phức polysaccharide, glycoproteins (lectins), triterpenoid, tocopherol, glycoside, flavonoid, carotenoid, enzyme và các axit hữu cơ Sự có mặt của nhiều hợp chất khác nhau trong nấm làm cho chúng có các hoạt tính sinh học phong phú Trong số các hoạt tính dược lý của nấm, hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng ung thư là được quan tâm nhiều hơn cả

protein-1.2.1 Các hợp chất có phân tử lượng nhỏ

1.2.1.1 Các chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng u

Nhiều terpenoids có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Hela in

vitro đã được phát hiện ở nấm G.lucidum (linh chi), trong đó chủ yếu là các loại

ganodeic acid (Mizuno, 1995) [112] Các chất steroids gây độc tế bào ung thư

(hợp chất 1, 2 và 3) còn thấy ở nấm T versicolor (vân chi), nấm Agaricus

blazei (nấm thái dương, ABM); Các hợp chất phenolic là hericenone A (4) và B

(5) ức chế hoàn toàn tế bào ung thư Hela là tương ứng tại 100 và 6,3 µg/mL

Ngoài ra, axit béo (6) từ nấm H erinaceus (hầu thủ) và hợp chất lampterol (illudin-S) (7) ở nấm Lampteromyces japonicas cũng thể hiện hoạt tính với

dòng tế bào Hela (Mizuno, 1995) [112]

Han và cs (2004) [50] đã phân lập từ nấm Paecilomyces tenuipes (đông trùng hạ thảo tằm dâu) hoạt chất acetoxyscirpenediol thể hiện hoạt tính gây

chết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào máu bệnh bạch cầu Chất

lanostanoids từ G concinnum có tác dụng gây ra sự chết theo chương trình ở tế

bào HL-60 (Gonzalez và cs, 2002) [49] Các triterpenes applanoxidic acid A, B

(39,40), phân lập từ nấm G applanatum, có hoạt tính chống lại yếu tố thúc đẩy

ung thư da, trong đó applanoxidic acid B là hiệu quả nhất (Chairul và cs., 1991)

[25] Các dẫn xuất từ illudin S (7) hiện đang phát triển thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2 ở người (Murgo, 1999) [118] Ganoderic acid A (12) và C (14) từ

nấm linh chi là chất ức chế enzyme farnesyl protein transferase, chất ức chế tiềm năng này chứng tỏ chiến lược điều trị bệnh ung thư (Lee, 1998) [94] Ở

nấm Phellinus linteus (thượng hoàng) có chứa hoạt tính ức chế tạo mạch máu

khối u và ức chế enzyme có liên quan đến ung thư như kinase (Kim và cs.,

2004; Cho, 2002 [79,38] Chất sesquiterpenoid cryptoporic acids A (41) từ nấm

Cryptoporus volvatus ức chế sự phát triển khối u của okadaic acid (Hashimoto

Ganoderic acid U: R 1 =α-OH, R 2 =OH, R 3 =R 4 =H

Ganoderic acid V-Me: R 1 =O, R 2 =OH, R 3 =OAc, R 4 =CH 3

Ganosporeric acid W: R 1 =β-OH, R 2 =OH, R 3 =OAc, R 4 =H

Ganosporeric acid Z: R 1 =β-OH, R 2 =R 3 =R 4 =H

Ganosporeric acid X-Me: R 1 =α-OH, R 2 =H, R 3 =OAc, R 4 =CH 3

Ganosporeric acid Y: R 1 =β-OH, R 2 =R 3 =R 4 =H

35: leaianafulvene Lucidadiol (36): R=OH

Bảng 1.2 Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u (Ferreira và cs.,

(-L-glutaminyl-4-Ức chế DNA polymerase

(E)-2-(4-hydroxy-3-methyl-2-butenyl)-hydroquinone

Piptoporus betulinus

Ức chế MMPs

Cerebrosides

hydroxypalmitoyl-1-O D-

(4E,8E)-N-D-2’- 4,8sphingadienine Ganoderma

glucopyranosyl-9-methyl-lucidum

Ức chế DNA polymerase

1-O D-glucopyranosyl-9-methyl-

(4E,8E)-N-D-2’-hydroxystearoyl-4,8sphingadienine

velupites

Điều hòa Cdc2 kinase

Catechols

hydroxy-2-pyrone (Hispidin)

6-(3,4-dihydroxystyryl)-4-P linteus, Gymnopilus marginatus, G

patriae, G

parvisporus, Ionotus hispidus

Ức chế PKC

Gerronemins A-F (9a-f) Gerronema Ức chế COX-2

Amines

2-aminophenoxazin-3-one Lepiota americana Ức chế aromatase

Putrescine-1,4-dicinnamide Pholiota spumosa

Không xác định (cảm ứng làm chết theo chu trình và hoại tử) Triacylglycerols 1-Oleoyl-2-linoleoyl-3-

Lampteromyces japonicus

Ergosterol Grifola frondosa,

Agaricus blazei

Ức chế cyclooxygenase

Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one

Grifola frondosa, Ganoderma applanatum, G

neojaponicum

Ức chế Cyclooxygenase

Lucidenic acid O Lucidenic lactone Cerevisterol Lucidumol A and B Ganoderiol F Ganodermanondiol Ganodermanontriol Ganoderic acids A, F, H, W, X,

Y, T

Ganoderma lucidum

Ức chế DNA polymerase , và

RT

Ức chế DNA polymerase

Ức chế NF-KB và AP-1

Ức chế DNA topoisomerase Polyporenic acid C

Piptoporus betulinus, Daedalea dickinsii

Ức chế DNA cytosine methyltransferase

1.2.1.2 Các chất có hoạt tính sinh học khác

Chống xơ vữa động mạch và làm giảm mỡ máu

Nhiều nấm ăn và nấm dược liệu có tác dụng phòng xơ vữa động mạch

bởi chúng chứa nhiều chất xơ và ít chất béo Các triterpene khác từ linh chi

cũng góp phần ngăn ngừa bệnh xơ vữa động mạch bằng cách ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin (enzyme gây xơ vữa mạch máu) như ganoderic acid F

(16) (Komoda và cs., 1989) [83], hay giảm sự vón tiểu cầu như ganoderic acid

S (19) (Morigiwa, 1986) [116] Các nucleotit AMP và GMP từ dịch chiết nước

của nấm linh chi có tác dụng chống kết vón tiểu cầu Ngoài ra, các chất như lenthinacin, deoxylenthinacin, 5AMP và 5GMP ở nấm hương có tác dụng chống kết vón tiểu cầu mạnh [83,116]

Ganoderic acid F (16) R1 =R 2 =R 3 =R 5 =R 6 =O, R 4=β-OH Ganoderic acid S (19) R=O, R4=H

Các bệnh về tim mạch, huyết áp thường có liên quan tới tình trạng xơ vữa động mạch, cholesterol tăng, lipo-protein tỉ trọng thấp bị oxi hóa (LDL oxidation) Vì vậy việc điều khiển và duy trì mức cholesterol về mức cho phép

là rất quan trọng nhằm phòng và chữa bệnh Các gốc tự do hoạt động (reactive oxygen species, ROS) và sự tăng lipid trong máu là yếu tố dẫn tới bệnh xơ vữa động mạch Điều chỉnh lượng mỡ máu về mức cho phép, đặc biệt là cholesterol, đóng vai trò quan trọng làm giảm sự phát triển của bệnh Một số

loài nấm thể hiện khá tốt vai trò này Nấm P ostreatus (nấm sò) tác dụng

chống xơ vữa động mạch, ức chế peroxit mỡ ở chuột và thỏ nhờ hoạt chất

lovastatin (8) (còn gọi mevinolin), là chất ức chế HMG-CoA reductase

Lovastatin còn phổ biến ở nhiều loài nấm thuộc chi nấm sò Pleurotus và cũng dược tìm thấy ở các nấm Auricularia auricularia-judae và Tremella fuciformis

Hợp chất lentinacin (9) (thường gọi là eritadenine hay lentysine) từ nấm hương

có tác dụng giảm cholesterol và các chất béo trung tính (Su, 1999) [150], hoạt chất eritadenine ảnh hưởng không những tới chuyển hóa cholesterol mà còn các phospholipid và axit béo Eritadenine ức chế chuyển hóa lipid (linoleic axit) do

nó ức chế hoạt tính enzyme  6-desaturase Năm 1995, Hobbs và các cộng sự cũng đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất phân lập từ nấm hương cũng có khả năng làm giảm cholesterol ở phụ nữ trẻ và người già hơn 60 tuổi ở Nhật Bản (Hobbs,

1995) [56] Chất grifolin (10) và neogrifolin (11) từ nấm Polyporous confluens

có tác dụng làm giảm huyết áp máu (Mizuno, 1995) [109] Ngoài ra, một vài

triterpene từ G lucidum (linh chi) như chất ganoderic acid C (14) và các dẫn

xuất là có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp cholesterol

Hoạt tính chống oxi hóa

Các nấm lớn là nguồn cung cấp phong phú các chất có hoạt tính chống oxi hóa Các chất này hoạt động dựa trên một số cơ chế như: (i) chống oxi hóa trực tiếp bằng duy trì mức độ chống oxi hóa nhằm ngăn chặn quá trình sản xuất yếu tố ROS (reactive oxygene species), (ii) tác dụng chống oxi hóa gián tiếp thông qua cảm ứng và điều khiển hệ thống enzyme chống oxi hóa của cơ thể

chủ (SOD, GPx, catalase), (iii) bao vây gốc tự do đích Hoạt tính chống oxi

hóa của nấm chủ yếu là do sự có mặt của các hợp chất phenolic Nấm hương và nấm rơm có hoạt tính chống oxi hóa và bao vây gốc tự do Nấm hương sinh chất cảm ứng tổng hợp SOD và GPx, là 2 enzyme chống oxi hóa (Cheung và

cs., 2003) [35]

P- terphenyl từ nấm Thelephora ganbajun, T aurantiotincta, Boletopsis

grisea cũng như Paxillus curtissii có hoạt tính chống oxi hóa rất mạnh Chất

betulinan A (20) từ nấm Lenzites betulinus có hoạt tính bao vây gốc tự do mạnh

hơn vitamin E 4 lần trong việc giảm peroxit mỡ (Lee, 1996) [91] Sterins A và

B từ nấm Stereum hirsutum cũng có hoạt tính này

20: betulinan A

Hoạt tính chống oxi hóa mạnh được phát hiện ở dịch chiết methanol và

chiết nước của 3 nấm ăn thông thường là nấm hương (L edodes), nấm sò (Pleurotus tuber-regium) và nấm rơm (V volvacea) Hoạt tính được đánh giá

bằng phương pháp mất mầu β-carotene, bao vây gốc tự do (DPPH) và phản ứng tan máu (Cheung, 2001, 2003) [34,35] Nấm rơm có chứa các chất chống oxi hóa điển hình như ascorbic acid, to-copherol (vitamin E), và β- carotene, và lượng đáng kể các hợp chất phenolic [109]

Hoạt tính chống tiểu đường

Bệnh tiểu đường xuất phát từ sự mất cân bằng chuyển hóa đường Theo thống kê trên thế giới có tới 250 triệu người mắc bệnh trọng, đa số là tiểu đường type 2 Nhiều phương thức điều trị hiệu quả và an toàn đối với tiểu đường type 2 chủ yếu tập trung kháng insulin ngoại vi Hợp chất

dehydrotrametenolic acid (25) tìm thấy ở nhiều nấm lỗ bao gồm Wolfiporia

cocos, Laricifomes officinalis, Laetiporus sulphureus làm giảm hiện tượng

đường cao trong máu ở bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin Ganoderan

A, B và C từ nấm linh chi (quả thể) có khả năng làm giảm lượng đường máu (Kim và cs.,1997; Smith và cs., 2002) [75,146]

25: dehydrotrametenolic acid

Hoạt tính kháng viêm

Koyama và cs (1972) thấy rằng dịch chiết ethanol từ nấm P linteus

(nấm thượng hoàng) có hoạt tính kháng viêm khớp (cảm ứng bởi collagen) và

giảm đau Các chất làm giảm đau quặn cũng có mặt trong nấm G lucidum như

ganoderic acid A (12), B (13), G (21) và H (22) Các chất này có hiệu lực giảm

đau ở động vật hơn là chất mẫu acetylsalicylic acid (Koyama, 1997) [84]

Trong một nghiên cứu khác, dịch chiết methanol của nấm P.pulmonarius

làm giảm phù nề (cảm ứng bởi carageenan và formalin) ở chuột Hoạt tính này

có thể so sánh với chất chuẩn là diclofenat (10 mg/kg) Ảnh hưởng này được cho là có liên quan tới hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết Ngoài ra, dịch

chiết cũng có hoạt tính kháng u đáng kể ở chuột Nấm ăn G.frondosa (nấm thái

dương) có chất ergosterol, ergosta-4-6-8, 22-tetraen-3-one (24) và

1-oleoyl-2-linoleoyl-3-palmitoylglycerol gây ức chế enzyme cyclooxygenase 1 và 2 (Lindequist và cs., 2005) [100]

Các chất gây viêm bản chất cytokine bị ức chế bởi các chất có trong nấm như panepoxydone (từ nấm hương) Interleukin (ILs), interferon (INF) và yếu

tố diệt khối u (TNF-α) bị ức chế bởi dịch chiết ethanol nấm Agaricus

subrufescens hoặc Agaricus blazei (Keerigan, 2005) [73]

Ganoderic acid A (12) R1 =R 3 =R 6 =O, R 2 =R 5 =β-OH, R 4 =H

Ganoderic acid B (13) R1 =R 3 =R 5 =R 6 =O, R 2 =β-OH, R 4 =H

Ganoderic acid G (21) R1 =R 2 =R 4 =β-OH, R 3 =R 5 =R 6 =O

Ganoderic acid H (22) R1 =β-OH, R 2 =R 3 =R 5 =R 6 =O, R 4 =OAc

24: ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3on

Hoạt tính bảo vệ gan

Ganoderic acid R (18) và S (19) và ganosporeric acid A (23) từ nấm linh

chi có hoạt tính bảo vệ gan in vitro trong phản ứng gây độc tế bào gan ở chuột

bằng galacosamin Ngoài ra, dịch chiết ethanol của nấm linh chi có chứa triterpenoid có khả năng bảo vệ gan khỏi bị phá hủy bởi chloroform và galactosamin Hoạt tính bảo vệ gan có thể do các hợp chất này thúc đẩy các

enzyme bao vây gốc tự do có hại cho gan, nâng khả năng chống oxi hóa (Lindequist và cs., 2005) [100]

Ganoderic acid R (18) R=α-OAc, R4 =H

Ganoderic acid S (19) R=O, R4 =H Ganosporeric acid A (23) R1 =R 2 =R 3 =R 4 =R 5 =R 6 =O

Hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh trung tâm

Các chất tương tự phenol như hericenone C (26), D, E, F, G, H từ nấm

H erinaceus (hầu thủ) gây cảm ứng tổng hợp các yếu tố phát triển dây thần

kinh, và có cải thiện bệnh alzheimer (Mizuno, 1999) [110] Chất erinacin E

(27) từ nấm dịch lên men nấm Hericium coralloides là chất kích thích có chọn

lọc lên thụ thể - opiod gây giảm đau mà không có ảnh hưởng phụ giống như chất kích thích lên thụ thể µ kiểu như morphine Một số chất có tác dụng giảm

đau khác như scutigeral (từ nấm Scutiger ovinus) có ái lực với thụ thể dopamine-1 của não; albacono tách từ Scutiger confluens kích thích lên thụ thể

Dịch chiết ethanol của nấm H marmoreus, F velutipes, Pholiota

nameko và Pleurotus eryngii có tác dụng chống dị ứng đáng kể ở chuột (dị ứng

typ IV cảm ứng bởi oxazolone) (Sano, 2002) [137] Một vài hoạt chất từ linh

chi như ganoderic acid C (14) và D (15), cyclootasulfur làm giảm sự giải phóng

histamine nhờ đó làm giảm khả năng dị ứng Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho

thấy nấm Tricholoma populinum cũng có khả năng làm giảm triệu chứng dị

ứng nặng ở bệnh nhân Buerger Tác dụng này có được nhờ các hợp chất

ergosterol peroxide (28) Chất hispolon (29) và hispidin (30) giảm sự nhân lên

của tế bào lá lách chuột [137]

Ganoderic acid C (14) R1 =R 3 =R 6 =O, R 2 =β-OH, R 4 =H, R 5 =OH

Ganoderic acid D (15) R1 =R 3 =R 5 =R 6 =O, R 2 =R 4 =β-OH 28: 5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22-dien-3β-ol

(31), ganodermanontriol (33) và ganodermanondiol (34) có hoạt tính điều hòa

họt hóa bổ thể mạnh với giá trị IC50 540 µM (Min, 2001) [107]

ganoderiol F (31): R1 =O, R 2 =H, R 3 =R 4 =OH

ganodermanontriol (33): R=OH ganodermanondiol (34): R=H

Một số triterpene từ nấm linh chi (G lucidum) như ganoderiol F (31),

ganodermanontriol (33), ganoderic acid B là chất kháng vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người type 1 (HIV-1) Ganodermadiol (34), lucidadiol (36) và

applanoxidic acid G (43) từ nấm G pfeifferi và một số nấm Ganoderma khác,

có hoạt tính kháng vi rút cúm type A Hơn nữa, ganodermadiol (34) cũng có

hoạt tính chống vi rút type 1 gây herpes (Mothana, 2003) [117]

ganodermanontriol (33): R=OH

ganodermanondiol (34): R=H

Applanoxidic acid G (43)

1.2.2 Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu

Trong số các hoạt tính y dược của polysaccharide từ nấm, hoạt tính tăng cường miễn dịch và kháng u được quan tâm nhiều hơn cả Polysaccharide có hoạt tính sinh học thường là glucan (polymer của đường glucose) với các kiểu liên kết glucoside khác nhau Một số là heteroglucan, một số gắn với protein tạo thành phức proteoglucan (bảng 1.3) [187]

Bảng 1.3 Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu [187]

β -D-glucan Bảo vệ gan, chữa ung thư vú

Ganoderma

lucidum

Quả thể, dịch nuôi cấy

Heteroglycan, mannoglucan, glycopeptide

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, chống oxi hóa

Auricularia

auricula

cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

Grifola

frondosa

galatomannan, heteroglycan, grifolan

Tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, kháng u, kháng vi rút

Inonotus

obliquus

Agaricus

blazei

protein, proteincomplex

đường huyết, kháng u, tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, chống tụ huyết

Các glucan tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm (chiếm 1545% trọng

lượng khô) Vách tế bào được cấu tạo bởi chủ yếu là β-glucan, α-mannan (polymer của mannose), chitin (polymer của N-acetyl glucoamine), 1,3 α-

glucan, galactomannanprotein, cellulose (hình 1.1) (Leung và cs., 2006) [96] Chitin tạo thành một mạng lưới sợi và không tan trong nước, kiềm Trong đó,

β-1,3 glucan (có thể phân nhánh), tạo vách tế bào, có các dạng tan khác nhau

một số tan được trong nước, kiềm (S-glucan) và không tan trong kiềm glucan) Các β-1,3 glucan, có chứa các liên kết nhánh hoặc β-1,4 hoặc β-1,6

(R-glucoside, liên kết với chitin và khoảng trống được lấp đầy bởi protein Các sợi

liên kết β-1,4 glucoside trong mạch chính cũng có thể hiện diện ở trong vách tế

bào nấm Ở vách tế bào nấm, chitin chiếm 1,47,9%, mannan (dạng manoprotein chủ yếu là mannan) chiếm 2867%, β-1,3 glucan chiếm 2846%

và β-1,6 glucan chiếm 511%, và các polymer này nối với nhau tạo thành một

đơn vị thống nhất của thành tế bào nấm (hình 1.1)

Hình 1.1: Kết nối các polymer trong vách tế bào nấm

(Leung và cs., 2006) [81]

Hoạt tính tăng cường miễn dịch, chống khối u của β-1,3 glucan

Các polysaccharide có hoạt tính tăng cường miễn dịch hay chống u có

mặt chủ yếu ở vách tế bào nấm, trong đó β- 1,3/1,6-D glucan và α-1,3 mannan

(liên kết với protein) là hai chất có hoạt tính chính Chitin và cellulose không

có hoạt tính này β-1,3-glucan là polymer gồm các đơn phân tử là glucose nối với nhau bằng liền kết β-glucoside trong mạch chính tại vị trí C-1 và C-3 Ở đa

số nấm, polymer này còn có các liên kết mạch nhánh β- 1,6 glucoside Ở nấm

lớn, mạch nhánh thường ngắn (1 đơn vị glucose) Giữa các nấm cũng có sự

khác biệt về cấu trúc β-1,3-glucan Ngoài ra, các β-1,3 glucan có nguồn gốc

khác nhau sẽ khác nhau ở mức độ polymer hóa (hay trọng lượng phân tử), độ phân nhánh (degree of branching, DB) Hoạt tính tăng cường miễn dịch sẽ phụ thuộc vào mức độ phức tạp về cấu trúc hóa học và lý học của mỗi glucan

Ngoài nấm, β-1,3 glucan cũng được phát hiện ở vi khuẩn, tảo nâu, với mức

phân nhánh kém (tảo nâu) hoặc không phân nhánh (vi khuẩn) Cấu trúc của một

β-1,3 glucan điển hình với phân nhánh β-1,6 glucoside được trình bày tại hình

1.2

Hình 1.2 cấu trúc hóa học của β-1,3/1,6 glucan điển hình

Các β-1,3/1,6 glucan với hoạt tính tăng cường miễn dịch tốt, được nghiên cứu kỹ, là từ các nấm L edodes (nấm hương), Grifola frondosa (maitake),

Schizophillum commune và Scleroninia sclerotiorum

Mối liên quan giữa cấu trúc β-glucan và hoạt tính chống u

Các β-glucan có hoạt tính chống u có sự khác nhau về thành phần hóa

học, mức độ phân nhánh, cấu trúc không gian và các đặc tính vật lý khác Hoạt tính chống u được thấy ở các glucan từ dạng homoglucan tới dạng phức hợp heteroglucan Mặc dù rất khó có thể đưa ra mối liên quan cấu trúc và hoạt tính

của các glucan phức tạp, tuy nhiên vẫn có mối liên quan chung giữa cấu trúc và

hoạt tính Các cấu trúc với liên kết β-1,3 glucan trong mạch chính và có nhánh

bên liên kết qua cầu nối là β-1,6 glucoside là cần thiết để các glucan này có hoạt tính tốt Trong khi đó, β-1,6-glucan thì hoạt tính yếu hơn hẳn (Yanaki.,

1985; Pang và cs., 2005) [175,126]

Ảnh hưởng của trọng lượng phân tử

Khi xử lý nhiệt β-1,3 glucan từ nấm G frondosa ở 150oC với thời gian

khác nhau, Sakaki (1976) [135] thu được các β- glucan có trọng lượng phân tử

khác nhau Thử nghiệm hoạt tính kháng u dẫn đến kết luận phân đoạn có trọng lượng cao nhất (800 kDa) luôn luôn có hoạt tính chống u, tăng cường miễn dịch tốt nhất PSK (polysaccharide K: polysaccharides 30%, nitơ 6%, protein 15%)

từ nấm vân chi được lọc và chia 4 phân đoạn: 50 kDa, 50100 kDa, 100200 kDa và >200 kDa Hoạt tính kháng u và tăng miễn dịch tốt nhất ở phân đoạn có

Mw >200 kDa Sakaki (1976) xử lý lentinan (β-1,3/1,6 glucan từ nấm hương,

Mw >1.000 kDa) bằng axit formic thành 7 phân đoạn với Mw 2,870110 kDa Hoạt tính kháng u của các phân đoạn có Mw <16 kDa giảm rõ rệt, trong khi các phân có Mw lớn vẫn giữ nguyên hoạt tính như đầu (Sasaki và cs., 1976) [135] Nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng, trọng lượng phân tử cao (>100 kDa) là cần

thiết để β-glucan có hoạt tính tốt nhất (Yanaki, 1983) [175] Tuy nhiên, một số oligo β-1,3 glucan có hoạt tính tốt hơn hẳn so với các β-1,3 glucan mạch dài

(Miyanishi và cs., 2003; Pang và cs., 2005) [108,126]

Ảnh hưởng của độ phân nhánh

Ở nấm, các β-glucan có độ phân nhánh khác nhau, dọc theo mạch chính Lentinan (DB 2/5), β-1,3/1,6 glucan với 2 phân nhánh cho mỗi 5 đơn vị glucose mạch chính; schizophyllan (DB 1/3) là β-1,3/1,6 glucan với mỗi phân nhánh

cho mỗi 3 đơn vị glucose mạch chính Mối liên hệ giữa độ phân nhánh và hoạt

tính của β-glucan là rất phức tạp β-1,3-glucan mạch chính là cần thiết và hoạt

tính tốt nhất khi có mức độ phân nhánh (DB) khoảng từ 0,20,4 (Zang và cs., 2007) [184]

Ảnh hưởng của cấu trúc tới hoạt tính

Cấu trúc của β-glucan gồm các dạng xoắn đơn (single helix), xoắn ba

(triple helix) và vô định hình (random coil) Cấu trúc xoắn ba thường bền vững hơn xoắn đơn bởi luôn có xu hướng xoắn đơn chuyển thành dạng xoắn ba Các

phân tử β-glucan được nghiên cứu nhiều như lentinan, schizophyllan và PSK đều ở dạng xoắn ba Các dạng cấu trúc của β-glucan có thể chuyển đổi lẫn nhau

bởi các yếu tố như nhiệt độ, hóa chất v.v… (hình 1.3) (Adachivà cs., 1999) [14]

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc của βglucan và sự chuyển đổi giữa chúng

Cấu trúc dạng xoắn cũng ảnh hưởng tới hoạt tính của polysaccharide Yanaki (1983) đã phát hiện ra schizophyllan khi ở trạng thái xoắn ba (tương ứng với Mw > 9104 Da) thì hoạt tính tốt nhất Cấu trúc xoắn đơn làm giảm hoạt tính và mất hoàn toàn khi không còn trạng thái xoắn (Mw < 5103 Da) (Yanaki, 1983) [175]

Một số sản phẩm β-glucan tiêu biểu có hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng u

Lentinan từ quả thể nấm hương (L edodes) có hoạt tính kháng u và tăng

cường miễn dịch rất tốt Cấu trúc cơ bản của lentinan gồm mạch chính β-1,3

Trung hòa Nhiệt độ

Xoắn đơn

Vô định hình

glucan trong đó cứ 5 liên kết β- 1,3 glucoside mạch chính có 2 liên kết nhánh β-

1,6 glucoside, tạo nên cấu trúc xoắn ba (độ phân nhánh 0,4) (hình 1.4) (Bisen

và cs., 2010) [20] Lentinan thương mại có trọng lượng phân tử khoảng

400800103 Da [186] Khả năng kéo dài đời sống bệnh nhân ung thư của Lentinan đã được chứng minh, đặc biệt đối với ung thư dạ dày, ung thư đường ruột Ngoài ra, lentinan có tác dụng thúc đẩy hoạt động của các enzyme chống oxi hóa Lentinan cũng có tác dụng tăng cường miễn dịch ở bệnh nhân AIDS (Sobieralski, 2012) [148] Hiện nay, lentinan đã được thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc và Nhật bản (Zhou và cs., 2009) [186]

Hình 1.4 Cấu trúc của lentinan

Liên kết β1,3 glucoside ở mạch chính và β 1,6 glucoside tại mạch nhánh Cứ mỗi 5 đơn vị

glucose mạch chính, sẽ có 2 liên kết nhánh

Schizophyllan (SPG) là polysaccharide chính từ nấm S commune

Glucan này có gồm mạch chính chứa liên kết β-1,3 glucoside và mạch nhánh liên kết β-1,6 glucoside theo tỉ lệ cứ 3 đơn vị glucose mạch chính thì có 1 đơn

vị glucose mạch nhánh (độ phân nhánh 0,33) (hình 1.5) SPG có cấu trúc xoắn

ba, với MW nguyên thủy là 6106 và có độ nhớt cao Do có khối lượng phân tử cao, khả năng tan của SPG kém dần dẫn đến khả năng ứng dụng trong điều trị

bị hạn chế Để khắc phục nhược điểm này, SPG được cắt nhỏ bằng siêu âm tới trọng lượng khoảng 450103 SPG được dùng điều trị ung thư đường sinh dục,