phẩm HG1
Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng trọng lượng 20,0 2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu. Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.
Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm của HG1
71
Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu: Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuột được gây mê bằng diethyl ether, nhanh chóng mổ ngực của chúng và lấy máu bằng cách chọc nóng trong dung dịch đệm PBS 10 mM pH 7,4 lạnh (4C) - không dùng thuốc chống đông máu. Hồng cầu được rửa 3 lần với PBS, dùng ít nhất 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1500 v/p. Nồng độ hồng cầu đạt mức OD 1,0 ở 700 nm ở những mẫu chưa cho tan huyết.
Với thử nghiệm tan huyết, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm được pha với 90 µL dung dịch hồng cầu 5% trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). OD được theo dõi liên tục ở 700 nm (Specord UV-VIS).
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich (EAC)
Dòng tế bào 4N Ehrlich được sử dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào ung thư EAC được nuôi cấy trong ổ bụng của chuột bằng phương pháp tiêm vào khoang cơ thể chúng. Dòng chuột CD1 được sử dụng trong thí nghiệm này. Tế bào được thu lại sau 7 ngày nuôi cấy. Chuột được gây mê với diethyl ether và nhanh chóng mổ ổ bụng để lấy các tế bào ung thư (bằng xi lanh). Các tế bào được rửa 3 lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng ít nhất 10 thể tích lần dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1000 rpm; sau đó tạo lại dung dịch tế bào với saline buffer (nồng độ 2106 tế bào/mL).
Với thử nghiệm gây độc tế bào, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm trong DMSO được pha với 90 µL dung dịch tế bào trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). Tổng tế bào và số tế bào sống được đếm qua kính hiển vi với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,17%.
Hoạt tính gây độc tế bào được tính theo công thức sau: Inhibition (%) =A/Ao 100, với Ao là tổng số tế bào khi chưa có mẫu và A là số tế bào nhuộm màu (tức tế bào chết) có bổ sung mẫu.
Đánh giá hoạt tính chống u in vivo đối với tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)
72
Chuột đực của dòng CD1 từ 68 tuần tuổi với cân nặng 20 g được sử dụng. 40 động vật thử nghiệm được dùng trong thí nghiệm này. Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm.
Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồng độ 2106 tế bào/mL. Cho chuột dùng chế phẩm HG1 bắt đầu 1 ngày sau khi cấy khối u. Hỗn hợp pha trong 1% DMSO và dầu olive với các liều 100, 10 và 1 g/kg được thêm vào mỗi chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều). Nhóm đối chứng chỉ có 1% DMSO và dầu olive. Chỉ số tăng tuổi thọ (ILS, %) được tính theo công thức sau: ILS = (T/C) 100%, với T và C lần lượt là tuổi thọ trung bình (ngày) của chuột nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng.
Đánh giá hoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)bằng MRI
Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sử dụng. Tế bào Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồng độ 5106 tế bào/mL. Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm 1 ngày sau khi cấy khối u. Tác dụng chống di căn được ước tính khi sự phát triển của khối u bị kiềm hãm (so sánh với đối chứng), bắt đầu từ ngày thứ 7 sau khi thấy xuất hiện khối u.
Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng cơ thể).
Khả năng chống u được tính bằng chỉ số kìm hãm khối u hoàn chỉnh (TGS, %), so sánh với đối chứng. Thể tích khối u (Vt) được tính theo công thức: Vt (mm3) = (a x b) x 1/2, với a và b lần lượt là đường kính lớn nhất và nhỏ nhất của khối u.Với những khối u ổ bụng, tác dụng chống u được tính bằng chỉ số tăng tuổi thọ (ILS, %), so sánh với đối chứng theo công thức: ILS = (T/C) x 100%, với T và C lần lượt là tuổi thọ trung bình (ngày) của chuột nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng.
73
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương